膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌檢測(cè)試驗(yàn)報(bào)告三

1、微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。2、掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。3、掌握油鏡的正確使用、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備、革蘭氏染色法，熟悉細(xì)菌基本 形態(tài)。4、熟悉幾種常用的細(xì)菌生化反應(yīng)的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途。5、掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的原理、方法及用途。6熟悉藥物敏感性試驗(yàn)方法的種類、原理及應(yīng)用，掌握紙片擴(kuò)散法。7、掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理、方法、結(jié)果觀察與判斷。二、實(shí)驗(yàn)器材1、 天平、稱量紙、干粉培 養(yǎng)基、 錐形瓶、量筒、15支試管、試管架、試管筐、 5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精燈2、膿汁標(biāo)本1支，糞便標(biāo)本1支；伊紅美蘭平板2個(gè)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板2個(gè)，伊 紅美藍(lán) 平板

2、2個(gè)，接種環(huán)，酒精燈3、斜面4支、細(xì)菌分離培養(yǎng)物(上次實(shí)驗(yàn)平板)4、斜面培養(yǎng)物4支，營(yíng)養(yǎng)肉湯4支，生理鹽水2支，鏡油瓶、拭鏡紙1套，吸 水紙1本，載玻片4張，染色瓶，染色架5、 斜面培養(yǎng)物4支，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物(菌液)4支，半固體瓊脂4支，營(yíng)養(yǎng)瓊 脂平板4個(gè)，糖發(fā)酵管1套，抗菌素紙片1套，眼科鑷子2把6半固體培養(yǎng)物4支，藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)物4個(gè)，微量發(fā)酵管培養(yǎng)物1套。三、方法與步驟1、培養(yǎng)基的制備：拉H甘 培養(yǎng)基稱量干粉培養(yǎng)基(g)水量(ml)煮沸(次)分裝(ml)備注營(yíng)養(yǎng)瓊脂11.43002 瓶，500ml錐形瓶，平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.9753515支，中試管，斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯1.1501115支小試 管，液

3、體半固體瓊脂1.7603315支，小試管，高層干粉培養(yǎng)基一蒸餾水一加熱溶化一分裝一集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙、 牛皮紙，用 橡皮筋扎好T放入講臺(tái)邊的滅菌桶或滅菌筐內(nèi)T送到髙壓蒸汽滅菌 室滅菌（用于倒平板的培養(yǎng)基不用加熱溶解，搖勻即可）2、細(xì)菌的分離培養(yǎng)平板劃線分離法甲f膿汁標(biāo)本f營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（黃色）乙f膿汁標(biāo)本f營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（黃色） 丙一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板（紫色）丁一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板（紫色） 方法：（1）右手拿接種環(huán)（如握筆式），燒灼滅菌，欲伸入試管內(nèi)的接種環(huán)桿部分 亦要 迅速通過(guò)火焰23次，以殺滅其表面細(xì)菌；（2）左手握住盛有標(biāo)本的試管的 下端，右手以無(wú)名指、小指與手掌在火焰

4、旁拔出試管棉塞并挾住之，將管口迅速通過(guò)火焰三次滅菌；（3）立 即將已滅冷卻的接種環(huán)伸入試管內(nèi)， 沾取標(biāo)本（或菌 液）一環(huán)，試管口火焰滅菌后塞好棉塞；（4）左手斜持平板，略開(kāi)蓋，在酒精燈 火焰左前方約56cm處，將接種環(huán)上的菌液涂抹于平板表面的邊緣部分；（5）燒灼接種環(huán)，冷卻后，從原涂抹部分開(kāi)始，連續(xù)平行劃線，每次只劃平板的1/41/5， 劃畢后接種環(huán)再經(jīng)火焰滅菌，冷卻后用同樣方法在平板其余部分劃線，每次劃線要與前次劃線重疊1-3條，共計(jì)3A次（區(qū)）；（6）接種完畢，將接種環(huán)燒灼滅 菌后方可放下；（7）將培養(yǎng)皿倒置，37° C培養(yǎng)34小時(shí)后，觀察結(jié)果。3、細(xì)菌的純培養(yǎng)斜面接種分工甲f普

