ＨＥ染色原理和試劑配制及染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的探討

1、    染色原理和試劑配制及染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的探討李紅芬， 鄭肇巽，馬品耀，平國(guó)強(qiáng)江蘇省人民醫(yī)院病理科 210029【摘要】 目的 探討HE染色原理和試劑配制及染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的臨床基礎(chǔ)性意義，推廣優(yōu)良、簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)的試劑配制方法，研究染色過(guò)程中的若干問(wèn)題， 完美HE染色，明確病理診斷，利于臨床治療。方法 采用本科室自己配制試劑所染HE切片30張和30張(對(duì)照組)某試劑公司配制試劑所染HE切片進(jìn)行顯微鏡下對(duì)比 ，分析兩者的優(yōu)缺點(diǎn)及染色過(guò)程中的若干問(wèn)題。結(jié)果 本科室自家配制試劑所染HE切片明顯優(yōu)于對(duì)照組，尤其體現(xiàn)在細(xì)胞核著色上，注重染色過(guò)程中的若干問(wèn)

2、題的切片比未注重染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的切片質(zhì)量高。 結(jié)論 HE染色原理和試劑配制及染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的探討，從基礎(chǔ)理論出發(fā)，不斷實(shí)踐，為更完美、清晰地呈現(xiàn)顯微鏡下正?；虍惓５慕M織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，明確病理診斷，從而更好更快地指導(dǎo)臨床治療而努力 ?！娟P(guān)鍵詞】 HE染色在病理組織切片染色中，蘇木素伊紅(HE)染色是其最基本、最常用的一種染色方法，目前各種試劑公司HE染液層出不窮，購(gòu)買(mǎi)方便，但價(jià)格昂貴、染色效果并不太理想。本科室二十多年來(lái)應(yīng)用自己所配HE染色液，效果較好，近年偶然用了某試劑公司HE染液，結(jié)果效果次于前者，后也有其它試劑公司HE染液要求試用，結(jié)果效果也不太好，尤其在細(xì)胞核的顯色上更明顯，現(xiàn)將

3、結(jié)果報(bào)道如下：資料與方法1、材料選擇2010年1月2010年7月在江蘇省人民醫(yī)院病理科同一臺(tái)染色機(jī)所做的本科室所配HE染色液所染病理切片30張;對(duì)照組30張為某試劑公司HE染液所染病理切片。這兩組30張病理切片要求每組都含有皮膚、眼球、扁桃體、唇腺|(zhì)、食道、胃、十二指腸、闌尾、乙狀結(jié)腸、直腸、肝、膽囊、胰腺、脾、腎、膀胱、前例腺、睪丸、子宮、乳腺、甲狀腺、腎上腺、鼻息肉粘膜、支氣管粘膜、肺、骨髓、淋巴結(jié)、大網(wǎng)膜、二尖瓣、主動(dòng)脈瓣的組織。同一組織選同一蠟塊切兩張相同厚度(4微米)片分別用本科室所配HE染色液、某試劑公司HE染液進(jìn)行染色，然后顯微鏡下一一對(duì)應(yīng)觀察對(duì)比，以篩選出優(yōu)質(zhì)染液，推廣優(yōu)良、簡(jiǎn)

4、捷、經(jīng)濟(jì)的試劑配制方法，研究染色過(guò)程中的若干問(wèn)題，完美HE染色，明確病理診斷，利于臨床治療。2、本科室HE染色液的配制方法：備5000ml玻璃瓶(要求質(zhì)量要厚實(shí)不易炸裂的)或大容量的瓷缸一個(gè)若干個(gè)(根據(jù)需要而定);取5000ml玻璃瓶一個(gè)洗凈,在5000 ml水位處用標(biāo)簽貼上標(biāo)記線。取500g鉀明礬(硫酸鋁鉀)投入此瓶?jī)?nèi)，并將瓶拎到開(kāi)水間 100ºC水龍頭下，瓶底下墊木板或木制腳凳;接100ºC水入瓶并用竹棒或木棒不斷攪拌，這樣邊加水邊攪拌至鉀明礬完全溶解。然后向瓶?jī)?nèi)加入事先配好的250ml蘇木素酒精溶液(將25g 蘇木精粉末投入量杯并加入250ml 無(wú)水酒精，用玻棒調(diào)勻即

