定量產(chǎn)色基質(zhì)鱟試劑檢查藥品注射劑內(nèi)毒素的研究(之一)

1、    定量產(chǎn)色基質(zhì)鱟試劑檢查藥品 注射劑內(nèi)毒素的研究(之一)        目前國(guó)內(nèi)主要用凝膠試管法鱟試劑檢查藥品注射劑的內(nèi)毒素，屬于半定量的限量試驗(yàn)，不易判斷內(nèi)毒素稀釋濃度的準(zhǔn)確量值。我國(guó)2000年版藥典將擴(kuò)大增加應(yīng)用品種，首先需要對(duì)該品種進(jìn)行內(nèi)毒素限值（L）與干擾試驗(yàn)等。我們應(yīng)用定量產(chǎn)色基質(zhì)鱟試劑檢查藥品注射劑內(nèi)毒素量值，采用內(nèi)毒素各個(gè)稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量研究，現(xiàn)將研究結(jié)果介紹如下。 1反應(yīng)原理鱟血中的多功能白色變形細(xì)胞內(nèi)含有能被細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶原

2、、凝固蛋白原與C因子，B因子等。當(dāng)細(xì)菌內(nèi)毒素先激活C因子，活化C因子再激活B因子，活化的B因子激活凝固酶原成活化凝固酶水解凝固蛋白原使其形成凝固蛋白，產(chǎn)生凝膠1。依據(jù)此酶分子生化反應(yīng)的機(jī)理，用人工合成產(chǎn)色基質(zhì)鱟三肽（Boc-leu-Gly-Arg-PNA）作為凝固酶反應(yīng)底物，利用鱟試劑中被細(xì)菌內(nèi)毒素激活的凝固酶水解鱟三肽中的Arg-PNA之間的結(jié)合鍵，使其游離出PNA(對(duì)硝基苯胺呈淡黃色23。進(jìn)一步用偶氮試劑使其偶氮化，形成偶氮蘭復(fù)合物，呈玫瑰色，于波長(zhǎng)545 nm比色讀數(shù)，其產(chǎn)色深淺與內(nèi)毒素濃度呈線性關(guān)系，從而準(zhǔn)確地測(cè)定出檢品中的內(nèi)毒素含量4。2實(shí)驗(yàn)材料2.1主要器材723型可見分光光度計(jì)(

3、上海分析儀器總廠)光度正確度0.5，石英比色杯光通徑1.0 cm，旋渦混合器，恒溫水浴箱，定量可調(diào)移液器50 l、100 l、500 l、10×75 mm試管。2.2主要試劑定量鱟試劑盒(福州東方鱟試劑廠)批號(hào)990701，細(xì)菌內(nèi)毒素工作品(福州東方鱟試劑廠)批號(hào)990701；150 EU支，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水規(guī)格2 ml支(福州東方鱟試劑廠)批號(hào)990701供試品等。3實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果3.1檢測(cè)步驟0.05 ml定量鱟試劑0.1 ml內(nèi)毒素工作品稀釋液供試品液，于37 30 min后加入0.05 ml鱟三肽再于37 3 min，用0.05 ml NaNO2HCl混勻后加0.5 ml氨

4、基磺酸銨混勻后，再加0.5 ml萘乙二胺于波長(zhǎng)545 nm比色讀數(shù)。3.2使用器材的予處理凡在本檢查過(guò)程中與鱟試劑液接觸的物件、試劑等未被NaNO2HCl終止反應(yīng)前均需去除熱原。玻璃器材，清洗干凈后置于250干熱4 h；不耐高溫和塑料移液吸頭等，清洗干凈后，再用75乙醇的2N NaOH溶液浸泡過(guò)夜，逐個(gè)用無(wú)熱原水沖洗干凈后，置60烘箱中烘干備用。3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制訂3.3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素工作品的稀釋：取150 EU安瓿加1.5 ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(簡(jiǎn)稱BET)于旋渦混合器上混合15 min，以后每稀釋一步均須混合30秒。為100 EUml10 EUml1 EUml0.5 EUml0.25 E

5、Uml0.125 EUml0.06 EUml0.03 EUml。3.3.2取系列稀釋的最后4個(gè)稀釋度(即（0.25、0.125、0.06、0.03 Euml）制訂標(biāo)準(zhǔn)曲線，每一稀釋度平行設(shè)2管，再用BET水2管作陰性對(duì)照，所有測(cè)試管的OD值均需減去陰性對(duì)照管OD值后計(jì)算濃度，此外要增加大于1 EUml內(nèi)毒素液作陽(yáng)性對(duì)照。重復(fù)4次，用直線回歸方程統(tǒng)計(jì)，其相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)等于或大于0.98（r0.98）其內(nèi)毒素稀釋液OD值的最高最低之差不得小于0.4。3.4.3 計(jì)算式：式中：x軸為內(nèi)毒素工作品稀釋濃度y軸為測(cè)得的OD值內(nèi)毒素4個(gè)稀釋度為0.25、0.125、0.06、0.03 EUml的OD值分