5、通平板f黃色菌落f 1支斜面 乙f普通平板f白色菌落f 1支斜面 丙f EMBf板f紫黑菌落f 1支斜面 丁f EMB平板f粉紅菌落f 1支斜面方法：接種環(huán)T套住菌落T輕刮取菌接種環(huán)取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉T條細(xì)菌接種線一再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線一細(xì)菌涂布接種在 斜面培養(yǎng)基的表面 一斜面正面上2/3作標(biāo)記：組號(hào)、顏色一收集平板-滅菌桶內(nèi)（平板底部朝下，蓋朝上放置速送滅菌室f高壓蒸汽滅菌f洗刷。4、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查涂片f干燥f固定f染色（1）涂片f干燥f固定甲f黃色，紫黑。乙f白色，粉紅。丙f黃色，紫黑。丁f白色，粉紅。方法：涂片：接種環(huán)取鹽水3ulX2滴，水滴間距小于2cm;

6、取菌苔少許（1mm 小菌落半個(gè)）與鹽水混勻，涂成大于Icm2;涂畢f(xié)環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán) 內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。f干燥f固定：手持載玻片f端，涂膜朝上，兩 個(gè)涂膜快速通過(guò)火焰外層3次，時(shí)間2? 3秒鐘。（2）革蘭染色涂片f干燥f固定f結(jié)晶紫f初染1分鐘f水洗f盧戈碘液f媒染1分鐘f水洗f 95%乙醇f脫色約20秒鐘一7尺洗一稀釋品紅一復(fù)染1分鐘一水洗一吸干， 鏡檢。油鏡使用方法：10X物鏡一看清標(biāo)本一滴加香柏油一100X油鏡一浸泡油 中f模 糊物象f細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像f記錄結(jié)果f關(guān)閉電源f擦鏡紙拭去香柏油一擦鏡紙沾少許乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭f擦鏡紙擦拭油鏡。5、液體培養(yǎng)基接

7、種（肉湯接種）甲f黃色，乙f白色，丙f紫黑，丁f粉紅。方法：（1）接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接種；（2）在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌；（3）標(biāo)記：組號(hào)，顏色6細(xì)菌的生化試驗(yàn)等a. 細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)甲一紫黑菌苔一葡萄糖乙一紫黑菌苔一乳糖丙f粉紅菌苔f葡萄糖 丁f粉紅菌苔f乳糖方法：用砂輪在糖發(fā)酵管液面上方 2? 3cm處切割，然后，向切口外側(cè)分離掰斷，管口燒灼滅菌。接種針斜面取菌，伸入培養(yǎng)基內(nèi)，在管壁上，上下研磨 接種。退出接種針，燒灼滅菌。管口朝向相同，放置在平皿內(nèi)。b. 抗菌素敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法甲一黃色菌液 乙一白色菌液丙f紫黑菌液 丁f粉紅菌液方

8、法：先取環(huán)菌液；沿平板直徑拉一條細(xì)菌接種線；再取一環(huán)菌液；旋轉(zhuǎn)平板90度角，拉另一條接種線，使兩條細(xì)菌接種線呈“十字形”；然后 在平板上半部，作 連續(xù)來(lái)回密集劃線，每次劃二分之一平板；旋轉(zhuǎn)平板 90 度角，二次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平 板90度角，三次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平板 90度 角，四次密集劃線；設(shè)三點(diǎn)，呈等邊三角距離；點(diǎn)距離平板邊緣約15mm;?作標(biāo)記：青、先、慶；？鑷子尖嘴朝下，夾取相應(yīng)藥物紙片 的邊緣，平貼在 已設(shè)定的位置上，輕輕按壓紙片。c. 血漿凝固酶試驗(yàn)兔血漿+黃色，白色方法：取二滴兔血漿(rabbit plasma) 置于潔凈的玻片上。分別用接種環(huán)取 白色和黃 色菌苔(約2? 3個(gè)菌落的

9、菌量)與血漿研磨混合成直徑8? 10mm勺一層 薄菌膜，立即觀察結(jié)果。菌液出現(xiàn)明顯凝塊者為陽(yáng)性，否則為陰性。d. 半固體穿刺接種法甲f白色乙f金黃色丙f紫黑 丁f粉紅方法：接種針斜面取菌，從半固體中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部 5分之4 處，再循原來(lái)的路線,退出接種針；管口、接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌；標(biāo)記 ： 組號(hào),顏色。7、細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)、結(jié)果分析玻片凝集試驗(yàn)方法：(1)取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水 15ul。 遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清 15ul; (2)用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約2個(gè)小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻四、結(jié)果與討論（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)

