分子雜交技術(shù)

1、.分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的 ,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA, 也可以是細(xì)胞總DNA 或總 RNA 。根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交, 即細(xì)胞原位雜交。 探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測(cè)。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性, 因而該技術(shù)在分子生物

2、學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、 基因組中特定基因序列的定性、 定量檢測(cè)和疾病的診斷等方面。 因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用 ,而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。第一節(jié)核酸探針標(biāo)記的方法核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為 DNA 和 RNA 探針 ; 根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否,可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針;根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況,可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法。一、雙鏈DNA 探針及其標(biāo)記方法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA 探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診

3、斷等方面。雙鏈 DNA 探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機(jī)引物合成法。1. 切口平移法 (nick translation) 當(dāng)雙鏈 DNA 分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí) ,E.coli DNA 聚合酶就可將核苷酸連接到切口的 3'羥基末端。同時(shí)該酶具有從 5' 3'的核酸外切酶活性 ,能從切口的 5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸 ,從而使切口沿著DNA 鏈移動(dòng) ,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨小Ｗ詈线m的切口平移片段一般為50-500 個(gè)核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響

4、: (a) 產(chǎn)物的比活性取決于 -32 PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。(b) DNA 酶的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。(c) DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA 。材料：待標(biāo)記的 DNA 。設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)10 ×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100g/ml。BSA(2)未標(biāo)記的 dNTP 原液 : 除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外 ,其余 3 種分別溶解于

5、50mmol/L Tris ·Cl (pH7.5) 溶液中 ,濃度為 0.3mmol/L 。(3) -32 P dCTP 或 -32 PdATP:400 Ci/mmol, 10Ci/ 。l(4) E.coli DNA聚合酶 (4 單位 / l):溶于 50 g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50% 甘油， 50mmol/L Tris ·Cl(pH7.5) 中。(5)DNA 酶 :1mg/ml 。(6)EDTA :200mmol/L (pH8.0)。(7)10mol/L NH4Ac 。操作步驟 :(1) 按下列配比混合 :未標(biāo)記的 dNTP 10l10×

6、切口平移緩沖液5l待標(biāo)記的DNA 1g -32 PdCTP 或 dATP(70Ci) 7 lE.coli DNA 聚合酶4 單位DAN 酶 I 1 l加水至終體積50l(2) 置于 15水浴 60 分鐘。(3) 加入 5l EDTA 終止反應(yīng)。.'.(4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L,加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀回收DNA 探針。 注意 1 、3H ，32P 及 35S 標(biāo)記的 dNTP 都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用 -32 P-dNTP 。2、DNA 酶的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA 酶活性高，則所得探針比活性高，但長(zhǎng)度比較短。2. 隨機(jī)引物合成法

7、隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA 模板結(jié)合 ,在 Klenow 酶的作用下 ,合成 DNA 探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP 和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為400-600 個(gè)核苷酸。利用隨機(jī)引物進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是：(1)Klenow 片段沒有 5' 3'外切酶活性 ,反應(yīng)穩(wěn)定 ,可以獲得大量的有效探針。(2)反應(yīng)時(shí)對(duì)模板的要求不嚴(yán)格 ,用微量制備的質(zhì)粒 DNA 模板也可進(jìn)行反應(yīng)。 (3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高 ,可達(dá) 4×109 cpm/ g探針。 (4)隨機(jī)引物反應(yīng)還可以在低熔點(diǎn)瓊脂糖中直接進(jìn)行。材料：待標(biāo)記的DNA 片段。

8、設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)隨機(jī)引物（隨機(jī)六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA ）。(2)10 ×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。(3)Klenow 片段。(4)20mmol/L DTT 。(5)未標(biāo)記的dNTP 溶液： dGTP、 dCTP 和 dTTP 溶液，各 5mmol/L 。(6) -32 P dATP：比活性 >3000Ci/mmol, 10Ci/ l。(7)緩沖液 A ：50mmol/L Tris ·Cl （ pH7.5 ） ; 50mmol/L NaCl; 5mmol/

9、L EDTA（ pH8.0 ）; 0.5% SDS 。操作步驟 :(1) 200ng 雙鏈 DNA(1l) 和 7.5ng 隨機(jī)引物 (1 l)混合后置于eppendorf 管內(nèi) ,水浴煮沸 5 分鐘后，立即置于冰浴中1 分鐘。(2) 與此同時(shí) ,盡快在一置于冰浴中的 0.5ml eppendorf 管內(nèi)混合下列化合物 :20mmol/L DTT 1l未標(biāo)記的dNTP 溶液1l10×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液1l -32 P dA TP(比活性 >3000Ci/mmol; 10Ci/ l) 3 lddH2O 1l(3) 將步驟 (1)eppendorf 管中的溶液移到步驟 (2)

