RNAi抑制膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C表達(dá)對化療敏感性

1、RNA干擾對膀胱癌T24細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子C表達(dá)的影響祖雄兵 葉章群 周四維 齊琳 張向陽摘要 目的 觀察RNA干擾（RNAi）抑制膀胱癌T24細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）表達(dá)和提高化療敏感性。方法 根據(jù)轉(zhuǎn)染效率最高時(shí)pEGFPN1質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例，轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為3組，RT-PCR檢測VEGF-CmRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。結(jié)果轉(zhuǎn)染后24h，即有mRNA表達(dá)水平的下降，Quantity one半定量：24小時(shí)0.570.17，48小時(shí)0.420.11，72小時(shí)0.330.09。VEGF-C抑制后，吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡率明顯升高，轉(zhuǎn)染組為(41.381.54

2、)%，明顯高于未轉(zhuǎn)染組(22.871.40)%與脂質(zhì)體組(23.471.58)% (P0.05)。結(jié)論 RNAi可高效穩(wěn)定的抑制膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)，明顯提高了吉西他濱誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的藥物敏感性。關(guān)鍵詞 膀胱癌；VEGF-C；RNA干擾；化學(xué)治療；細(xì)胞凋亡RNA interference on Vascular endothelial growth factor C mRNA expression in bladder cancer T24 cells ZU Xiong-bing, YE Zhang-qun, ZHOU Si-wei, QI Lin,ZHANG Xia

3、ngyang. *Department of Urology,Xiangya Hospital,Central South Universiy,Changsha 410008, China Abstract Objective To evaluate the improvement of sensitivity to chemotherapeutical drugs in T24 cell line of bladder cancer when the expression of VEGF-C has been inhibited by RNA interference (RNAi). Met

4、hod We constructed RNA interference vectors with H1 promoter against VEGF-C and then transferred them into the T24 cell line. the expression of VEGF-C was determined by RT-PCR, and FCM was employed to examine the apoptosis index of T24 cell line induced by Gemcitabine. Results The expression level o

5、f mRNA declined after transfection. Analyzed with Quantity One, the data of semi-quantitative determination shows 0.570.17 after 24hs, 0.420.11 after 48hs, 0.330.09 after 72hs. The apoptosis index was (41.381.54)% in the transferred group, (22.871.40)%in the control group and (23.471.58)% in the lip

6、osome group. The sensitivity of T24 cells to gemcitabine increased after VEGF-C had been inhibited and the apoptosis index examined by FCM was significantly increased (P0.01). The expression level of VEGF-C has negative correlation with the apoptosis index (P0.05). Conclusion The small Hairpin siRNA

7、 produced by RNAi vectors with H1 promoter can effectively suppress the 基金項(xiàng)目: 國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30700832）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2005037675）作者單位:410008 長沙，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院泌尿外科（祖雄兵、齊琳、張向陽）；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科（葉章群、周四維） 通訊作者：張向陽，e-mail: zhxiyangexpression of VEGF-C in T24 cells, and impel the apoptosis induced by gemcitab

8、ine.Key words VEGF-C; Bladder transitional cell cancer; RNA interference; Chemotherapeutical drug therapy; Apoptosis血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C,Vascular endothelial growth factor-C）被認(rèn)為是淋巴管內(nèi)皮生長因子1，我們前期研究顯示，VEGF-C在膀胱癌組織中的高表達(dá)促進(jìn)了膀胱癌淋巴管新生、淋巴管浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2；VEGF-C抑制了絲裂霉素（MMC）誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡3。我們運(yùn)用RNAi抑制膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)，觀察

9、其增強(qiáng)癌細(xì)胞對化療的敏感性。材料與方法1 材料：膀胱癌T24細(xì)胞由湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供。pEGFPN1質(zhì)粒購于美國Clontech公司，質(zhì)粒提取試劑盒購于德國Qiagen公司。脂質(zhì)體lipofectamine 2000為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，引物由上海生工完成。RNA抽提（Trizol）試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒購于美國Promega公司。吉西他濱（gemcitabine）購自江蘇豪森。2 商業(yè)化pSUPER.neo/GFP-VEGFc質(zhì)粒的酶切鑒定：將保存的質(zhì)粒菌種劃線接種于氨芐青霉素陽性的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，挑克隆接種于5mL氨芐青霉素陽性

10、的LB培養(yǎng)基，搖床上過夜。按質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，證實(shí)存在后，進(jìn)行大量抽提，并行雙酶切鑒定質(zhì)粒無誤。質(zhì)粒中選擇的靶片斷為gtcctgtacccagactact，即克隆的小雙鏈DNA為：TCGAGGTCCTGTACCCAGACTACTTTCAAGAGAAGTAGACTGGGTACAGGACAA CCAGGACATGGGTCTGATGAAAGTTCTCTTCATCTGACCCATGTCCTGTTGATC3 細(xì)胞培養(yǎng): 膀胱癌T24細(xì)胞用含10%小牛血清及青、鏈霉素各100U/ml的RMIP1640培養(yǎng)基，37、5%CO2 的飽和濕度條件下培養(yǎng)。4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將pEGFPN1質(zhì)粒與Lipof