10、果1. 洗手前后對(duì)比：圖1.1甲乙洗手前后圖1.2丙丁洗手前后空氣的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果（暴露在衛(wèi)生間窗子邊）圖1.3空氣的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果CFU/m3 = 50000N - AT=50000< 3X (3.14 X 3.5cm2) X 40/m3=258/m32. 細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果：(1 )膿汁標(biāo)本在普通平板上有黃色、白色兩種菌落，菌落的色素是脂溶性的，是 細(xì)菌本身的顏色。菌落直徑2mn左右、圓形、隆起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、 不透明。(2 )糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水 溶性的，不是細(xì)菌本身的顏色，紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明的 菌落，

11、菌落直徑2? 3mm粉紅色菌落淡粉紅色，半透明，直徑 1? 2mm.(3) 從四張平板畫(huà)線的結(jié)果上來(lái)看，第三張圖分離效果很好，得到的菌落典型。 而其他三張均有不足。第一二張膿汁的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，前面兩區(qū)涂抹太密集，而 板的其他部位未充分利用，得不到十分明顯的菌落。第四張糞便的平板第一區(qū)太 稀疏，未充分利用平板，故在培養(yǎng)后未見(jiàn)到數(shù)量較少的粉紅菌落，原因是劃線時(shí) 不熟練，不能連續(xù)劃線。圖2.1甲，乙一膿汁標(biāo)本一營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板圖2.2丙，丁一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板3. 細(xì)菌的純培養(yǎng)：在斜面培養(yǎng)基上得到四種菌體的純培養(yǎng)標(biāo)本，從普通平板上挑取的黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來(lái)菌落的顏色，黃色或

12、白色。從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒(méi)有原來(lái)菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤(rùn)、光滑、前者不透明，后者透明。圖3.1四種菌落在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況 右左向右依次為金黃，白色粉紅，紫黑菌苔4. 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查：圖4.1膿汁菌苔（左邊為白色菌苔，右圖為金黃色菌苔）圖4.2糞便菌苔（左圖為粉紅菌苔，右圖為紫黑色菌苔）鏡下觀察：用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡 油鏡下均為G+求菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色 素，這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅

13、色半透明兩種菌落。紫黑 色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分解乳糖的 致病菌。顯微鏡下，均為 G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。圖5.1液體培養(yǎng)基接種結(jié)果6. 細(xì)菌的生化試驗(yàn)等：(1) 半固體穿刺接種法圖6.1半固體穿刺結(jié)果觀察及討論：表1.動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果菌苔半固體實(shí)驗(yàn)紫黑細(xì)菌1+紫黑細(xì)菌2-粉紅細(xì)菌1-粉紅細(xì)菌2-+ ：陽(yáng)性-：陰性1、紫黑細(xì)菌1細(xì)菌自接種部位向四周移動(dòng)、擴(kuò)散生長(zhǎng)，培養(yǎng)基呈云霧狀或根須 狀混濁狀態(tài)，有鞭毛。但是實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)紫黑菌苔 2無(wú)任何現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)分析，應(yīng)當(dāng) 是用接種針取菌苔時(shí)，操作者僅針尖未接觸到菌苔，導(dǎo)致穿刺后無(wú)細(xì)菌的生長(zhǎng)。但是結(jié)合其

14、他組的結(jié)果，我們認(rèn)為紫黑菌苔應(yīng)當(dāng)是動(dòng)力陽(yáng)性的。2、粉紅細(xì)菌菌苔均沿著直線生長(zhǎng)，可看出其無(wú)鞭毛。(2) 細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)6.2糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖從左至右分別為：(粉紅一乳糖粉紅一葡萄糖紫黑一乳糖紫黑一葡萄糖)編號(hào)菌苔糖發(fā)酵管反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果描述符號(hào)甲紫黑糖發(fā)酵管變黃色有氣泡分解X糖產(chǎn)酸又產(chǎn)氣乙紫黑糖發(fā)酵管變黃色有氣泡分解X糖產(chǎn)酸又產(chǎn)氣丙粉紅糖發(fā)酵管變黃色無(wú)氣泡分解X糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣+丁粉紅糖發(fā)酵管變紫色無(wú)氣泡分解X糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣-+ ：產(chǎn)酸或陽(yáng)性：產(chǎn)酸產(chǎn)氣-：陰性紫黑細(xì)菌微型發(fā)酵關(guān)內(nèi)液體變黃，產(chǎn)生氣泡，氣泡的高度分別為10mn和17mm說(shuō)明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅細(xì)菌只分解葡萄糖，