10、管中。(4) 加入 5 單位 (約 1l) Klenow 片段 , 充分混合 , 在微型離心機(jī)中以12000g 離心 1-2 秒 , 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫 3-16 小時(shí)。(5) 在反應(yīng)液中加入 10l緩沖液 A 后,將放射性標(biāo)記的探針保存在 -20下備用。同時(shí)計(jì)算放射比活性。注意 1、引物與模板的比例應(yīng)仔細(xì)調(diào)整，當(dāng)引物高于模板時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物比較短，但產(chǎn)物的累積較多；反之，則可獲得較長(zhǎng)片段的探針。2、模板 DNA 應(yīng)是線性的，如為超螺旋DNA ，則標(biāo)記效率不足50%。二、單鏈DNA 探針用雙鏈探針雜交檢測(cè)另一個(gè)遠(yuǎn)緣DNA 時(shí) ,探針序列與被檢測(cè)序列間有很多錯(cuò)配。而兩條探針互補(bǔ)鏈之

11、間的配對(duì)卻十分穩(wěn)定 ,即形成自身的無效雜交,結(jié)果使檢測(cè)效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA 探針的合成方法主要有下列.'.兩種1) 以 M13 載體衍生序列為模板,用 Klenow 片段合成單鏈探針; (2)以 RNA 為模板 , 用反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA 探針。1. 從 M13 載體衍生序列合成單鏈DNA 探針合成單鏈DNA 探針可將模板序列克隆到噬?；騇13 噬菌體載體中 ,以此為模板 ,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物, 在a-32P-dNTP的存在下 ,由 Klenow 片段作用合成放射標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性

12、內(nèi)切酶切割這些長(zhǎng)短不一的產(chǎn)物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 )將探針與模板分離開。雙鏈 RF 型 M13 DNA 也可用于單鏈 DNA 的制備 ,選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針。材料：已制備好的單鏈DNA 模板（方法參見第十章中有關(guān)內(nèi)容）。設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)10 ×Klenow 緩沖液： 0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L TrisCl(pH7·.5); 0.1mol/L MgCl2。(2)0.1mol/L DTT溶液。(3) -32 P dA TP：3000Ci/mmol, 10 Ci/ l。(4)40

13、mmol/L 和 20mmol/L 的未標(biāo)記的dNTP 溶液。(5)dCTP,dTTP,dGTP 各 20mmol/L 的溶液。(6) Klenow 片段（ 5 單位 /ml）。(7)適宜的限制酶，如EcoR、 Hind 等。(8)0.5mol/L EDTA（pH8.0 ）。操作步驟：(1)在 0.5ml eppendorf 管中混合如下溶液：?jiǎn)捂溎０澹s0.5pmol ） 1mg適當(dāng)引物5pmol10×Klenow 緩沖液3ml加水至20ml(2)將 eppendorf 管加熱到85 5 分鐘，在 30 分鐘內(nèi)，使小離心管降到37；(3)依次加入：DTT 2mla-32PdA TP

14、 5ml未標(biāo)記的dATP 1mldGTP,dCTP,dTTP 混合液1ml混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。(4)加 1ml （ 5 單位） Klenow 酶室溫下30 分鐘。.'.(5)加 1ml20mmol/L 未標(biāo)記的 dATP 溶液 20 分鐘。(6)68 加熱 10 分鐘，使 Klenow 片段失活。調(diào)整 NaCl 濃度，使之適宜于酶切。(7)加入 20 單位限制性內(nèi)切酶（如 EcoR , Hind 等）酶切 1 小時(shí)。(8)酚 /氯仿抽提 DNA ，乙醇沉淀以去除 dNTP 或加 0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度 10mmol/L 。(9)用電泳方法分離放

15、射性標(biāo)記的探針。2. 從 RNA 合成單鏈cDNA 探針cDNA 單鏈探針主要用來分離cDNA 文庫(kù)中相應(yīng)的基因。用RNA 為模板合成cDNA探針?biāo)玫囊镉袃煞N: (1)用寡聚 dT 為引物合成cDNA 探針。本方法只能用于帶Poly(A) 的 mRNA, 并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA 3' 末端序列。 (2) 可用隨機(jī)引物合成cDNA 探針。該法可避免上述缺點(diǎn), 產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA 中通常含有多種不同的RNA分子 ,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜得多, 應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA 中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA 雜交雙鏈經(jīng)

