選修一導(dǎo)學(xué)案

1、專題 5 DNA 和蛋白質(zhì)技術(shù)課題一 DNA的粗提取與鑒定（1）編寫人：葉凡審題人：趙捍華學(xué)習(xí)目標(biāo)1. 嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取2. 了解 DNA的物理化學(xué)性質(zhì)3. 理解 DNA粗提取以及 DNA鑒定的原理學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)DNA的粗提取和鑒定方法自主學(xué)習(xí)一基礎(chǔ)知識(shí)1提取 DNA的方法提取生物大分子的基本思路是。對(duì)于 DNA的粗提取而言， 就是要利用DNA與、和等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。1）DNA的溶解性DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的中溶解度不同， 利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。課本圖 5

2、1 是 DNA在 NaCl 溶液中的溶解度曲線，請(qǐng)根據(jù)曲線圖，【思考】 在什么濃度下，DNA的溶解度最??？DNA在 NaCl 溶液中的溶解度是如何變化的？如何通過控制NaCl 溶液的濃度使DNA在鹽溶液中溶解或析出？此外， DNA不溶于溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。2）DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性蛋白酶能水解，但是對(duì)沒有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60 80oC 的高溫，而DNA在以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解，但對(duì) DNA沒有影響。3） DNA的鑒定在條件下， DNA遇會(huì)被染成色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1）實(shí)驗(yàn)

3、材料的選取凡是含有的生物材料都可以考慮，但是選用的生物組織，成功的可能性更大。在下面的生物材料中選取適合的實(shí)驗(yàn)材料：魚卵、豬肝、菜花（花椰菜）、香蕉、雞血、哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、獼猴桃、洋蔥、豌豆、1菠菜、在液體培養(yǎng)基的大腸桿菌【思考】哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞的特點(diǎn)？2）破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的，同時(shí)用攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的和，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液?！舅伎肌繛槭裁醇尤胝麴s水能使雞血細(xì)胞破裂？加入洗滌劑和食鹽的作用分別是什么

4、？如果研磨不充分，會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響?此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？3）去除濾液中的雜質(zhì)閱讀課本的三個(gè)方案，【思考】為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？方案二與方案三的原理有什么不同？4）DNA的析出與鑒定將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積、冷卻的，靜置，溶液中會(huì)出現(xiàn)，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。取兩支 20ml 的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為的 NaCl 溶液 5ml ，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml 的?；旌暇鶆蚝?，將試管置于中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管

5、溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變。3操作提示以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml 血液中需要加入3g，防止。加入洗滌劑后，動(dòng)作要、，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要，以免，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。二苯胺試劑要，否則會(huì)影響鑒定的效果。2課題一DNA 的粗提取與鑒定（2）編寫人：葉凡審題人：趙捍華學(xué)習(xí)目標(biāo)1. 嘗試對(duì)植物或動(dòng)物組織中的DNA進(jìn)行粗提取2. 了解 DNA的物理化學(xué)性質(zhì)3. 理解 DNA粗提取以及 DNA鑒定的原理學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)DNA的粗提取和鑒定方法 疑難點(diǎn)撥 1 DNA的溶解度與NaCl 溶液濃度的關(guān)系：當(dāng) NaCl 溶

6、液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低；當(dāng)NaCl 溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。2 制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入檸檬酸鈉的原因制備雞血細(xì)胞液時(shí)，要在新鮮的雞血中加入抗凝劑檸檬酸鈉，防止血液凝固。 其原理是檸檬酸鈉能與血漿中Ca2+發(fā)生反應(yīng)，生成檸檬酸鈣絡(luò)合物，血漿中游離的Ca2+大大減少，血液便不會(huì)凝固，因?yàn)殡u血紅細(xì)胞，白細(xì)胞都有細(xì)胞核，DNA主要存在于細(xì)胞核中，所以在離心或靜置沉淀后，要棄出上層清液血漿。3提取 DNA的第一步是材料的選取，其目的是一定要選取DNA含量較高的生物材料，否則會(huì)由于實(shí)驗(yàn)過程中或多或少的損失而

7、造成檢測(cè)的困難；第二步是 DNA的釋放和溶解， 這一步是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵，要盡可能使細(xì)胞內(nèi)的DNA全部溶解； 第三步是DNA的純化， 即根據(jù)DNA的溶解特性、對(duì)酶及高溫的耐受性的不同等特性，最大限度地將DNA與雜質(zhì)分開；最后一步是對(duì)DNA進(jìn)行鑒定，這是對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的檢測(cè)。4在 DNA的析出的步驟中用到玻璃棒攪拌時(shí)，注意動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致 DNA分子不能形成絮狀沉淀。5盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附， 由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。 因此，實(shí)驗(yàn)過程中最好