11、ectamineTM2000分別按1:1，1:1.5，1:2，1:2.5，1:3，1:3.5，1:4（均為g:L）的比例混合，并分別用30、50、70l的LipofectamineTM2000按試劑盒說明書轉(zhuǎn)染培養(yǎng)收集的T24細(xì)胞，48h后熒光顯微鏡下觀察不同條件的轉(zhuǎn)染效率，摸索最佳轉(zhuǎn)染條件。實(shí)驗(yàn)分3組，未轉(zhuǎn)染組:加入100l RMIP1640培養(yǎng)基；脂質(zhì)體組:加入100 l RMIP1640培養(yǎng)基及脂質(zhì)體；轉(zhuǎn)染組: 加入100l RMIP1640培養(yǎng)基及pSUPER.neo/GFP-VEGFc質(zhì)粒和脂質(zhì)體, pSUPER.neo/GFP-VEGFc質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例為轉(zhuǎn)染效率最高時(shí)pEGFP

12、N1質(zhì)粒與脂質(zhì)體的比例。分別在24、48、72h檢測轉(zhuǎn)染后VEGF-C的抑制效率。5 半定量RT-PCR技術(shù)檢測T24細(xì)胞中VEGF-C mRNA的表達(dá)：收集未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞。按Trizol試劑說明書要求提取組織總RNA，于紫外分光光度儀上檢測波長為260nm和280nm時(shí)的A值, 以公式：RNA濃度（g/ml）OD26040g/ml稀釋倍數(shù)計(jì)算RNA濃度；立即行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，取10L，1.5%瓊脂糖凝膠電泳；EB染色10分鐘，用Bio-Rad公司的凝膠電泳成像儀成像，Quantity one分析各條帶的吸光度，計(jì)算VEGF-CmRNA的相對值。6

13、流式細(xì)胞儀檢測T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染VEGF-C干擾載體后的凋亡率：收集未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組和轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染6h后的細(xì)胞，加入或不加入濃度0.5g/ml的gemcitabine，繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后收集所有懸浮和貼壁細(xì)胞，加入70%冰乙醇4固定過夜，加入RNA 酶(終濃度為50g/ml)，37反應(yīng)1h，再加入碘化丙錠(PI濃度為100g/ml)溶液，混勻，反應(yīng)2030 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡指數(shù)。7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)均在相同條件下重復(fù)試驗(yàn)3次。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(S)描述，成組的計(jì)量資料采用方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)（SNK）或者最小顯著差法（LSD）。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分

14、析。結(jié)果1 轉(zhuǎn)染效率：在pEGFPN1質(zhì)粒與LipofectamineTM2000按1:2.5（g:L），50L體積的LipofectamineTM2000時(shí)的轉(zhuǎn)染效率最高。2 轉(zhuǎn)染RNA干擾載體對VEGF-C的抑制作用：RT-PCR 結(jié)果顯示，3 條泳道中-actin mRNA 條帶（542bp）的亮度相似；而VEGF-C mRNA條帶（259bp）的亮度，轉(zhuǎn)染組明顯弱于未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組。見圖1。圖1 轉(zhuǎn)染后mRNA抑制效果，1：空白對照，2：對照，3：轉(zhuǎn)染干擾在轉(zhuǎn)染后24 h，即有mRNA表達(dá)水平的下降；在48 h，mRNA的表達(dá)水平均有明顯的下降；72 h，對mRNA的抑制作用仍然存在

15、，但稍弱于48 h的抑制效果。經(jīng)Quantity one 半定量后，得出了VEGF-C的mRNA的相對量：24小時(shí)0.570.17，48小時(shí)0.420.11，72小時(shí)0.330.09。3流式細(xì)胞儀檢測凋亡的結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測未轉(zhuǎn)染組、脂質(zhì)體組及轉(zhuǎn)染組gemcitabine作用的凋亡率結(jié)果（表1），可見，在不加化療藥物的情況下，單純轉(zhuǎn)染RNA干擾載體，細(xì)胞的凋亡率與轉(zhuǎn)染前相比稍有升高，在吉西他濱的作用下，抑制VEGF-C的表達(dá)后，細(xì)胞的凋亡率可明顯升高，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(41.381.54) %，明顯高于未轉(zhuǎn)染組(22.871.40)%與脂質(zhì)體組(23.471.58)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

16、P0.05)。表1 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率（%）未加藥Gemcitabine未轉(zhuǎn)染組5.240.9722.871.40脂質(zhì)體組5.29.0.4623.471.58轉(zhuǎn)染組7.261.5441.381.54討論目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用RNA干擾方法主要有：(1) 直接化學(xué)合成法，成本高，合成周期長，不適合應(yīng)用基礎(chǔ)的試驗(yàn)研究；(2)DNA體外轉(zhuǎn)錄法，此方法合成周期短，合成量可控，但只能瞬時(shí)表達(dá)，往往用來篩選有效的RNAi基因片段。(3)載體介導(dǎo)的DNA體內(nèi)轉(zhuǎn)錄法：將帶有特異基因序列及RNA聚合酶啟動(dòng)子(如U6、H1) 的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，胞內(nèi)啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA，進(jìn)一步形成類似天然的s

