微生物限度檢查法

1、.微生物限度檢查法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)、控制菌檢查及活螨的檢查。2依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國藥典藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)YBB00132002藥品包裝用復(fù)合膜、袋通則3 人員資質(zhì)及培訓(xùn)3.1 從事藥品微生物檢驗(yàn)工作的負(fù)責(zé)人應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識(shí)的教育背景。3.2 檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)所在崗位和職責(zé)接受相應(yīng)的培訓(xùn)，在確認(rèn)可以承擔(dān)某一試驗(yàn)前，不能獨(dú)立從事該項(xiàng)微生物試驗(yàn)。應(yīng)保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必需的設(shè)備操作、微生物檢驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定所有級(jí)別實(shí)驗(yàn)人員的繼續(xù)教育計(jì)劃。3.3 檢驗(yàn)

2、人員必須熟悉相關(guān)檢驗(yàn)方法、程序、檢測(cè)目的和結(jié)果評(píng)價(jià)。3.4 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)通過參加內(nèi)部質(zhì)量控制、能力驗(yàn)證或使用標(biāo)準(zhǔn)菌株等方法客觀評(píng)價(jià)檢驗(yàn)人員的能力，必要時(shí)對(duì)其進(jìn)行再培訓(xùn)并重新評(píng)估。當(dāng)使用一種非經(jīng)常使用的方法或技術(shù)時(shí)，有必要在檢測(cè)前確認(rèn)微生物檢測(cè)人員的操作技能。 4 培養(yǎng)基4.1 培養(yǎng)基的制備4.1.1 培養(yǎng)基可按處方配制。也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。4.1.2 在制備培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)選擇質(zhì)量符合要求的脫水培養(yǎng)基或單獨(dú)配方組分進(jìn)行配制。脫水培養(yǎng)基應(yīng)附有處方和使用說明，配制時(shí)應(yīng)按使用說明上的要求操作以確保培養(yǎng)基的質(zhì)量符合要求，不得使用結(jié)塊或顏色發(fā)生改變的脫水培養(yǎng)基。4.1.3 脫水培養(yǎng)基或單獨(dú)

3、配方組分應(yīng)在適當(dāng)?shù)臈l件下貯藏，如低溫、干燥和避光，所有的容器應(yīng)密閉，尤其是盛放脫水培養(yǎng)基的容器。商品化的成品培養(yǎng)基除了應(yīng)附有處方和使用說明外，還應(yīng)注明有效期、貯藏條件、適用性檢查試驗(yàn)的質(zhì)控菌和用途。4.1.4 為保證培養(yǎng)基質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，各脫水培養(yǎng)基或各配方組分應(yīng)準(zhǔn)確稱量，并要求有一定的精確度。配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水，特殊情況下，可能需要去離子水和蒸餾水。應(yīng)記錄各稱量物的重量和水的使用量。4.1.5 配制培養(yǎng)基所用容器和配套器具應(yīng)潔凈，可用純化水沖洗玻璃器皿以消除清潔劑和外來物質(zhì)的殘留。對(duì)熱敏感的培養(yǎng)基如糖發(fā)酵培養(yǎng)基其分裝容器一般應(yīng)預(yù)先進(jìn)行滅菌，以保證培養(yǎng)基的無菌性。4.1.6 脫水培

4、養(yǎng)基應(yīng)完全溶解于水中，再進(jìn)行分裝和滅菌。配制時(shí)若需要加熱助溶，應(yīng)注意不要過度加熱，以避免培養(yǎng)基顏色變深。如需要添加其它組分時(shí)，加入后應(yīng)充分混勻。4.1.7 應(yīng)按照生產(chǎn)商提供或使用者驗(yàn)證的參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)基的滅菌。培養(yǎng)基滅菌一般采用濕熱滅菌技術(shù)，特殊培養(yǎng)基可采用薄膜過濾法除菌。培養(yǎng)基滅菌程序應(yīng)采用驗(yàn)證的滅菌程序滅菌，培養(yǎng)基滅菌方法和條件，應(yīng)通過無菌性和促生長(zhǎng)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，對(duì)高壓滅菌器的蒸汽循環(huán)系統(tǒng)也要加以驗(yàn)證，以保證在一定裝載方式下的正常熱分布，溫度緩慢上升的高壓滅菌器可能導(dǎo)致培養(yǎng)基的過熱，過度滅菌可能會(huì)破壞大多數(shù)的細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基促生長(zhǎng)的質(zhì)量。滅菌器中培養(yǎng)基的容積和裝載方式也將影響加熱的速度