16、堿變性后,RNA 單鏈可被迅速地降解成小片段,經(jīng) Sephadex G-50 柱層析即可得到單鏈探針。材料：已提純的RNA 或 mRNA設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)合適的引物：隨機(jī)引物或oligo(dT)15-18 。(2)5mmol/L dGTP, dA TP dCTP, dTTP。(3) a-32PdCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。(4)反轉(zhuǎn)錄酶 (200000 單位 /ml) 。(5)100mmol/L DTT 。(6)250mmol/L MgCl2 。(7)1mol/L KCl 。(8)0.5mol/L EDTA (pH8.0)

17、 。(9)10% SDS 。(10)RNasin(40 單位 /ml) 。操作步驟 :(1)在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：RNA 或 mRNA 10.0ml合適的產(chǎn)物 (1mg/ml) 10.0ml1mol/L Tris Cl(pH7·.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml250mmol/L MgCl2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0mla-32PdCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRnasin 20U加水至48ml反轉(zhuǎn)錄酶 (200000 單位 /ml) 2ml混勻后 ,稍稍離心， 37保溫 2 小時(shí)。(2) 反應(yīng)完畢后加

18、入下列試劑：0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml(3) 加入 3ml 3mol/L NaOH 。68保溫 30 分鐘以水解 RNA 。(4)冷卻至室溫后 , 加入 10ml 1mol/L Tris Cl·(pH7.4) ?；靹颉Ｈ缓蠹尤?3ml 2mol/L HCl 。(5)酚 /氯仿抽提后，用 Sephadex G-50 柱層析或乙醇沉淀法分離標(biāo)記的探針。 注意 RNA 極易降解，因而實(shí)驗(yàn)中的所有試劑和器皿均應(yīng)在DEPC 處理后，滅菌備用。三、末端標(biāo)記DNA 探針現(xiàn)以 Klenow 片段標(biāo)記 3'末端為例說明末端標(biāo)記的方法。.'

19、.1、材料：待標(biāo)記的雙鏈含凹缺3'末端的 DNA 。2、設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋等。3、試劑：(1)3 種不含標(biāo)記的dNTP 各為 200mmol/L 。(2)合適的限制酶。(3) -32P dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul 。(4)Klenow 片段 (5U/ml) 。(5)10 ×末端標(biāo)記緩沖液:0.5mol/L Tris Cl·(pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。4、操作步驟：(1)25 l反應(yīng)體系中用合適的限制酶酶切1g的 DNA 。(2)按下列成分加入試劑并混勻：已酶

20、切的DNA 1mg (25ml)10×末端標(biāo)記緩沖液5ml2mmol/L3 種dNTP 1mla-32P-dNTP適量加水至50ml(3)加入 1 單位的 Klenow 片段 ,室溫下反應(yīng)30 分鐘。(4)加入 1ml 2mmol/L第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15 分鐘。(5)70 加熱 5 分鐘 ,終止反應(yīng)。(6)用酚 /氯仿抽提后 ,用乙醇沉淀來分離標(biāo)記的DNA, 或用 Sephdadex G-50 柱層析分離標(biāo)記的DNA 。注意 1、利用本方法可對(duì)DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA 片段。2、對(duì) DNA 的純度不很嚴(yán)格，少量制備的質(zhì)粒

21、也可進(jìn)行末端標(biāo)記合成探針。3、末端標(biāo)記還有其他的一些方法，如利用T4 多核苷酸激酶標(biāo)記脫磷的5'端突出的DNA 和平末端凹缺DNA 分子，也可利用該酶進(jìn)行交換反應(yīng)標(biāo)記5'末端。四、寡核苷酸探針利用寡核苷酸探針可檢測(cè)到靶基因上單個(gè)核苷酸的點(diǎn)突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡(jiǎn)并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫(kù)。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準(zhǔn)確配對(duì),可以準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)雜交條件, 以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對(duì)序列雜交, 對(duì)于一些未知序列的目的片段則無效。1、材料：待標(biāo)記的寡核苷酸(10pmol/ l)。2、設(shè)備：高