8、使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。 典例解析 本實(shí)驗(yàn)中有三次過濾：過濾用蒸餾水稀釋過的雞血細(xì)胞液過濾含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液過濾溶解有DNA的 2mol/LNaCl 溶液以上三次過濾分別為了獲得（）3A 含核物質(zhì)的濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液B 含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、含DNA的濾液C含核物質(zhì)的濾液、濾液中DNA粘稠物、紗布上的DNAD含較純的DNA濾液、紗布上的粘稠物、含DNA的濾液答案： A解析 : 用蒸餾水稀釋雞血細(xì)胞液，使血細(xì)胞的細(xì)胞膜、核膜破裂，釋放出核物質(zhì)，此時(shí)過濾只能得到含DNA 和其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)的濾液，這種濾液必須經(jīng)

9、過實(shí)驗(yàn)中其他步驟得相繼處理，方能得到較純的DNA。 DNA在 0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低，成絲狀粘稠物，可經(jīng)過濾留在紗布上。隨堂練習(xí)1. 在研究 DNA的基因樣本前， 采集來的血樣需要蛋白水解酶處理， 然后用有機(jī)溶劑除去蛋白質(zhì)。用蛋白水解酶處理血樣的目的是（）A. 除去血漿中的蛋白質(zhì)B.除去染色體上的蛋白質(zhì)C.除去血細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)D.除去血細(xì)胞中的所有的蛋白質(zhì)，使DNA釋放，便于進(jìn)一步提純2與析出 DNA粘稠物有關(guān)的敘述，不正確的是（）A. 操作時(shí)緩緩滴加蒸餾水，降低DNA的溶解度B. 在操作 A 時(shí)，用玻璃棒輕緩攪拌，以保證DNA分子完整C.加蒸餾水可同時(shí)降低DNA和蛋白質(zhì)

10、的溶解度，兩者均可析出D.當(dāng)絲狀粘稠物不再增加時(shí)，此時(shí)NaCl 的濃度相當(dāng)于0.14mol/L3洗滌劑能夠瓦解（），但對(duì) DNA沒有影響。A. 細(xì)胞壁B. 細(xì)胞膜C.細(xì)胞核D.細(xì)胞質(zhì)4在沸水浴的條件下，DNA遇（）會(huì)被染成藍(lán)色。A. 斐林試劑B.蘇丹染液C.雙縮脲試劑D.二苯胺5在 DNA提取過程中，最好使用塑料試管和燒杯，目的是（）A. 不易破碎B.減少提取過程中DNA的損失 C. 增加 DNA的含量 D.容易洗刷6下列操作中，對(duì)DNA的提取量影響最小的是（）A. 使雞血細(xì)胞在蒸餾水中充分破裂，放出DNA等核物質(zhì)B. 攪拌時(shí)，要使用玻璃棒沿一個(gè)方向輕緩攪拌C.在“析出DNA粘稠物”時(shí)，要緩緩

11、加蒸餾水，直至溶液中粘稠物不再增加D.在用酒精沉淀DNA時(shí)，要使用冷酒精，甚至再將混合液放入冰箱中冷卻E 在 DNA的溶解和再溶解時(shí)，要充分?jǐn)嚢? DNA的粗提取中，將與濾液體積相等的、冷卻的（），靜置 2 3min ，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物。A.0 9%的 NaClB.0.14mol/L的 NaCl 溶液C. 質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的 HCl D. 體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液48. 以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，需要向血液中加入（），防止血液凝固。A. 醋酸鈉B.龍膽紫C.檸檬酸鈉D.醋酸洋紅9. 在向溶解DNA的 NaCl 溶液中，不斷加入蒸餾水的目的是（）A. 加快溶解DNA的速度B.加快溶解雜質(zhì)的速度C

12、.減少 DNA的溶解度，加快DNA析出D.減小雜質(zhì)的溶解度，加快雜質(zhì)的析出10. 去除濾液中的雜質(zhì)時(shí)，直接在濾液中加入嫩肉粉，利用嫩肉粉中的（）分解蛋白質(zhì)。A. 胃蛋白酶B.胰蛋白酶C.木瓜蛋白酶D.腸肽酶二、非選擇題（3 個(gè)）1提取雞血中DNA時(shí)，要除去血液中的上清液，這是因?yàn)槭裁矗?填寫本實(shí)驗(yàn)完成下列實(shí)驗(yàn)操作時(shí)所用試劑。提取雞血細(xì)胞中核物質(zhì)溶解核內(nèi)DNA：析出 2mol/LNaCl 溶液中的DNADNA粘稠物的再溶解提取雜質(zhì)較少的DNA白色乳狀絲狀物DNA的鑒定3. 關(guān)于 DNA粗提取的實(shí)驗(yàn)材料的選擇， 也經(jīng)過了多次實(shí)驗(yàn)效果的比較， 最終選擇雞血做實(shí)驗(yàn)材料的原因是什么？請(qǐng)回答下列問題：雞血

