滅活柯薩奇B1　病毒在原代培養(yǎng)骨骼肌細胞中促進基因轉(zhuǎn)移的研究

1、    滅活柯薩奇B1病毒在原代培養(yǎng)骨骼肌細胞中 促進基因轉(zhuǎn)移的研究        【摘要】目的研究滅活后的柯薩奇病毒B1(Coxsakie virus B1,CVB1)在原代培養(yǎng)骨骼肌細胞中，對報道基因pCDNA3-LacZ轉(zhuǎn)移效率的影響。方法用聚乙二醇沉淀和蔗糖低溫超速離心法提純并用-丙內(nèi)酯滅活病毒，將滅活CVB1、轉(zhuǎn)鐵蛋白聚賴氨酸(TfpL)和報道基因設計成不同濃度組合，觀察肌肉細胞中-半乳糖苷酶染色陽性的細胞數(shù)。結(jié)果滅活CVB1+TfpL+LacZ在肌肉細胞

2、中使基因轉(zhuǎn)移效率由TfpL+LacZ組的不到1%提高到15%20%。結(jié)論滅活CVB1也能像腺病毒一樣促進基因轉(zhuǎn)移，CVB1的嗜肌肉特性，為在肌肉組織中研究靶向明確的新載體提供了實驗依據(jù)?！娟P鍵詞】柯薩奇B1病毒骨骼肌細胞基因 Gene transfer efficiency enhancement by inactivated Coxsakie virus B1 in primary skeletal muscle cellsCHEN Guojun*, LIU Zhuolin, ZHANG Chen, JIANG Lifang, CHEN Yuan, FANG Danyun, YAN Huij

3、un.* Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080 P.R.China.E-mail:gjchen【Abstract】ObjectiveTo study the effect of inactivated Coxsackie virus B1(CVB1), which was considered to have high affinity to skeletal muscle cells, on ge

4、ne transfer efficiency of reporter gene, pCDNA3-LacZ, in primary muscle cells.MethodsViruses were purified by polyethylene sedimentation followed by sucrose supercentrifugation. Virus, transferrin-polylysine(TfpL) and LacZ were designed as different concentrations and groups, then positive cells con

5、tained -galactosidase were calculated as gene transfer efficiency.ResultsInactivated CVB1 made an enhancement of gene transfer efficiency from less than 1% in TfpL+LacZ group to 15-20 per cent in CVB1+TfpL+LacZ group.ConclusionLike adenovirus, inactivated CVB1 can also increase gene transfer efficie

6、ncy in muscle cells, which provides experimental basis for constructing new vector targeting to muscel cells.【Key words】Coxsackie virus B1Skeletal muscle cellGene在肌肉細胞的基因轉(zhuǎn)移中，目前最常用的是腺病毒(adenovirus, AV)載體。AV降解溶酶體的特性，還促進了HeLa細胞中轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf)-聚賴氨酸(polylysine, pL)介導的報道基因轉(zhuǎn)移，效率比TfpL-DNA復合物提高了1000倍1。

7、更有意義的是，在肌細胞中采用該法將滅活AV攜帶報道基因獲得成功，并且宿主的排異反應大為降低，報道基因表達時間延長而基因轉(zhuǎn)移效率并沒有明顯降低2。但AV載體靶細胞范圍廣泛也正意味著對肌細胞的特異性不高?？滤_奇B1病毒(Coxsackie virus B1, CVB1)是一種小而無囊膜的單鏈正股RNA病毒，直徑為28 nm，現(xiàn)已將CVB1用來制備穩(wěn)定的實驗性肌炎模型。已經(jīng)證明CVB1具有嗜肌肉特性并認為與病毒的外殼蛋白有關3，4，目前尚不能將CVB1制成疫苗。為此，我們將滅活CVB1、TfpL和報道基因pCDNA3-LacZ設計成不同濃度和不同組合，在原代培養(yǎng)骨骼肌細胞中進行了基因轉(zhuǎn)移研究，希望在

8、靶向于肌肉細胞的基因治療中探索一種新思路。1材料與方法1.1CVB1病毒購自中國預防醫(yī)學科學院毒種室。質(zhì)粒：pCDNA3-LacZ長約8kb，由巨細胞病毒啟動子驅(qū)動，本室保存。TfpL為Sigma公司產(chǎn)品。1.2CVB1提純和滅活參照文獻5，6報道的方法加以修改。簡言之，聚乙二醇沉淀法將病毒懸液初步濃縮；在10%50%蔗糖梯度中上樣，低溫超速分步離心；電鏡觀察并做病毒活性測定；-丙內(nèi)酯(-propiolactone, BPL)2%濃度滅活，測定殘存毒力7。1.3原代骨骼肌細胞培養(yǎng)8取13天新生SD大鼠，斷頭處死，消毒并取前后肢，去皮去骨并剪碎，胰酶消化3060分鐘，50m不銹鋼網(wǎng)過濾，常溫下1