15、不產(chǎn)氣，不分解乳糖。(3) 抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果圖6.3抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果表3各困抑困圈直徑(mm)表菌苔青霉素頭抱曲松慶大霉素金黃色422530白色302240紫黑3726粉紅3628表4藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析青霉素頭抱曲松慶大霉素金黃色+白色+±+紫黑-+粉紅-+-：耐藥土：中度敏感+ :敏感白色細(xì)菌對(duì)3種抗生素均敏感金黃細(xì)菌對(duì)青霉素敏感，對(duì)先鋒霉素V敏感，對(duì)慶大毒素敏感紫黑細(xì)菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)先鋒霉素V中度敏感，對(duì)慶大毒素中度敏感粉紅細(xì)菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)先鋒霉素V敏感，對(duì)慶大毒素敏感（4）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖6.4白色（左）與金黃色（右）菌苔1、白色菌苔不發(fā)生凝塊，容易涂抹。呈均勻乳

16、白狀態(tài)。2、黃色菌苔能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附著于菌體表面，形成凝塊，涂抹不開(kāi)。說(shuō)明黃色細(xì)菌為致病菌。7. 細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果：圖6.5粉紅菌苔（右）凝集結(jié)果（左側(cè)為對(duì)照）1、由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可看到，生理鹽水一端不出現(xiàn)凝集，福氏志賀菌診斷血清一端菌液渾濁，少量絮狀，為陽(yáng)性。說(shuō)明粉紅菌為福氏志賀菌。8. 結(jié)論：對(duì)照對(duì)照常見(jiàn)腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，血清學(xué)分析，說(shuō)明黃色菌落是金 黃色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大腸埃希菌；粉紅色菌 落是福氏志賀菌。（二）實(shí)驗(yàn)討論1.分析：制備好培養(yǎng)基后，首先采用平板劃線分離法，從不同的樣本中分離出不同的細(xì)菌

17、。 從膿汁標(biāo)本中分離出黃色和白色兩種菌落， 在顯微鏡下觀察，這兩種細(xì)菌均為G+ 球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌；結(jié)合菌落的顏色，可以初 步斷定，這是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。再通過(guò)血漿凝固酶試驗(yàn)，觀察到 金黃色葡萄球菌能使血漿產(chǎn)生顆粒性物質(zhì)，而白色葡萄球菌則沒(méi)有任何反應(yīng)，說(shuō) 明了金黃色葡萄球菌是致病菌。最后通過(guò)藥敏試驗(yàn)，可見(jiàn)不同的抗生素所形成的 抑菌圈不同，其中金黃色葡萄球菌對(duì)青霉素最敏感，而紫黑和粉紅細(xì)菌對(duì)青霉素 耐藥。用伊紅美藍(lán)平板分離菌落時(shí)，可以從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤的菌 落和粉 紅色半透明菌落；在顯微鏡下觀察時(shí)，這兩種菌均為G-桿菌，散在排列， 從形態(tài)

18、上不能鑒別是什么細(xì)菌；經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)，可以觀察到，紫黑色的細(xì)菌使 能使葡萄糖和乳糖的試管變色和產(chǎn)生氣體，粉紅色的細(xì)菌只能使葡萄糖的試管 變色而無(wú)氣體，對(duì)乳糖無(wú)反應(yīng)；經(jīng)半固體動(dòng)力試驗(yàn)，觀察到紫黑色的細(xì)菌使半固體培養(yǎng)基成渾濁狀態(tài)，粉紅色的細(xì)菌只在接種針插入的方向聚集。綜上所述，紫黑色的細(xì)菌為大腸埃希菌，粉紅色的為福氏志賀菌 。2.實(shí)驗(yàn)的不足之處:我們的實(shí)驗(yàn)在操作上也產(chǎn)生了許多錯(cuò)誤和不足。例如在對(duì)糞便標(biāo)本粉紅色菌苔（福氏志賀菌）進(jìn)行斜面培養(yǎng)時(shí)，在斜面上亦發(fā)現(xiàn)少許顏色略深呈白色的菌落， 經(jīng)分析認(rèn)為是接種環(huán)與柄接頭處污染導(dǎo)致。這也體現(xiàn)出了微生物實(shí)驗(yàn)操作中無(wú)菌 操作的重要性。平板劃線太重且接種環(huán)持握過(guò)直導(dǎo)致劃線過(guò)深。半固體接種穿刺有一只沒(méi)有接種到菌，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不明顯。3. 注意事項(xiàng)：在培養(yǎng)基配制好后，我們需要檢查培養(yǎng)基是否合格。接種環(huán)使用前后必須灼燒滅菌：接種環(huán)使用前，長(zhǎng)期暴露于空氣中，會(huì)帶有許 多空氣中的雜菌，不灼燒滅菌則會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)過(guò)程