異丙酚對(duì)沙土鼠全腦缺血再灌注后腦保護(hù)作用研究

1、異丙酚對(duì)沙土鼠全腦缺血再灌注后腦保護(hù)作用研究         11-04-01 09:25:00     編輯：studa20                   作者：沈?qū)帲?甘小亮， 黑子清， 龐紅宇， 羅剛健 【摘要】  【目的】 觀察異丙酚對(duì)沙土鼠全腦缺血再灌注后腦保護(hù)作

2、用?！痉椒ā?27只雄性清潔級(jí)蒙古沙土鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、異丙酚組，每組9例。對(duì)照組：游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不阻斷腦血流。模型組： 游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并阻斷腦血流，10 min后開放動(dòng)脈，2 h后取材。異丙酚組：在開放動(dòng)脈后即經(jīng)舌靜脈以Grassby3000微量泵持續(xù)以10 mg·kg-1·h-1的速度輸注異丙酚，2 h后取材。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死動(dòng)物取腦組織分別固定后行HE染色光鏡觀察，免疫組化SP染色類胰蛋白酶表達(dá)觀察，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)，腦含水量測(cè)定，腦組織勻漿測(cè)定MDA含量、SOD活性、TNF-和IL-1含量?！窘Y(jié)果】 模型組和異丙酚組腦組織含水量高于對(duì)照組(P &

3、lt; 0.05)，異丙酚組低于模型組(P < 0.05)。光鏡下及電鏡下模型組腦組織損傷嚴(yán)重，異丙酚組損傷較輕，對(duì)照組腦組織結(jié)構(gòu)基本正常 。三組中， MDA含量、TNF-濃度、IL-1含量、類胰蛋白酶表達(dá)以模型組最高(P < 0.05)。SOD活性以模型組最低(P < 0.05)。 【結(jié)論】 異丙酚對(duì)沙土鼠全腦缺血再灌注后有明顯的腦保護(hù)作用，其機(jī)理與抗氧化及抑制炎性因子釋放相關(guān)，而肥大細(xì)胞也可能參與了腦缺血再灌注損傷。 【關(guān)鍵詞】  異丙酚; 腦; 缺血再灌注; 類胰蛋白酶Abstract： 【Objective】 This study was designed

4、to observe the protective effects of propofol on global cerebral ischemia-reperfusion injury and changes of malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD) activity， tumor necrosis factor-alpha (TNF-)， interleukin-1beta (IL-1) and the expression of tryptase in brain of gerbils. 【Methods】 Twenty-se

5、ven healthy gerbils (55-70 g)， were randomly divided into three groups： control group (n = 8， sham operation having surgical procedures without bilateral carotid arteries occlusion)， model group (n = 8， having surgical procedures with bilateral carotid arteries occlusion)， propofol group (n = 8， hav

6、ing the same surgical procedures with bilateral carotid arteries occlusion， and propofol i.v. by Grassby 3000 syringe pump with the speed of 10 mg/kg/h via lingual vein). The animals were then killed and the thalamus opticus were removed as soon as the experiment was over. The thalamus opticus was f

7、ixed by formaldehyde. HE dyeing before observation under light microscope and use of immunohistochemistry method with SP dyeing to observe the expression of tryptase. The surplus left brain tissue were made into tissue homogenate and preserved at -40 to determine the content of MDA， SOD activity， TN

8、F-， and IL-1. The right brain tissues were got wet weight and dry weight respectively to calculate the moisture capacity of brain with Eliot formula. Furthermore， we take an animal from three groups respectively to observe the ultramicrostructure of brain by electron microscopy. 【Results】 Moisture c

9、apacity of brain of model group was the highest among three groups while that of propofol group is less than model group (P < 0.05). The outcomes of light microscope showed that damage of brain tissue of model group was most severe among the three groups and the contents of MDA， TNF-， IL-1 and tr

10、yptase of model group was also highest as well. Contents of MDA of propofol group decreased obviously compared with model group. The SOD activity was the lowest in the model group. 【Conclusion】 Propofol can protect ischemia-reperfusion injury in brain by antioxygen and refraining inflammatory factor

11、s and mast cell perhaps play an important role during the development of ischemia-reperfusion injury.腦缺血再灌注時(shí)，肥大細(xì)胞存在大量活化現(xiàn)象，腦缺血后肥大細(xì)胞出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象可能在腦缺血再灌注損傷中起了重要作用，而脫顆粒釋放的炎癥介質(zhì)又可進(jìn)一步加重組織的炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)1。因此，我們?cè)O(shè)想：在腦缺血-再灌注過程中肥大細(xì)胞活化可能是導(dǎo)致腦損傷加重的重要環(huán)節(jié)之一。異丙酚是臨床十分常用的麻醉鎮(zhèn)靜藥2-3，有研究顯示異丙酚具有一定的腦保護(hù)作用4。另外，一些學(xué)者觀察到異丙酚對(duì)肥大細(xì)胞活化和脫顆粒有抑制

