高效液相色譜_熒光法測(cè)定蔬菜中的黃酮

1、營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào) 2009年第 31卷第 2期 191高效液相色譜-熒光法測(cè)定蔬菜中的黃酮Quantitative Determination of Flavonoids in vegetable by HPLC withfluorescence detector吳 波,張寒俊,胡志雄(武漢工業(yè)學(xué)院分析測(cè)試中心 WU Bo, ZHANG Han-jun, HU Zi-xiong(Center of Analysis and Measurement, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China 在日常膳食中,黃酮類物質(zhì)通常表現(xiàn)為具有抗氧化性的羥基衍

2、生物形態(tài),天然來(lái)源的生物黃酮分子量小,能被人體迅速吸收,具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等生物活性。本研究旨在建立用高效液相-熒光法對(duì)蔬菜中黃酮進(jìn)行測(cè)定1,2。1 對(duì) 象 與 方 法1.1 儀器VARIAN ProStar 210泵;7725I 型手動(dòng)進(jìn)樣器;VARIAN363熒光檢測(cè)器;ProStar335PDA(二級(jí)管陣列檢測(cè)器;Waters 柱后衍生系統(tǒng)。1.2 試劑槲皮素(quercetin QU (含量98%國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司 ,桑色素(morin hydtate MO(含量98%購(gòu)于 Fluka ,山奈酚(kaempferolKA (含量98%上海友思 ; 異鼠李素 (isorham

3、ne- tin ISO (含量99%中國(guó)藥品生物制品檢定所 ; 甲醇(色譜純 ;水(自制雙重蒸餾水 ;其它試 劑為分析純。所有樣品購(gòu)于武漢商儲(chǔ)市場(chǎng)。 1.3 方法 1.3.1樣品處理 4,5:稱取搗碎的豆角、青椒、四 季豆、湯菜、莧菜、小白菜、油麥菜、韭菜花、 小蔥濕樣約 30 g于 250 ml碘量瓶中,準(zhǔn)確加入 100 ml無(wú)水乙醇,稱重,50振蕩浸取 2 h后,補(bǔ) 足乙醇,搖勻。取 5.00 ml浸取液,加入 1 ml濃 HCl(含 0.2 g/ml苯酚通 N 2、封口,在 80下水 解 2 h后,用無(wú)水乙醇定容于 10 ml量瓶中,置 于冰箱中(-20冷凍 1 h,取出超聲波振蕩 5

4、min,后(10 000 r/min, 40s離心,待測(cè)。 1.3.2色譜條件:色譜柱:Nucleodur C18(4.6×250 mm,5 m,流動(dòng)相:A相為 0.1 mol/L HAc, B 為甲醇;流速 0.30 ml/min;柱溫 40;進(jìn)樣 20 l 。 梯 度 程 序 :08 min, A 70%25%, B 30%75%; 815 min, A-B(25:75; 15 15.06 min, A 25%0%,B 75%100%; 15.06 20.1 min,A-B(0:100;20.120.12 min, A 0% 70%, B 100%30%。激發(fā)波長(zhǎng) 438 nm,

5、發(fā)射波長(zhǎng) 483 nm。 1.3.3對(duì)照品溶液配制:準(zhǔn)確稱取桑色素、槲皮 素、山奈酚和異鼠李素各 5.00 mg,用無(wú)水乙醇 溶解并分別定容在 10 ml的量瓶中,分別得到 0.50 g/L,相應(yīng)的黃酮對(duì)照品儲(chǔ)備液,避光保存。 1.3.4衍生劑配制:聚氧乙烯月桂醚 0.3 g,冰 醋酸 1.5 ml,60% AlNO3 1 ml,溶于 500 ml無(wú)水乙 醇,衍生泵流速 1.00 ml/min,衍生圈長(zhǎng) 1 m。 2 結(jié) 果 2.1 系統(tǒng)適用性 (圖1 桑色素、槲皮素、山奈酚和異鼠李素在本色譜條件下其保留值分別為 23.1、24.4、27.4、 28.1 min。用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)桑色素、槲

6、皮 素、山奈酚、異鼠李素相應(yīng)色譜峰上不同點(diǎn)位上 (200400 nm與相應(yīng)對(duì)照品的紫外光譜是一致 的,證明該峰就是相應(yīng)對(duì)照品的色譜峰(圖 1。 2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與檢出限(表 1 分別準(zhǔn)確量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 5、10、20、40、80、 160l, 用無(wú)水乙醇配成相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液, 進(jìn)樣 20 l。以相應(yīng)組分的色譜峰面積(Y對(duì)其收稿日期 2008-12-12 作者簡(jiǎn)介 吳波(1962- ,男,碩士,副教授, E-mail:wb中圖分類號(hào) R151.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 0512-7955(200902-0191-02濃度(X g/ml作線性回歸。在選定色譜條件下,測(cè)定桑色素、槲皮素、