5、可)，迅速用棒攪勻 ，液體呈暗深藍(lán)色，然后再繼續(xù)加100ºC開(kāi)水至5000 ml水位標(biāo)記線 ，用竹棒攪勻瓶?jī)?nèi)液體;待液體冷卻后將瓶放置陽(yáng)臺(tái)，瓶口不加蓋，也可在瓶口上蒙上薄薄一層紗布(紗布下緣用帶子或皮筋扎緊)防過(guò)多灰塵入瓶，這樣進(jìn)行自然氧化約半年至一年左右，經(jīng)自然氧化充分的蘇木素染液液面可見(jiàn)熒亮色結(jié)晶層;使用前用濾紙或多層紗布過(guò)濾以濾除熒亮色結(jié)晶層、灰塵、細(xì)菌蟲(chóng)卵等，過(guò)濾后還可加適量冰醋酸或每100ml加冰醋酸 5ml(媒染以促進(jìn)染色，使所染片子更好看)即可用3伊紅的染液的配制首先用蒸餾水清洗量杯等器皿, 稱(chēng)水溶性伊紅12.5g投入量杯加入量好的125ml蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?并加適量的冰

6、醋酸,用玻棒攪拌使液調(diào)成糊狀，然后糊狀液沿內(nèi)附濾紙的漏斗過(guò)濾，待濾液滴凈，將內(nèi)附濾紙的漏斗放入烘箱內(nèi)烘干濾紙上析出物(可過(guò)夜烘烤干，次晨取出)，將烤干的濾紙上析出物投入95 %5000ml酒精中攪拌均勻混合，因酒精易揮發(fā)，配好后加蓋封存，且用塑料薄膜扎緊瓶口。3.1醇溶性伊紅(即乙醇伊紅)染液配制方法：先將醇溶性伊紅Y25g溶于95%酒精5000ml中，用玻棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸(促染劑)1滴。用乙醇性伊紅液染細(xì)胞漿后可不經(jīng)水洗，直接用85%酒精脫水。3.2分化液的配制：<一>0.5%1%鹽酸酒精分化液的配制：      

7、;                        基數(shù)劑量            （本科室）常規(guī)劑量           

8、0;        純鹽酸            0.51ml            2.55ml               &

9、#160;    75 %酒精            99.599ml            497.5495ml                  

10、           （0.5%、0.1%的鹽酸酒精分化液是常用的濃度） 此液用一段時(shí)間后需要延長(zhǎng)或更換液體，新液分化時(shí)間要短。    <二>1%0.5%0.25%鹽酸水分化液的配制： （1%、0.5%、0.25%這三個(gè)濃度的分化液為常用的濃度劑量）可根據(jù)蘇木素染液的深淺濃淡酌情靈活配制使用。            

11、                 基數(shù)劑量            （本科室）常規(guī)劑量                   

12、; 純鹽酸            0.250.51ml            1.252.55ml                    水（自來(lái)水或

13、蒸餾水）            99.7599.599ml            498.75497.5495ml                 三、HE染色步驟：(一)、脫蠟1、 二甲苯脫蠟10分

14、鐘左右(自動(dòng)染色機(jī)染10分鐘)2、 二甲苯脫蠟5分鐘左右(自動(dòng)染色機(jī)染10分鐘)3、 無(wú)水酒精(乙醇)洗去二甲苯1分鐘(機(jī)染1分鐘)4、 無(wú)水酒精(乙醇)洗去二甲苯1分鐘(機(jī)染1分鐘)5、 95%酒精1分鐘(機(jī)染1分鐘)6、 85%酒精1分鐘(機(jī)染1分鐘)7、 自來(lái)水洗片刻(機(jī)染1分鐘)(二)、染色1、 蘇木素染色15分鐘左右(機(jī)染15分鐘)2、 自來(lái)水洗片刻(機(jī)染1分鐘)3、 1%或0.5%或0.25%鹽酸水分化35秒鐘(機(jī)分化30秒)4、 自來(lái)水洗，溫水藍(lán)化片刻(機(jī)洗5分鐘)5、 伊紅酒精染液浸染20秒2分鐘(機(jī)染30秒5分鐘)(三)、脫水、透明、封固1、 85%的酒精脫水20秒(機(jī)染20