12、作用，但用異丙酚在腦缺血-再灌注過程中來干預(yù)這一環(huán)節(jié)進(jìn)行防治的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究異丙酚干預(yù)沙土鼠腦缺血再灌注后氧化產(chǎn)物、炎性細(xì)胞因子及腦內(nèi)肥大細(xì)胞標(biāo)志物類胰蛋白酶變化，并通過對(duì)缺血腦組織光鏡及超微結(jié)構(gòu)的觀察，進(jìn)一步說明異丙酚對(duì)腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，為異丙酚在臨床上的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 動(dòng)物分組健康，雄性清潔級(jí)蒙古沙土鼠27只，體質(zhì)量55 70 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：0001382。在實(shí)驗(yàn)前均在衛(wèi)生的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。沙土鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組(control)，游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不阻斷腦血流。模型組(model)：

13、游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并阻斷腦血流，10 min后開放動(dòng)脈，2 h后取材。異丙酚組(propofol)：在開放動(dòng)脈后即經(jīng)舌靜脈以Grassby3000微量泵持續(xù)以10 mg·kg-1·h-1的速度輸注異丙酚(AstraZeneca，Italy) 2 h后取材。1.2 動(dòng)物模型建立30 g/L戊巴比妥鈉45 mg·kg-1腹腔注射麻醉，將動(dòng)物仰臥在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剪開頸部正中皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈、套線，然后用微動(dòng)脈夾同時(shí)阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流造成腦缺血，檢查遠(yuǎn)端血流情況以確保完全阻斷血流。腦缺血時(shí)間為10 min，松開動(dòng)脈夾恢復(fù)腦血流即為再灌注。對(duì)照組僅游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈但不阻斷

14、腦血流。1.3 標(biāo)本處理斷頭處死動(dòng)物(每組8只)，快速取出腦組織并取丘腦約1 cm3， 40 g/L多聚甲醛溶液固定，病理切片，HE染色光鏡觀察及免疫組化SP染色類胰蛋白酶表達(dá)，剩余腦組織正中矢狀切分左右大腦，左側(cè)制成組織勻漿，-40 保存，測(cè)定MDA、SOD、TNF-、IL1-。右側(cè)腦組織取出后迅速吸盡表面水份，用于腦含水量的測(cè)定。另取模型組、對(duì)照組、異丙酚組動(dòng)物各一只，運(yùn)用左心室灌注固定取材方法，于左心室處注入25 g/L戊二醛(sigma，USA)約100 mL，將其全身灌注固定，冰皿上斷頭從丘腦區(qū)同一部位取材，體積約1 mm3大小，立即放入25 g/L戊二醛緩沖液中固定4 h，用10

15、g/L鋨酸(sigma，USA)作用2 h，梯度酒精脫水，Epon812包埋，超薄切片，經(jīng)電子染色，用H-600透射電鏡(HITACHI，JAPAN)觀察超微結(jié)構(gòu)。1.4 觀察指標(biāo)在光鏡下(LEICA，GERMANY)觀察腦組織病理?yè)p傷情況。透射電鏡下(H-600 HITACHI，JAPAN)觀察超微結(jié)構(gòu)變化。右側(cè)腦組織用分析天平稱取濕質(zhì)量后放入105 恒溫烤箱，烘烤48 h后稱取干質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水量(用Eliot公式計(jì)算，含水量(%) = (濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量 × 100%)。采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定MDA含量。黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。采用ELISA方法測(cè)定TNF

16、-含量和IL-1含量。丘腦組織免疫組化SP染色肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)、計(jì)數(shù)。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差(x ± s)表示，采用方差分析比較各組的差異。取 = 0.05。2 結(jié) 果2.1 丘腦組織HE染色病理學(xué)結(jié)果對(duì)照組：腦組織均勻，神經(jīng)元排列整齊、致密，胞核無(wú)固縮、變形，胞漿無(wú)水腫;異丙酚組：腦組織損傷較輕，大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，少數(shù)神經(jīng)元胞核固縮，胞漿水腫;模型組：腦組織損傷明顯，出現(xiàn)大片液化壞死區(qū)域，神經(jīng)元壞死性變性，胞核固化、溶解、消失，細(xì)胞周邊呈扇形空泡改變(圖1)。2.2 丘腦組織超微結(jié)構(gòu)變化對(duì)照組：神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，胞核及胞漿結(jié)構(gòu)正常，線粒體

17、無(wú)腫脹，嵴清晰。異丙酚組：神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，胞核無(wú)固縮，線粒體稍腫脹，嵴稍模糊，管周稍水腫;模型組：膠質(zhì)細(xì)胞破裂、溶解，周圍神經(jīng)氈腫脹，神經(jīng)元胞核固縮，線粒體腫脹，嵴消失，管周水腫(圖2)。2.2 腦組織含水量.腦組織含水量模型組顯著升高(P < 0.05)，異丙酚組低于模型組和高于對(duì)照組(P < 0.05;表1)。2.3 腦組織SOD活性和MDA含量三組中， SOD活性以模型組最低(P < 0.05)，異丙酚組與對(duì)照組相比，SOD活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)，MDA含量以模型組最高(P < 0.05)，對(duì)照組最低(P < 0.05，表1)。2.4 腦組織TNF-、IL-1含量變化與對(duì)照組比較，模型組TNF-濃度明顯升高(P < 0.05);與模型組相比，異丙酚組TNF-濃度明顯降低(P <