6、別為0.826、0.436、0.163、0.087，n4。x0.465（x）22.162 x20.0826y1.512（y）22.2861y20.9065r0.9978Sx0.0976Sy0.3342斜率3.4197 截距0.01954示例4.1葡萄糖氯化鈉注射液將原液（A）用BET水12倍連續(xù)稀釋2次即12（B）與14（C）各加入1.0 EUml內(nèi)毒素工作品稀釋液，每稀釋一步都要混合30 s，其測(cè)試讀出OD值，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算，內(nèi)毒素濃度結(jié)果(見表1)。表1內(nèi)毒素濃度計(jì)算結(jié)果內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液ABCEUmlODEUmlODEUmlODEUmlODEUml0.0200.0230.0440.21

7、2幾何均數(shù)相關(guān)系數(shù)回收率上述結(jié)果其相關(guān)系數(shù)均大于0.98，其最高、最低之差的OD值均大于0.4，合乎標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，內(nèi)毒素的回收率在50200之間6可用A組制訂的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)判別。4.25葡萄糖注射液：按方法稀釋12倍，結(jié)果(見表2)。 表2稀釋12倍結(jié)果ABEUmlODEUml幾何均數(shù)相關(guān)系數(shù)回收率73.8101.6上述結(jié)果表明，其相關(guān)系數(shù)均大于0.98，其最高最低點(diǎn)OD值大于0.4合乎標(biāo)準(zhǔn)曲線要求。內(nèi)毒素的回收率在50200之間也可用A組制訂的標(biāo)準(zhǔn)曲線判別。4.3鹽酸阿霉素配制成1 mgml液體，同上述方法加入1 EUml內(nèi)毒素溶液，制成0.25、0.125、0.06、0.03系列濃度，檢測(cè)O

8、D值分別為0.801、0.346、0.165、0.063按標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算其內(nèi)毒素濃度分別為0.240、0.107、0.054、0.024 EUml；其幾何均值為0.076，相關(guān)系數(shù)為0.9980其最高點(diǎn)最低點(diǎn)之差大于0.4，符合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求，其回收率達(dá)到85.2。4.4妥布霉素樣品4個(gè)，配制成1 mgml溶液檢測(cè)，分別OD值為0.836、1.006、2.480、0.035、OD值，按上述內(nèi)毒素工作品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其內(nèi)毒素量分別為0.25、0.3、0.73、0.16 EUml。 5討論5.1用產(chǎn)色基質(zhì)法鱟試劑制訂內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用在葡萄糖氯化鈉注射液，5葡萄糖注射液，鹽酸阿霉素，妥布霉素等建立

9、標(biāo)準(zhǔn)曲線與進(jìn)行回收試驗(yàn)確定內(nèi)毒素量值明確，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線與回收試驗(yàn)的要求6，7。5.2所測(cè)定的OD值是由分光光度計(jì)自動(dòng)減除陰性對(duì)照管。用藥液作陰性對(duì)照管時(shí)，要求選用無(wú)檢測(cè)量?jī)?nèi)毒素的藥液代替陰性水，產(chǎn)色法其測(cè)試管OD讀數(shù)可以陰性對(duì)照管排除藥液本身以及參予反應(yīng)試劑本身的污染等使干擾(回收)試驗(yàn)更可靠。5.3從4個(gè)未知妥布霉素檢品測(cè)定結(jié)果可見，用產(chǎn)色基質(zhì)鑒別內(nèi)毒素含量很明確，其中0.73 EUml的OD值為2.483超過(guò)儀器限度，將其比色液稀釋后再測(cè)，可以確定其含量，也可將樣本同倍稀釋再行檢測(cè)，無(wú)明顯偏差。5.4本研究用0.25 EUml靈敏度凝膠法鱟試劑作對(duì)照，OD值在0.706即0.21 EUml

10、時(shí)均是堅(jiān)實(shí)凝膠。5.5本研究是將定量產(chǎn)色基質(zhì)鱟試劑應(yīng)用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的擴(kuò)大應(yīng)用的藥品、生物制品質(zhì)量控制可行性試驗(yàn)，我們的報(bào)告依據(jù)只作檢測(cè)的方法學(xué)研究報(bào)道和參考，要作為正式代替熱原檢查應(yīng)由藥品生產(chǎn)廠方提供數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)者：王紹明作者單位：福州東方鱟試劑廠參考文獻(xiàn)1Salliven D T，et al：Appl Microbiol 1974；28（6）：10232Yanug.N.s，et al：J Clin Investy 1992；51：17903Iwanaga.S et al：Halmorstaris 1978；7：1834原田敏枝一他：醫(yī)用酵素 1978；3：435T.Obayashi et al：Clin Chem 1985；149：556中國(guó)藥典2000年版(二部)新增與修訂內(nèi)容匯編(初稿)第347頁(yè)7Gui