5、。因此，應(yīng)根據(jù)滅菌培養(yǎng)基的特性，進(jìn)行全面的滅菌程序驗(yàn)證。4.1.8 應(yīng)確定每批培養(yǎng)基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25測(cè)定）。若培養(yǎng)基處方中未列出pH值的范圍，除非經(jīng)驗(yàn)證表明培養(yǎng)基的pH值允許的變化范圍很寬，否則，pH值的范圍不能超過規(guī)定值0.2。4.1.9 制成平板或分裝于試管的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行下列檢查：容器和蓋子不得破裂，裝量應(yīng)相同，盡量避免形成氣泡，固體培養(yǎng)基表面不得產(chǎn)生裂縫和漣漪，在冷藏溫度下不得形成結(jié)晶，不得污染微生物等。應(yīng)記錄批數(shù)量、有效期，并進(jìn)行培養(yǎng)基的無菌檢查。4.2 培養(yǎng)基的貯藏4.2.1 自制的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)記名稱、批號(hào)、配置日期等信息，并在已驗(yàn)證的條件下貯藏。商品化的成品培養(yǎng)基標(biāo)簽上

6、應(yīng)標(biāo)有名稱、批號(hào)、生產(chǎn)日期、失效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性，生產(chǎn)商和使用者應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基使用說明書上的要求進(jìn)行貯藏，所使用的貯藏和運(yùn)輸條件應(yīng)使成品培養(yǎng)基最低限度的失去水分并提供機(jī)械保護(hù)。4.2.2 培養(yǎng)基應(yīng)避光保存，若要長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于密閉容器中以防止水分流失。瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，一般不超過1周，且應(yīng)密閉包裝，若延長(zhǎng)保存限期，保存期需經(jīng)驗(yàn)證確定。4.2.3 固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化只允許1次，以避免因過度受熱造成培養(yǎng)基質(zhì)量下降或微生物污染。培養(yǎng)基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加熱。若使用微波爐，應(yīng)避免培養(yǎng)基過度受熱及水分的蒸發(fā)，更要注意安全。融化的培養(yǎng)基應(yīng)置4550的水浴中，不得超過8

7、小時(shí)。傾注培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)擦干培養(yǎng)基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴進(jìn)行培養(yǎng)基中造成污染。4.2.4 使用過的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應(yīng)與未使用的培養(yǎng)基分開擺放，并按照規(guī)定程序及時(shí)進(jìn)行處理。4.3 培養(yǎng)基的質(zhì)量控制試驗(yàn)4.3.1 所有配制好的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室配制的培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控項(xiàng)目是pH、適用性檢查試驗(yàn)，定期的穩(wěn)定性檢查以確定有效期。培養(yǎng)基在有效期內(nèi)應(yīng)依據(jù)適用性檢查試驗(yàn)確定培養(yǎng)基質(zhì)量是否符合要求。有效期的長(zhǎng)短將取決于在一定存放條件下（包括容器特性及密閉性）的培養(yǎng)基其組分的穩(wěn)定性。4.3.2 除另有規(guī)定外，在實(shí)驗(yàn)室中，若采用已驗(yàn)證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同

8、一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查試驗(yàn)可只進(jìn)行一次。如果培養(yǎng)基的制備過程未經(jīng)驗(yàn)證，那么每一批培養(yǎng)基培養(yǎng)基均要進(jìn)行適用性檢查試驗(yàn)，試驗(yàn)的菌種可根據(jù)培養(yǎng)基的用途從相關(guān)附錄中進(jìn)行選擇，也可增加從生產(chǎn)環(huán)境及產(chǎn)品中常見的污染菌株。4.3.3 培養(yǎng)基的質(zhì)量控制試驗(yàn)若不符合規(guī)定，應(yīng)尋找不合格的原因，以防止問題重復(fù)出現(xiàn)。任何不符合要求的培養(yǎng)基均不能使用。5 菌種5.1 藥品微生物檢驗(yàn)用的試驗(yàn)菌應(yīng)來自認(rèn)可的國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，或使用與標(biāo)準(zhǔn)菌株所有相關(guān)特性等效的商業(yè)派生菌株。5.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)活或培養(yǎng)物的制備應(yīng)按供應(yīng)商提供的說明或按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行。從國內(nèi)或國外菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過復(fù)活并在適宜的

9、培養(yǎng)基生長(zhǎng)后，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株保存時(shí)，可將培養(yǎng)物等份懸浮于抗冷凍的培養(yǎng)基中，并分裝于小瓶中，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存、超低溫冷凍（低于-30）等方法保存。低于-70或低溫冷凍干燥方法可延長(zhǎng)菌種保存時(shí)間。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周1次轉(zhuǎn)種的工作菌株。冷凍菌種一旦解凍轉(zhuǎn)種制備工作菌株后，不等重新冷凍和再次使用。5.3 工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制，不得超過5代（從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代），以防止過度的傳代增加菌種變異的風(fēng)險(xiǎn)。1代是指將活的培養(yǎng)物接種到微生物生長(zhǎng)的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，任何亞培養(yǎng)的形式均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代1次。必要時(shí)