13、細(xì)胞中紅細(xì)胞，家雞屬于鳥類， 新陳代謝旺盛， 因而血液中細(xì)胞數(shù)目較多，可以提供豐富的。實(shí)驗(yàn)前由老師制備血細(xì)胞液供同學(xué)們做實(shí)驗(yàn)材料，而不用雞全血，主要原因是。生活在牧區(qū)的人們，采集牛、羊和馬血比較方便， 若他們按實(shí)驗(yàn)要求完成實(shí)驗(yàn)步驟后，結(jié)果是，這是因?yàn)檫@些動(dòng)物和人一樣，成熟的紅細(xì)胞中，但若改用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行。 這是因?yàn)?。若選用動(dòng)物肝臟做實(shí)驗(yàn)材料，在提取之前，最好增加程序，使組織細(xì)胞更易分離。5課題二多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 （1）編寫人：葉凡審題人：趙捍華學(xué)習(xí)目標(biāo)1. 了解 PCR技術(shù)的基本操作2. 理解 PCR的原理3. 討論 PCR的應(yīng)用學(xué)習(xí)重點(diǎn)難點(diǎn)PCR的原理和PC

14、R的基本操作自主學(xué)習(xí)一基礎(chǔ)知識(shí)1 PCR原理填寫下列表格參與的組分在 DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈合成子鏈的原料DNA聚合酶引物DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常將DNA的羥基末端稱為，而磷酸基團(tuán)的末端稱為。 DNA 聚合酶不能開始合成DNA，而只能，因此， DNA復(fù)制需要引物。DNA的合成方向總是。在 DNA的復(fù)制過程中， 復(fù)制的前提是。在體外可通過控制來實(shí)現(xiàn)。在的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為。PCR利用了 DNA的原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合。由于PCR過程的溫度高，導(dǎo)致DNA聚合酶失活，后來的 DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，大大增加了PCR的效

15、率。PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中提供：，同時(shí)通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。2 PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷循環(huán)，每次循環(huán)可以分為、和三步。從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)，并且由延伸而成的 DNA單鏈會(huì)與結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。3實(shí)驗(yàn)操作6在實(shí)驗(yàn)室中，做PCR通常使用，它是一種薄壁塑料管。具體操作時(shí)，用微量移液器，按PCR反應(yīng)體系的配方在中依次加入各組分， ，再參照下表的設(shè)置設(shè)計(jì)好 PCR儀的循環(huán)程序即可。4操作提示為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的、以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行。 PC

16、R所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，移液管上的槍頭要。課題二多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段 （2）編寫人：葉凡審題人：趙捍華學(xué)習(xí)目標(biāo)1. 了解 PCR技術(shù)的基本操作2. 理解 PCR的原理3. 討論 PCR的應(yīng)用學(xué)習(xí)重點(diǎn)難點(diǎn)PCR的原理和PCR的基本操作 疑難點(diǎn)撥 1.PCR 技術(shù)簡(jiǎn)介PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問題，被廣泛的應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物

17、學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等各方面。2細(xì)胞內(nèi)參與DNA復(fù)制的各種組成成分及其作用解旋酶： 打開 DNA雙鏈 DNA母鏈：提供 DNA復(fù)制的模板 4 種脫氧核苷酸： 合成子鏈的原料 DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈引物：使DNA聚合酶能夠從引物的3， 端開始連接脫氧核苷酸 （引物是一小段DNA或 RNA，它能與 DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。用于 PCR的引物長(zhǎng)度通常為20 30 個(gè)核苷酸）3 DNA的合成方向7DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，通常?DNA的羥基末端稱為3，端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5， 端。 DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3， 端延伸 DNA鏈，因此， DNA復(fù)

18、制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3， 端開始延伸DNA鏈， DNA的合成方向總是從子鏈的5， 端向 3，端延伸。4 PCR的反應(yīng)過程PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為變性（當(dāng)溫度上升到90oC以上時(shí)， 雙o鏈 DNA解聚為單鏈）、復(fù)性（溫度下降到 50 C 左右，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合）和延伸（溫度上升到 72oC 左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在 DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的 DNA鏈）三步。從第二輪循環(huán)開始， 上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應(yīng)， 并且由引物延伸而成的 DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合