22、速離式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。3、試劑：(1)10 ×T4 多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/LTris ·Cl (pH7.6), 0.1mol/LMgCl2, 50mmol/LDTT, 1mmol/LSpermidine ·HCl,1mmol/L EDTA (pH8.0) 。(2) -32 P ATP(比活性 7000Ci/mmol; 10mCi/ml) 。(3)T4 多核苷酸激酶（10 單位 /ml ）。4、操作步驟：(1)100ng 寡核苷酸溶于30ml 水中。置 65變性 5 分鐘，迅速置冰溶中。(2)立即加入下列試劑：10×激酶緩沖液5mlg-3

23、2PA TP(比活性 7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10mlT4 多核苷酸激酶2ml加水至50ml混勻后置37水浴 20 分鐘。(3)再加入 20 單位 T4 多核苷酸激酶，置37水浴 20 分鐘后立即置冰浴中。(4)Sephadex G-50 柱層析。此方法是在每個(gè)探針的5'末端多加了一個(gè)磷酸，理論上，這會(huì)影響其與DNA 的雜交。因此，建議使用Klenow DNA聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探針。.'.除了常見的同位素標(biāo)記探針外， 還有利用非同位素標(biāo)記探針和雜交的方法， 許多公司都有不同的非同位素標(biāo)記探針的雜交系統(tǒng)出售，可根據(jù)這些公司所提供的操作步驟進(jìn)

24、行探針的標(biāo)記和雜交。五、 RNA 探針許多載體如pBluescript, pGEM 等均帶有來自噬菌體SP6 或 E.coli 噬菌體 T7 或 T3 的啟動(dòng)子 , 它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA 的 RNA 聚合酶所識(shí)別 ,合成特異性的RNA 。在反應(yīng)體系中若加入經(jīng)標(biāo)記的NTP，則可合成RNA 探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優(yōu)點(diǎn),又具有許多DNA單鏈探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)，主要是：RNANA雜交體比DNANA 雜交體有更高的穩(wěn)定性,所以在雜交反應(yīng)中RNA 探針比相同比活性的 DNA 探針?biāo)a(chǎn)生信號(hào)要強(qiáng)。RNA:RNA 雜交體用RNA 酶 A 酶切比 S1 酶切

25、DNA:RNA雜交體容易控制,所以用 RNA探針進(jìn)行RNA 結(jié)構(gòu)分析比用DNA 探針效果好。噬菌體依賴DNA 的 RNA 聚合酶所需的rNTP 濃度比 Klenow 片段所需的dNTP 濃度低 ,因而能在較低濃度放射性底物的存在下 ,合成高比活性的全長(zhǎng)探針。用來合成RNA 的模板能轉(zhuǎn)錄許多次,所以 RNA 的產(chǎn)量比單鏈DNA 高。并且用來合成RNA 的模板能轉(zhuǎn)錄多次，可獲得比單鏈DNA 更高產(chǎn)量的RNA 。反應(yīng)完畢后，用無RNA 酶的 DNA 酶處理 ,即可除去模板DNA, 而單鏈 DNA 探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA 分離。另外噬菌體依賴于DNA 的 RNA 聚合酶不識(shí)別克隆DN

26、A 序列中的細(xì)菌、 質(zhì)?；蛘婧松锏膯?dòng)子，對(duì)模板的要求也不高 ,故在異常位點(diǎn)起始RNA 合成的比率很低。因此, 當(dāng)將線性質(zhì)粒和相應(yīng)的依賴DNA 的 RNA 聚合酶及四種rNTP 一起保溫.'.時(shí) ,所有 RNA 的合成 ,都由這些噬菌體啟動(dòng)子起始。而在單鏈DNA 探針合成中 ,若模板中混雜其他 DNA 片段 ,則會(huì)產(chǎn)生干擾。但它也存在著不可避免的缺點(diǎn)，因?yàn)楹铣傻奶结樖荝NA ，它對(duì) RNase 特別敏感，應(yīng)而所用的器皿試劑等均應(yīng)仔細(xì)地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA 會(huì)合成極長(zhǎng)的RNA ，它有可能帶上質(zhì)粒的序列而降低特異性。第二節(jié)幾種常見的雜交分子雜交是

27、通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA 或 RNA 分子所處的位置。根據(jù)被測(cè)定的對(duì)象，分子雜交基本可分為以下幾大類：(1) Southern 雜交NA 片段經(jīng)電泳分離后,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對(duì)象為DNA, 探針為 DNA 或 RNA 。(2) Northern 雜交 :RNA 片段經(jīng)電泳后 ,從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。 被檢對(duì)象為RNA, 探針為 DNA或 RNA。根據(jù)雜交所用的方法,另外還有斑點(diǎn) (dot) 雜交、狹槽 (slot)雜交和菌落原位雜交等。有3 種