17、iRNA，具有可反復(fù)利用、經(jīng)濟(jì)、快速、持久等特點(diǎn)。Elbashir等4認(rèn)為，3端帶有UU序列的siRNA對相應(yīng)的靶基因有最強(qiáng)的抑制效率。而這正好可以應(yīng)用RNA聚合酶的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)，因?yàn)閁6、H1等RNA聚合酶的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄結(jié)束時(shí)，形成3端帶有UU序列尾的RNA。目前普遍認(rèn)為，在3050%之間GC含量的siRNA對基因的抑制作用強(qiáng)于其它GC含量的siRNA。因?yàn)樵?和3非編碼區(qū)(un translated regions, UTRs)以及5起始密碼區(qū)附近50100個(gè)核苷酸的序列區(qū)域含有豐富的蛋白結(jié)合的位點(diǎn)，結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白以及形成的翻譯起始復(fù)合物等可以影響siRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(dsRNA i

18、nduced silencing complex, RISC)結(jié)合到靶mRNA上，影響siRNA的作用效果。在應(yīng)用H1轉(zhuǎn)錄發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)的小雙鏈RNA模仿天然的siRNA時(shí)，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)部位的環(huán)堿基數(shù)目對RNAi作用有很大的影響，Brummelkamp等5應(yīng)用含H1啟動(dòng)子的pSuper質(zhì)粒作為載體時(shí)，發(fā)現(xiàn)環(huán)為含9個(gè)堿基時(shí)的抑制作用效率最高。根據(jù)以上的原則，我們：在選擇靶序列的位置時(shí)，從起始密碼子之后100個(gè)堿基之后的序列中選取，同時(shí)避免序列中含有4個(gè)以上的連續(xù)T或A的序列，以避免RNA聚合酶啟動(dòng)子作用下引起的轉(zhuǎn)錄中止；設(shè)計(jì)的片斷是經(jīng)H1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄后的siRNA；應(yīng)用的質(zhì)粒載體pBSHH的啟動(dòng)子以及

19、結(jié)構(gòu)與pSuper質(zhì)粒幾乎完全一致，因此設(shè)計(jì)RNA干擾片段時(shí)采用了與Brummelkamp等設(shè)計(jì)的TTCAAGAGA9個(gè)堿基組成的環(huán)。結(jié)果顯示我們設(shè)計(jì)的siRNA對VEGF-C基因有明顯的抑制效果，可見，以H1啟動(dòng)子為載體介導(dǎo)的RNAi可高效的抑制膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)。目前，基因治療的關(guān)鍵問題是基因的導(dǎo)入及導(dǎo)入后的穩(wěn)定表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)載體的高效轉(zhuǎn)染，我們應(yīng)用了含綠色表達(dá)熒光蛋白GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，實(shí)現(xiàn)高效感染的同時(shí)，可以直觀的觀察感染效率。我們檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24時(shí)，VEGF-C的mRNA表達(dá)水平就有明顯的下降，48小時(shí)抑制效果最明顯，72小時(shí)抑制效率開始稍低于48

20、小時(shí)，但是仍有較高的抑制效率。從所有這些結(jié)果看，載體介導(dǎo)的RNAi的作用時(shí)間明顯長于直接轉(zhuǎn)染人工合成的小雙鏈RNA（siRNA），后者對靶細(xì)胞基因的抑制效果往往在72小時(shí)后即明顯減弱。因此，我們認(rèn)為，運(yùn)用含H1啟動(dòng)子的載體介導(dǎo)的RNAi可穩(wěn)定的抑制膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)?；熕幬锕嘧⒁殉蔀榘螂装┬g(shù)后輔助治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，然而臨床結(jié)果顯示灌注后仍有較高的復(fù)發(fā)率，其主要原因就是化療耐藥及敏感性下降。因此，提高膀胱癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性勢在必行。近年來，gemcitabine膀胱灌注治療表淺膀胱癌成為了新的熱點(diǎn)，但其化療效果仍然有限。本研究中，通過RNA干擾載體抑制膀胱癌T24細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)水平后，我們檢測了細(xì)胞對吉西他濱敏感性的變化。發(fā)現(xiàn)在沒有加化療藥物的作用下，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后凋亡指數(shù)有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)的差別，當(dāng)加入化療藥物后，VEGF-C被明顯抑制的T24細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯高于VEGF-C未被抑制的細(xì)胞?？梢?， RNAi抑制T24細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)可增強(qiáng)T24細(xì)胞對吉西他濱的敏感性，從而提高吉西他濱的藥物作用效果，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。參考文獻(xiàn)1 Stacker SA ,Baldwin ME , Achen MG. The ro