19、， 進(jìn)行 DNA的延伸， 這樣， DNA聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的 DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列成指數(shù)擴(kuò)增。5 PCR技術(shù)與 DNA的復(fù)制PCR反應(yīng)是通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制，所以有關(guān) PCR反應(yīng)的題目與 DNA復(fù)制的原理相同，計(jì)算方法也大體相同。例如： PCR反應(yīng)中的目的片段一般以 2n 的方式積累，其中 n 為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè) DNA片段在 30 次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有 10 億個(gè)這樣的片段。 （ 230 ）鞏固提高一選擇題1 DNA分子復(fù)制時(shí)，解旋的兩條鏈中（）A 僅一條作為復(fù)制模板B 兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)不同的DNA

20、分子C兩條鏈作為模板并復(fù)制出兩個(gè)相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結(jié)合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結(jié)合成一個(gè)全新的DNA分子2. 下列關(guān)于DNA復(fù)制過程的正確順序是（）互補(bǔ)堿基對(duì)之間氫鍵斷裂互補(bǔ)堿基對(duì)之間形成氫鍵DNA 分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結(jié)構(gòu)AB C D 3. 下列各項(xiàng)過程中，遵循“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”的有（）DNA復(fù)制 RNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄AB CD4. 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬生物體 DNA的復(fù)制必需的一組條件是（）酶游離的脫氧核苷酸ATP DNA分子 mRNA tRNA適宜的溫度適宜的酸堿度8ABC

21、D5. 利用 PCR技術(shù)，把一個(gè)雙鏈DNA分子當(dāng)作第一代，經(jīng)過3 次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長(zhǎng)鏈？（）A2B4C8D16，6. 關(guān)于 DNA分子的敘述中，正確的是（）A .DNA 的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，同向平行B.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性相同，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的D.DNA的兩條鏈?zhǔn)菢O性不同，同向平行7. 假設(shè) PCR反應(yīng)中，只有一個(gè) DNA的片段作為模板，請(qǐng)計(jì)算在30 次循環(huán)后，反應(yīng)物中大約有多少這樣的DNA片段（）A215B 230C 260D 2318.DNA 的合成方向總是（）延伸。A 從 DNA分子的左端向右端B從 DNA分子的右端向

22、左端C從子鏈的 5，端向 3，端D從子鏈的 3， 端向 5， 端9. 要使 PCR反應(yīng)在體外的條件下順利地進(jìn)行，需要嚴(yán)格的控制（）A 氧氣的濃度B酸堿度C溫度D 大氣的濕度10.DNA 分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應(yīng)與（）A 模板母鏈相同B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同D 兩條模板母鏈都不相同二非選擇題1 PCR技術(shù)是把某一DNA片段在實(shí)驗(yàn)條件下，合成許許多多相同片段的一種方法，利用這種技術(shù)能快速而特異的擴(kuò)增任何要求的目的基因或者DNA分子片段，“人類基因組計(jì)劃”的研究中常用到這種技術(shù)。請(qǐng)結(jié)合有關(guān)知識(shí)，回答有關(guān)此技術(shù)的一些問題：PCR技術(shù)能把某一DNA片段

23、進(jìn)行擴(kuò)增，依據(jù)的原理是：在實(shí)驗(yàn)條件下， DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，除了所要擴(kuò)增的DNA片段處，還需要、和、等條件。某 DNA片段有160 個(gè)堿基， 其中有腺嘌呤35 個(gè)，若讓該 DNA分子擴(kuò)增三次 （即復(fù)制三次）至少需要腺嘌呤脫氧核苷酸和鳥嘌呤脫氧核苷酸的數(shù)目分別是和個(gè)。2將大腸桿菌置于含15N 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這樣，后代大腸桿菌細(xì)胞中的DNA雙鏈均被 15N標(biāo)記。然后將被15N 標(biāo)記的大腸桿菌作為親代轉(zhuǎn)到普通培養(yǎng)基中，繁殖兩代。 親代、第一代、第二代大腸桿菌DNA的狀況如圖所示。第一代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息與親代大腸桿菌DNA貯存的遺傳信息完全相同的原因是。如果將第二代大腸桿菌的DNA分子總

24、量作為整體 1，其中，帶有 15N的第二代大腸桿菌DNA分子約占總量的%。如果將第二代大腸桿菌的DNA含量作為整體 1，其中含 15N 標(biāo)記的第二代大腸桿菌的DNA含量（脫氧核苷酸單鏈）約占總量的%9課題 3血紅蛋白的提取和分離（1）編寫人：葉凡審題人：趙捍華【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、 電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法。課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。一、基礎(chǔ)知識(shí)：凝膠色譜法（分配色譜法