28、固相支持體可用于雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541 濾紙。不同商標(biāo)的尼龍膜需要進(jìn)行不同的處理，在DNA 固定和雜交的過程中要嚴(yán)格按生產(chǎn)廠家的說明書來進(jìn)行。Whatman 541 濾紙有很高的濕強(qiáng)度, 最早用于篩選細(xì)菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫(kù)。固定化 DNA 的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時(shí)所建立的條件相同。Whatman 541 濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優(yōu)點(diǎn) :它更便宜 ,雜交中更耐用 ,干燥過程中不易變形和碎裂等。 然而若變性過程不小心 ,雜交信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時(shí)所得到的信號(hào)強(qiáng)度。因此 ,常規(guī)的細(xì)菌篩選和各種雜交時(shí)仍選用硝酸纖維素濾膜

29、作為固相支持體。分子雜交技術(shù)（一）一、概述前面已經(jīng)介紹了核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基順序，通過堿基對(duì)之間非共價(jià)鍵（主要是氫鍵） 的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA 與 DNA 、RNA 與 RNA或 RNA 與 DNA 的二條單鏈之間進(jìn)行。由于DNA 一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時(shí)，應(yīng)先將雙鏈DNA 分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH 值來實(shí)現(xiàn)。使單鏈聚合雙鏈的過程稱為退火或復(fù)性。

30、用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。.'.核酸雜交技術(shù)基本上是Hall 等 1961 年的工作開始的， 探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。該法很慢、費(fèi)力且不精確， 但它開拓了核酸雜交技術(shù)的研究。Bolton 等 1962 年設(shè)計(jì)了第一種簡(jiǎn)單的固相雜交方法，稱為 DNA-瓊脂技術(shù)。 變性 DNA 固定在瓊脂中， DNA 不能復(fù)性， 但能與其它互補(bǔ)核酸序列雜交。典型的反應(yīng)是用放射性標(biāo)記的短DAN或 RNA 分子與膠中DNA 雜交過夜，然后將膠置于柱中進(jìn)行漂洗，去除游離探針，在高溫、低

31、鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。該法尤其適用于過量探針的飽和雜交實(shí)驗(yàn)。60 年代末， Britten 等設(shè)計(jì)了另一種分析細(xì)胞基因組的方法。該法是研究液相中DNA 的復(fù)性以比較不同來源核酸的復(fù)雜度，典型的方法是： 從不同生物體 （細(xì)菌、酵母、魚和哺乳動(dòng)物等）內(nèi)分離DNA ，用水壓器剪切成長(zhǎng)約450 核苷酸（ nt）的片段。剪切的DNA 液（含 0.12mol/L 磷酸鹽緩沖液或0.18mol/l Na+ ），經(jīng)煮沸使dsDNA 熱變性成ssDNA 。然后冷至約60，在此溫度孵育過程中，測(cè)定溶液一定時(shí)間內(nèi)的UV260nm 的吸光度（減色效應(yīng)）來監(jiān)測(cè)互補(bǔ)鏈的復(fù)性程度。通

32、常該實(shí)驗(yàn)可比較不同來源生物DNA 的復(fù)性速率，并可建立序列復(fù)雜度與動(dòng)力學(xué)復(fù)雜度間的關(guān)系。60 年代中期 Nygaard 等的研究為應(yīng)用標(biāo)記DNA 或 RNA 探針檢測(cè)固定在硝酸纖維素（NC）膜上的 DNA 序列奠定了基礎(chǔ)。如 Brown 等應(yīng)用這一技術(shù)評(píng)估了爪蟾rRNA 基因的拷貝數(shù)。RNA 在代謝過程中被3H 尿嘧啶標(biāo)記，并在過量的情況下與膜上固定的基因組DNA 雜交，繼而用RNase 處理，消化非特異性結(jié)合的RNA 。漂洗后計(jì)數(shù)以測(cè)定雜交探針的量。通過計(jì)算與已知量DNA 雜交的 RNA 量即可評(píng)估rRNA 基因數(shù)。由于當(dāng)時(shí)缺乏特異探針，這種方法不能用于研究其它特異基因的表達(dá)，這些早期過量探