7、 山奈酚、異鼠李素的檢測(cè)限,結(jié)果表明檢測(cè)限 (S/N=3分別為2、1、3、3 ng。 A :standard solution; B :sample solution; 1. morin hydtate;2. quercetin 3. kaempferol 4. isorhamnetin Fig.1 Chromatograms of standard and sample solution(small colzaTable 1 Linear relation of the flavonoidsComponent Linear equation r Linear range (mg/LMO y=

8、239558x-125773 0.9997 0.25-8.0 QU y=103938x-32804 0.9994 0.25-8.0 KA y=76814x-27192 0.9998 0.25-8.0 ISO y=45338x-27762 0.9996 0.25-8.02.3 方法回收率取已知量(桑色素未檢出;槲皮素3.46 mg/kg; 山奈酚40.5 mg/kg;異鼠李素7.12 mg/kg的小白 菜15.00 g,精密加入桑色素、槲皮素、山奈酚、異 鼠李素對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.10、1.00、0.20 ml ,同1.2.1方法制備溶液,按上述色譜條件測(cè)定,樣 品中桑色素、槲皮素、山奈酚、異鼠李

9、素的平均 回收率分別(n =3為93.1%、 93.5%、 98.1%、 102.7%, RSD分別為1.97%、2.35%、2.19%、2.29%。表明回 收率良好。2.4 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取濃度分別為1.00 mg/L桑色素、槲皮素、山 奈酚、異鼠李素的對(duì)照品混合液,重復(fù)5次進(jìn)樣, 測(cè) 定 其 峰 面 積 ,計(jì) 算 相 應(yīng) 的 RSD分 別 為 1.61%、 2.09%、2.29%、2.37%,將上述對(duì)照品混合液分 別在室溫放置0、2、4、6、8、18、24 h進(jìn)樣,測(cè) 定相應(yīng)的峰面積, 其波動(dòng)RSD<3%; 取同一批小白 菜樣品共5份,重復(fù)測(cè)定,求得槲皮素、 山奈酚、 異

10、 鼠李素RSD為2.02%、2.36%、2.01%。 2.5 樣品的測(cè)定(表 2將桑色素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素的對(duì) 照品儲(chǔ)備液用乙醇逐級(jí)稀釋、 混合,配成對(duì)照品溶液系列,分別進(jìn)樣20 l;對(duì)樣品按“1.2.1”項(xiàng)進(jìn)行處理,進(jìn)樣20 l。采用外標(biāo)法計(jì)算。Table 2 The flavonoids determined in vegetables(n =3Component (mg/kg SampleMO QU KA ISO1 2.50±0.079 ND ND 2 8.06±0.10 ND ND 3 3.07±0.11 ND ND4 <1.60 3.62&

11、#177;0.12ND5 <1.60 3.26±0.12ND6 3.46±0.13 40.5±1.357.12±0.287 8.79±0.21 ND ND 8 11.3±0.19 60.1±1.18ND 9 ND10.7±0.32 18.2±0.61ND ND :not detected; 1 cowpea (豆角 ; 2 blue junction (青椒 ; 3 jack bean (四季豆 ; 4 tang cai (湯菜 ; 5 three-color amaranth (莧菜 ; 6 sm

12、all colza (小白菜 ; 7 naked oats vegetable (油麥菜 ;8 fragrant-flowered garlic cauliflower(韭菜花 ; 9 shallot(小蔥3 結(jié) 論(1 采用熒光檢測(cè)器, 其響應(yīng)信號(hào)的選擇性 要好于紫外檢測(cè)器。 (2柱后衍生時(shí),其溶劑極 性對(duì)黃酮所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度有影響,乙醇所占的 比例要大于90%。 (3 流動(dòng)相中不能添加磷酸, 以 避免相應(yīng)沉淀物的形成。關(guān)鍵詞:槲皮素; 桑色素; 山奈酚; 異鼠李素;高效液相色譜法(HPLC; 蔬菜Key words:quercetin ; morinhydrate ; kaempferol ;isorhamnetin ; HPLC ; vegetable參 考 文 獻(xiàn)1 徐靜,郭長(zhǎng)江,韋京豫,等. 蔬菜中類黃酮物質(zhì)的高效液相色譜測(cè)定法J.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2005,27:276-279.2 陳曉嵐,于斐,屈凌波,等.熒光及ESI質(zhì)譜法研究溶菌 酶 與 磷 酰 化 黃 酮 的 相 互 作 用 J. 化 學(xué) 學(xué) 報(bào) , 2