9、000r/min離心10分鐘。無血清混合培養(yǎng)基重懸，計數(shù)并接種于6孔板內(nèi)，每孔105個細胞。前3天每天換液(F-10DMEM高糖培養(yǎng)基=5050，10%小牛血清)，3天后隔天換液。1.4基因轉(zhuǎn)移試驗(1)肌細胞培養(yǎng)至第3天時，細胞的50%80%融合，試驗前吸去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗一次。(2)液為pCDNA3分別按3 g、6 g、15 g和50 g溶于20 mmol/L HEPES(含有150mmol/L NaCl)100l中。液為TfpL分別按10g、20g和30g溶于20mmol/L HEPES(含有150mmol/L NaCl)100l中。使用前取溶液緩慢逐滴加入溶液中，總量達200l

10、，室溫靜置30分鐘。(3)將上述液體加入6孔板內(nèi)的細胞中，然后加800l無血清混合培養(yǎng)基，隨后各加入6l、10l和20l的滅活CVB1液(6.4×1012病毒顆粒/ml)，對照組加入同體積的病毒貯存液。37繼續(xù)培養(yǎng)46小時，取出后加入12.5%的混合培養(yǎng)基4ml，繼續(xù)培養(yǎng)20小時。(4)換液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。1.5X-gal染色參照文獻9的方法。1.6陽性細胞計數(shù)每個顯微鏡視野計取每1000個細胞中X-gal染色陽性的肌細胞數(shù)。2結(jié)果2.1各種濃度的質(zhì)粒和TfpL對轉(zhuǎn)染效率的影響經(jīng)酚-氯仿提取后的質(zhì)粒能滿足一般的基因轉(zhuǎn)移需要。本實驗中15 g DNA與10 g TfpL為最佳組合，出

11、現(xiàn)了1%2%的陽性細胞。即DNA與TfpL之比為32(1)。由1可見，被染藍的部分位于細胞漿內(nèi)，細胞形態(tài)保持良好(箭頭所指，下同)。1TfpL組出現(xiàn)1%2%的陽性細胞Fig 11%-2% positive cells in TfpL group2.2CVB1與TfpL協(xié)同作用，使基因轉(zhuǎn)移效率大為提高。10l CVB1(6.4×1010)組產(chǎn)生了5%左右的陽性細胞(2)。當15 g DNA、10 g TfpL與10 l CVB1一起加進骨骼肌細胞時，被染藍的細胞數(shù)增至15%20%，見3，4。說明CVB1促進了TfpL在肌細胞中受體介導的基因轉(zhuǎn)移。質(zhì)粒DNA、TfpL與CVB1的不同組合

12、對基因轉(zhuǎn)移效率的影響見表1。2CVB1組出現(xiàn)5%的陽性細胞Fig 25% positive cells in CVB1 group3CVB1+TfpL組陽性細胞增至15%20%(×10)Fig 3Positive cells increased to 15%-20% in CVB1+TfpL group(×10)4CVB1+TfpL組陽性細胞增至15%20%(×40)Fig 4Positive cells increased to 15%-20% in CVB1+TfpL group(×40)表1質(zhì)粒DNA、TfpL與CVB1的不同組合對基因轉(zhuǎn)移效率的影

13、響Tab 1The effect of different combinations of DNA,TfpL and CVB1 on gene transfer efficiencyDifferent combinations(各種組合)Percentage of positive cells(陽性百分數(shù))(%)pCDNA3 lacZ+TfpL12pCDNA3 lacZ+CVB15pCDNA3 lacZ+TfpL+CVB115203討論 實驗中，單純質(zhì)粒DNA用至50g都未獲得陽性結(jié)果，TfpL組的轉(zhuǎn)移效率僅為1%左右?？赡芘c肌細胞膜屏障有關，但確切原因還不清楚。CVB1組獲得了5%陽性細胞，

14、說明CVB1具有促進基因轉(zhuǎn)移的作用，已經(jīng)證明，CVB1感染在HEP-2細胞中能增加細胞通透性，促進細菌入侵10。滅活CVB1與TfpL共同作用，使轉(zhuǎn)移效率增加到15%20%，推測CVB1使肌細胞對DNA攝取增加，或可能降低了溶酶體對外源物質(zhì)破壞的能力 。實驗說明，滅活CVB1也能象滅活AV一樣促進基因轉(zhuǎn)移，用滅活CVB1構(gòu)建的載體，體積小于AV復合物，有可能在越過細胞的分子屏障中發(fā)揮優(yōu)于AV的作用。滅活CVB1同時避免了因活病毒所引起的免疫損傷，由此構(gòu)建的CVB1-pL-DNA復合物同時具有靶向明確和促進基因轉(zhuǎn)移的特點，簡單操作，效率高。實驗的意義還在于，用組織特異性滅活病毒作載體，將作為一種

15、新思路，不僅為肌肉病，而且還為其它組織疾病的基因治療如滅活肝炎病毒治療肝癌，滅活腦炎病毒治療腦組織退行性疾病提供了一種靶向明確的、高效的基因轉(zhuǎn)移方法。本課題受國家自然科學基金(39800045)和衛(wèi)生部臨床重點項目基金(97040229)資助作者單位：陳國俊劉焯霖張成（510080廣州，中山醫(yī)科大學附一院神經(jīng)內(nèi)科）江麗芳陳元方丹云晏輝鈞（微生物學教研室）參考文獻1Curiel DT, Agarwal S, Wagner E, et al.Adenovirus-enhancment of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Na

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