33、針膜雜交試驗(yàn)實(shí)際上是現(xiàn)代膜雜交實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。進(jìn)入 70 年代早期，許多重要的發(fā)展促進(jìn)了核酸雜交技術(shù)的進(jìn)展。例如，對(duì)特異基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析和對(duì)動(dòng)力學(xué)雜交實(shí)驗(yàn)又有興趣。固相化的Poly U Sepharose和寡（ dT ）- 纖維素使人們能從總RNA 中分離 Poly A+ RNA 。用 mRNA 的經(jīng)純化技術(shù)可從網(wǎng)織紅細(xì)胞總RNA 中制備 -和 -珠蛋白 mRNA 混合物。這些珠蛋白mRNA 首次被用于合成特異的探針以分析珠蛋白基因的表達(dá)。由于制備cDNA 探針很繁瑣，所獲得cDNA 的長(zhǎng)度和純度也不穩(wěn)定。所以尋求新的探針來源是使分子雜交技術(shù)進(jìn)一步推廣的基礎(chǔ)。70 年代末期到80 年代早期，分子

34、生物學(xué)技術(shù)有了突破性進(jìn)展，限制性內(nèi)切酶的發(fā)展和應(yīng)用使分子克隆成為可能。各種載體系統(tǒng)的誕生， 尤其是質(zhì)粒和噬菌體DAN 載體的構(gòu)建，使特異性DNA 探針的來源變得十分豐富。人們可以從基因組DNA文庫(kù)和 cDNA 文庫(kù)中獲得特定基因克隆，只需培養(yǎng)細(xì)菌，便可提取大量的探針DNA 。迄今為止，已克隆和定性了許多特異DNA 探針。由于固相化學(xué)技術(shù)和核酸自動(dòng)合成儀的誕生，現(xiàn)在可常規(guī)制備18100 個(gè)堿基的寡核苷酸探針。應(yīng)用限制酶和Southern印跡技術(shù)，用數(shù)微克DNA 就可分析特異基因。特異DNA 或 RNA 序列的量和大小均可用Southern 印跡和 Northern 印跡來測(cè)定，與以前的技術(shù)相比，

35、大大提高了雜交水平和可信度。.'.盡管取得了上述重大進(jìn)展，但分子雜交技術(shù)在臨床實(shí)用中仍存在不少問題，必須提高檢測(cè)單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質(zhì)代替放射性同位素標(biāo)記探針以及簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作和縮短雜交時(shí)間，這樣，就需要在以下三方面著手研究：第一，完善非放射性標(biāo)記探針；第二，靶序列和探針的擴(kuò)增以及信號(hào)的放大；第三，發(fā)展簡(jiǎn)單的雜交方式，只有這樣，才能使DNA 探針實(shí)驗(yàn)做到簡(jiǎn)便、快速、低廉和安全。二、探針 -靶反應(yīng)從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測(cè)的合適標(biāo)記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)?？乖?抗體、外源凝集素 - 碳水化合物、親和素-生物素、受體 -配基（ ligand ）

36、以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針- 靶分子反應(yīng)。蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過混合力（疏水、離子和氫鍵）的作用在少數(shù)特異位點(diǎn)上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長(zhǎng)短不同，通過氫鍵在幾十、幾百甚至上千個(gè)位點(diǎn)上的結(jié)合。因?yàn)橛袡C(jī)溶液可降低雜交體的穩(wěn)定性，所以，疏水反應(yīng)對(duì)互補(bǔ)核酸鏈的結(jié)合也有一定的作用，但對(duì)其特異性影響甚微。核苷酸經(jīng)某一原子、功能基團(tuán)或長(zhǎng)側(cè)鏈修飾后仍可能進(jìn)行堿基配對(duì)，這取決于修飾的部位和修飾的性質(zhì)。這一特性有助于理解非放射性核酸探針標(biāo)記物的設(shè)計(jì)和125I 與 DNA 探針的化學(xué)結(jié)合。能與核酸結(jié)合的單一原子有銀、溴和碘等， 這些元素可與嘧啶 （胸腺嘧啶除外）環(huán)的C-5