25、）：1、概念：根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來分離蛋白質(zhì)的有效方法。2、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)，相對(duì)的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程，移動(dòng)速度，而的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在移動(dòng)，路程，移動(dòng)速度，相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。3、具體過程：（1）（2）（3）（ 4）（5）相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)凝膠顆粒相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)多孔板ABA.的蛋白質(zhì)由于作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留；的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面，在了里之間迅速通過。B. （ 1）混合物上柱；（2）洗脫開始，的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)；10的蛋白質(zhì)被排阻于凝膠顆粒之外；（ 3

26、）的蛋白質(zhì)被滯留；的蛋白質(zhì)被向下移動(dòng)。（ 4）不同的蛋白質(zhì)分子完全分開；（ 5）的蛋白質(zhì)行程較短， 已從中洗脫出來，的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。緩沖溶液：1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。2、作用：能夠抵制的對(duì)溶液的的影響，維持 PH基本不變。3、緩沖溶液的配制通 常 由種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的就可以制得使用的緩沖液。思考：說出人體血液中緩沖對(duì)？思考：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)

27、構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）電泳：1、概念：指發(fā)生遷移的過程。2、原理：許多重要的生物大分子，如等都具有在下，這些基團(tuán)會(huì)帶上。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子以及分子本身、的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3、分類：帶電性質(zhì)、分子大小和形加入待分離電泳狀的不同，使分子遷移速的樣品電泳。陰陽極極測(cè)定（ 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量）通常用十二烷基硫酸鈉（ SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳溶液蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的槽瓊脂多少以及分子的大小等因素。分子向陽極移動(dòng)緩沖液膠為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可

28、以在凝膠中加凝膠電泳原理示意圖11入。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體在SDS的作用下會(huì)解聚成單條肽鏈，因此測(cè)定的結(jié)果只是。 SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物， SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于。課題 3血紅蛋白的提取和分離（2）編寫人：葉凡審題人：趙捍華【課題目標(biāo)】本課題通過嘗試對(duì)血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗(yàn)從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、 電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學(xué)習(xí)運(yùn)用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)?！菊n題重點(diǎn)與難點(diǎn)】課題重點(diǎn)：凝膠色

29、譜法的原理和方法。課題難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。二 實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理粗分離純化純度鑒定1. 樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌目的：去除方法：離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的，將下層的紅細(xì)胞液體倒入再加入用的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9 的氯化鈉溶液洗滌低速離心（低速短時(shí)間）12重復(fù) 4、5 步驟次，直至上清液中已沒有，表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。(2) 血紅蛋白的釋放加到體積，再加40體積 的溶解細(xì)胞膜），置于上充分?jǐn)嚢?0 分鐘（加速細(xì)胞破裂） ,細(xì)胞

30、破裂釋放出血紅蛋白.(3) 分離血紅蛋白溶液： 將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)， 以 2000r/min 的速度離心 10 min ，試管中的溶液分為 4 層 :第1層（最上層）：甲苯層第2層（中上層）：的沉淀層，色薄層固體第3層（中下層）：的水溶液層，的液體第4層（最下層）：其它雜質(zhì)的沉淀層(4) 透析2. 凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作取長(zhǎng)40 厘米，內(nèi)徑 1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的，在 0.5ml的頭部切下長(zhǎng)的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超

31、過橡皮塞的凹穴底面。c. 剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在上，用的尼龍紗將橡皮塞包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做，連接一細(xì)的，并用螺旋夾控制尼龍管的，另一端放入收集的收集器內(nèi)頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。2）凝膠色譜柱填料的處理（1）凝膠的選擇：。（2）方法：配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸 泡于中 充分 溶脹后，配成。（3）凝膠色譜柱的裝填方法13固定：將色譜柱處置固定在支架上裝填：將一次性的緩慢倒入內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在高的操作壓下，用300ml 的

32、20mmol/l 的磷酸緩沖液（ pH 為 7.0 ）充分12小時(shí)。3）樣品加入與洗脫（ 1 ）加樣前：打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩慢下降到與平齊，關(guān)閉出口（2）加透析樣品調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用將 1ml的樣品加到色譜柱的樣品滲入凝膠床：洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每收集一試管連續(xù)收集思考：與其它真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點(diǎn)？這一特點(diǎn)對(duì)你進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義？血紅蛋白是有色蛋白， 因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。思考：你能描述血紅蛋白分離的完整過程嗎？血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、 粗分離、 純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（）；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量