15、秒)2、 95%的酒精1分鐘(機(jī)染1分鐘)3、 無(wú)水酒精染12分鐘(機(jī)染2分鐘)4、 無(wú)水酒精染2分鐘(機(jī)染2分鐘)5、 二甲苯浸2分鐘(機(jī)染2分鐘)6、 二甲苯浸2分鐘(機(jī)染2分鐘)7、 中性樹(shù)膠或加拿大樹(shù)膠封片 2結(jié)果與討論染色結(jié)果:細(xì)胞核被蘇木精染成鮮明的藍(lán)色，鈣鹽和各種微生物也可染成藍(lán)色和紫藍(lán)色。細(xì)胞核藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，粘液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞漿、肌肉、結(jié)締組織、紅細(xì)胞和嗜伊紅顆粒被伊紅染成深淺不同程度的粉紅色至桃紅色，胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒呈反光強(qiáng)的鮮紅色。膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色，紅血球呈橘紅色，蛋白性液體呈粉紅色。兩組不同HE染色液染色結(jié)果比較:(如下表/圖1、

16、圖2) 由此可見(jiàn)本科室自家配制試劑所染HE切片明顯優(yōu)于對(duì)照組，尤其體現(xiàn)在細(xì)胞核著色上。因此 推廣優(yōu)良、簡(jiǎn)捷、經(jīng)濟(jì)的本科室自家試劑,以 完美HE染色，明確病理診斷，利于臨床治療。另外值得注意的是:注重染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的切片比未注重染色過(guò)程中的若干問(wèn)題的切片質(zhì)量高。 要完美HE染色除選擇優(yōu)良試劑，在HE染色中還應(yīng)注意以下事項(xiàng)：1、脫蠟 石蠟切片必須經(jīng)過(guò)脫蠟后才能染色，脫蠟前切片要經(jīng)烘烤，這種使組織和玻片粘貼牢固。組織切片脫蠟應(yīng)徹底，脫蠟好壞主要取決于二甲苯的溫度和時(shí)間，所有的時(shí)間都是指新的二甲苯在室溫25ºC以下時(shí)，如果二甲苯是用過(guò)一段時(shí)間，切片又比較厚，室溫低應(yīng)增加脫蠟時(shí)

17、間，脫蠟不凈是影響染色不良的重要原因之一 。2、染色 石蠟切片經(jīng)水洗后放入蘇木素染色液中，一般情況下新配的蘇木素染液中只需染一至三分鐘左右，應(yīng)根據(jù)染片的多少，逐步把染色時(shí)間延長(zhǎng)。蘇木素染色后，不易在分化液中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，切片分化應(yīng)在鏡下觀察，分化過(guò)度，應(yīng)水洗后重新在蘇木素染液中染色，在水洗分化和使切片在自來(lái)水或稀的氨水中充分變藍(lán)(藍(lán)化)。新配的伊紅染色塊，切片染色不易過(guò)長(zhǎng)，應(yīng)根據(jù)染切片的多少逐步延長(zhǎng)染色時(shí)間，切片使伊紅染后，分化時(shí)間要短。3、脫水 切片經(jīng)過(guò)染色后，通過(guò)各級(jí)酒精脫水，首先從低濃度到高濃度，低濃度酒精對(duì)伊紅有分化作用，切片經(jīng)過(guò)低濃度時(shí)要短，向高濃度逐漸延長(zhǎng)脫水時(shí)間，脫水不徹底，使切

18、片發(fā)霧，在顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)模糊不清。4、透明與封片 石蠟組織切片染色經(jīng)過(guò)脫水后必須經(jīng)二甲苯處理，使切片透明，才能用樹(shù)膠封片3。因引起注意的是：二甲苯純度不純使切片透明不夠會(huì)影響切片質(zhì)量!(工作中曾發(fā)現(xiàn)新進(jìn)貨的二甲苯試劑中散發(fā)出濃厚的汽油味，嚴(yán)重影響切片質(zhì)量! )總之， HE染色在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)研究中都是不可缺少的 。隨著江蘇省人民醫(yī)院病理科工作量的不斷加大，每天數(shù)百例，一年數(shù)萬(wàn)例的病理標(biāo)本經(jīng)固定、脫水、包埋、切片，HE染色 制片后發(fā)出顯微鏡下病理報(bào)告，指導(dǎo)臨床;HE染色在臨床工作中顯得尤為重要，且在現(xiàn)今不斷增加的臨床手術(shù)中快速冰凍切片(1030例/日)中 ，完好的HE染色依然散發(fā)出其獨(dú)有的魅力，體現(xiàn)其快的節(jié)奏。參考文獻(xiàn)                      平衡員工的“薪情”              &#