37、 位或嘌呤環(huán)的C-8 位反應(yīng)而不影響氫鍵的形成。溴亦可與胸腺嘧啶的C-6 位結(jié)合。而胞嘧啶的C-4 和腺嘌呤的N-6 就不能被修飾，否則會(huì)影響堿基配對(duì)，盡管C 的 N-4 位和 A 的 N-6 位參與了氫鍵形成，但它們也是標(biāo)記位點(diǎn)。 這是因?yàn)闃?biāo)記的探針每1kb 只摻入 10 30 個(gè)修飾堿基，即僅 4%12%的單個(gè)堿基被修飾的類似物取代了。盡管摻入位點(diǎn)處的堿基配對(duì)較弱或不存在，但對(duì)整個(gè)雜交分子的穩(wěn)定性影響很小。防止氫鍵破壞的一種方法就是修飾探針，即探針克隆入M13 載體中，只修飾載體區(qū)而不修飾插入片段。當(dāng)用放射性同位素32P 和 35S 標(biāo)記核酸時(shí)，由于同位素是摻入核酸骨架的磷酸二脂鍵中，因此

38、堿基未發(fā)生任何修飾。在5端的磷酸基團(tuán)上可進(jìn)行化學(xué)修飾，這是標(biāo)記寡核苷酸探針的有效方法。因?yàn)檫@種方法是在一個(gè)探針分子上標(biāo)記一個(gè)檢測(cè)的基團(tuán)，所以，對(duì)長(zhǎng)的克隆探針不適用。此外，還可利用修飾的堿基來增加雜交的穩(wěn)定性和特異性。2-氫基腺嘌呤可替代寡核苷酸探針中的腺嘌呤通過形成3 個(gè)氫鍵以增加雜交體的穩(wěn)定性。另外，在G-C 豐富的 RNA 探針中，可用次黃嘌呤代替鳥嘌呤以獲得特異的雜交。因?yàn)榇吸S嘌呤和鳥嘌呤間只形成 2 個(gè)氫鍵，有效地降低了雜交體的Tm 值，這樣， Tm 值與雜交溫度更接近，雜交的嚴(yán)格性就增加了，因此，也就增加了特異性。很顯然， 結(jié)合位點(diǎn)的不同和可檢測(cè)基團(tuán)與檢測(cè)系統(tǒng)的不同，可派生出很多核酸

39、探針標(biāo)記方法。這是由核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)所決定的。只有在對(duì)核酸分子的探針-靶反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)有了深入了解之后，才能更好地理解后面的章節(jié)內(nèi)容。三、核酸探針的種類.'.基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA 探針，RNA 探針， cDNA 探針， cRNA 探針及寡核苷酸探針等幾類，DNA 探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。（一） DNA 探針DNA 探針是最常用的核酸探針，指長(zhǎng)度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA 或單鏈 DNA 探針?，F(xiàn)已獲得DNA 探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA 探針。這

40、類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA 片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類Alu 探針。這些DNA 探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G+C 百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約5×106bp，約含 3000 個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA 是相同的，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組 DNA 文庫(kù)的辦法，即將細(xì)菌DNA 切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息

41、的克隆庫(kù)。然后用多種其它菌種的 DNA 作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號(hào)的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA 片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA 序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性 DNA 探針，常常是比較繁瑣的。探針 DNA 克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA 文庫(kù)為可表達(dá)性， 克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽(yáng)性克隆，所得到多個(gè)陽(yáng)性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達(dá)

42、文庫(kù)篩選得到的顯然只是特定基因探針。對(duì)于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質(zhì)的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質(zhì)，然后測(cè)定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫(kù)中篩選，陽(yáng)性克隆即是目標(biāo)蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞DNA 組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內(nèi)含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA 探針用于檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)雜交效率要明顯低于cDNA 探針。DNA 探針（包括cDNA 探針）的主要優(yōu)點(diǎn)有下面三點(diǎn)：這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡(jiǎn)便。DNA

43、 探針不易降解（相對(duì)RNA 而言），一般能有效抑制DNA 酶活性。 DNA 探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR 標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。（二） cDNA 探針cDNA （complementary DNA ）是指互補(bǔ)于mRNA 的 DNA 分子。 cDNA 是由 RNA 經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）的 DNA 聚合酶催化產(chǎn)生的，這種逆錄酶是Temin 等在 70 年代初研究致癌RNA 病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對(duì)原則，按照RNA 的核苷酸順序合成DNA （其中 U 與 A 配對(duì)）。這一途徑與

44、一般遺傳信息流的方向.'.相反，故稱反向轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA 在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA ，并進(jìn)而整合人宿主細(xì)胞染色體DNA 分子，隨宿主細(xì)胞DNA 復(fù)制同時(shí)復(fù)制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達(dá)，故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制，如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變，后來發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA 病毒中，而且哺乳動(dòng)物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞也含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP 為底物， RNA 為模板， tRNA （主要是色氨酸t(yī)RNA ）為引物，在Trna3

45、-OH 末端上，53方向，合成與RNA 互補(bǔ)的 DNA 單鏈，稱為互補(bǔ)DNA （ cDNA ），單鏈 cDNA 與模板 RNA 形成 RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H 活性作用下，將RNA 鏈水解成小片段。cDNA 單鏈的 3末端回折形成一個(gè)小引物末端，逆轉(zhuǎn)錄酶又以第一條cDNA 鏈為模板再合成第二第cDNA 鏈，至此，完成逆轉(zhuǎn)錄全過程，合成雙鏈cDNA 。逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶已商品化，最常用的有AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核Mrna3末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)

46、）用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)于mRNA 的 cRNA 鏈，然后再用RNase H 將 mRNA 消化掉，再加入大腸桿菌的DNA 聚合酶 I催化合成另一條DNA 鏈，即完成了從mRNA 到雙鏈 DNA 的逆轉(zhuǎn)錄過程。所得到的雙鏈cDNA 分子經(jīng) S1 核酸酶切平兩端后接一個(gè)有限制酶切點(diǎn)的接頭（ linker ），再經(jīng)特定的限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補(bǔ)末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是噬菌體 DNA ，如 gt， EMBL 和 Charon 系列等。用這類載體可以得到包含104 以上的轉(zhuǎn)化子的文庫(kù)，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA 探針不含有內(nèi)含子序

47、列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測(cè)。（三） RNA 探針RNA 探針是一類很有前途的核酸探針，由于 RNA 是單鏈分子， 所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA 探針和病毒RNA 探針，這些 RNA 是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA 探針主要用于研究目的，而不是用于檢測(cè)。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（ HIV ）的基因組DNA 克隆時(shí)，因無DNA 探針可利用，就利用HIV 的全套標(biāo)記mRNA 作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組 DNA 克隆。又如進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析（nuclear run on

48、 transcrip tion assay）時(shí)，在體外將細(xì)胞核分離出來，然后在-32P-ATP 的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所合成mR NA 均摻入同位素而得到標(biāo)記，此混合mRNA 與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA 進(jìn)行雜交，便可反映出該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是一種反向探針實(shí)驗(yàn)技術(shù)。近幾年體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP 和 pGEM ，這類載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6 啟動(dòng)子和T7 啟動(dòng)子，在SP6RNA 聚合酶或T7RNA 聚合酶作用下可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA 片段，則可以此DNA 兩條鏈中

49、的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA 。這種體外轉(zhuǎn).'.錄反應(yīng)效率很高，在1h 內(nèi)可合成近10g的 RNA 產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的NTP，則所合成的RNA 可得到高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長(zhǎng)度并可提高標(biāo)記物的利用率。值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA 聚合酶，可以控制RNA 的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉(zhuǎn)錄RNA 。這種可以得到同義RNA 探針（與 mRNA 同序列）和反義RNA 探針（與 mRNA 互補(bǔ)），反義RNA 又稱 cRNA ，除可用于反義核酸研究外，還可用于檢測(cè)mRNA 的表達(dá)水平。在這種情況下，因?yàn)樘结樅桶行蛄芯鶠閱捂?/p>

50、，所以雜交的效率要比 DNA-DNA 雜交高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。 RNA 探針除可用于檢測(cè) DNA 和 mRNA 外，還有一個(gè)重要用途，在研究基因表達(dá)時(shí)， 常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源基因不僅進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄，有時(shí)還存在反向轉(zhuǎn)錄（即生成反義 RNA ），這種現(xiàn)象往往是外源基因表達(dá)不高的重要原因。另外，在真核系統(tǒng)，某些基因也存在反向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生反義RNA ，參與自身表達(dá)的調(diào)控。在這些情況下，要準(zhǔn)確測(cè)定正向和反向轉(zhuǎn)錄水平就不能用雙鏈DNA 探針，而只能用RNA 探針或單鏈DNA 探針。綜上所述， RNA 探針和 cRNA 探針具有 DNA 探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA 探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點(diǎn)。（四）寡核酸探針前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA 序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測(cè)序時(shí)，也常應(yīng)用克隆。克隆探針一般較寡核苷酸探針特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度而言，較長(zhǎng)的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會(huì)較短序列少，克隆探針的另一優(yōu)點(diǎn)是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號(hào)，因?yàn)榭寺√结樰^寡核苷酸探針摻入的可檢測(cè)標(biāo)記基因更多。但是，較長(zhǎng)的探針對(duì)于靶序列變異的識(shí)別能力又有所降低