10、，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)工作菌株的特性和純度進(jìn)行確認(rèn)。5.4 工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，標(biāo)準(zhǔn)菌株的商業(yè)衍生物僅可用作工作菌株。5.5 實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存其所有菌株的進(jìn)出、收集、貯藏、確認(rèn)試驗(yàn)以及銷毀的記錄，應(yīng)有菌種管理的程序文件（從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株），該程序包括：標(biāo)準(zhǔn)菌株的申購記錄；從標(biāo)準(zhǔn)菌株到工作菌株操作及記錄；菌種必須定期轉(zhuǎn)種傳代，并做純度、特性等實(shí)驗(yàn)室所需關(guān)鍵指標(biāo)的確認(rèn)，并記錄；每支菌種都應(yīng)注明其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期、傳代數(shù)；菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件；菌種保藏的位置和條件；其他需要的文件。6 微生物限度檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室6.1 微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。因此，微生物限度檢

11、查通常應(yīng)在環(huán)境潔凈度C級(jí)下的局部A級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；限度檢查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配有相應(yīng)的人流和物流緩沖間或傳遞窗（柜）。應(yīng)按相關(guān)并定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證和日常監(jiān)測(cè)。6.2 實(shí)驗(yàn)室對(duì)所有的消毒劑種類應(yīng)定期更換，使用的消毒劑應(yīng)無菌。6.3 注意進(jìn)出潔凈區(qū)時(shí)，相鄰兩門不能同時(shí)打開，并在人流和物流通道房間增加氣鎖。7 設(shè)備7.1 實(shí)驗(yàn)室配備與檢驗(yàn)?zāi)芰凸ぷ髁肯噙m應(yīng)的儀器設(shè)備，其類型、測(cè)量范圍和準(zhǔn)確度等級(jí)應(yīng)滿足檢驗(yàn)所采用標(biāo)準(zhǔn)的要求，設(shè)備的安裝和布局應(yīng)便于操作，易于維護(hù)、清潔和校準(zhǔn)。7.2 實(shí)驗(yàn)室在儀器設(shè)備完成相應(yīng)的檢定、校準(zhǔn)、驗(yàn)證、確認(rèn)其性

12、能，并形成相應(yīng)的操作、維護(hù)和保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程后方可正式使用，使用要有記錄。為保證設(shè)備處于良好工作狀態(tài)，應(yīng)定期維護(hù)和期間核查，并保存相關(guān)記錄。8 人員進(jìn)出潔凈區(qū)的要求8.1 進(jìn)入潔凈區(qū)的人員應(yīng)身體健康，不得有傳染病、皮膚病或體表傷口以及其它不適宜進(jìn)入潔凈區(qū)的身體狀況。檢驗(yàn)人員若有身體不適應(yīng)按及時(shí)報(bào)告，按職工主動(dòng)報(bào)告身體不適應(yīng)生產(chǎn)情況管理辦法記錄和處理。8.2 進(jìn)入潔凈區(qū)的人員不得化妝，不允許佩戴飾物。8.3 人員按潔凈區(qū)操作規(guī)程要求進(jìn)出潔凈區(qū)。8.4 潔凈區(qū)內(nèi)的人數(shù)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)加控制，檢查和監(jiān)督應(yīng)當(dāng)盡可能在檢驗(yàn)的潔凈區(qū)外進(jìn)行，特殊情況確需進(jìn)入的，應(yīng)當(dāng)事先對(duì)個(gè)人衛(wèi)生、更衣等事項(xiàng)進(jìn)行指導(dǎo)、辦理審批手續(xù)，

13、經(jīng)批準(zhǔn)后由本崗位人員陪同方可進(jìn)入潔凈區(qū)。9 物品進(jìn)出潔凈區(qū)要求9.1 試驗(yàn)所需的無菌器具及潔凈服應(yīng)按操作規(guī)程要求清洗、包裝、滅菌、傳遞，并在滅菌有效期內(nèi)按先進(jìn)先出的原則使用。9.2 被檢樣品應(yīng)按操作規(guī)程要求貯藏、標(biāo)記、消毒、傳遞，并能夠保證其完整性而其性狀不改變。9 方法驗(yàn)證9.1 驗(yàn)證的基本要求符合下列條件之一的，應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證：采用新的檢驗(yàn)方法；若產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)；采用中華人民共和國藥典及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗(yàn)方法；法規(guī)規(guī)定的其他需要驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法。9.1.1 根據(jù)樣品特性，制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，并寫出驗(yàn)證方案，保證驗(yàn)證試驗(yàn)所用的儀器、培養(yǎng)基和試

14、劑等均符合試驗(yàn)要求，并按制訂的方法進(jìn)行試驗(yàn)。9.1.2 根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果，判斷是否符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查；若不符合，應(yīng)重新設(shè)立驗(yàn)證方案，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。9.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)的菌株使用35代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代）。9.2 微生物限度檢查法驗(yàn)證9.2.1 檢驗(yàn)量9.2.1.1 固體及半固體（黏稠性供試品）制劑檢驗(yàn)量為10g。9.2.1.2 液體制劑檢驗(yàn)量為10ml。9.2.1.3 包裝膜、袋等包裝材料除另有規(guī)定外，每項(xiàng)檢驗(yàn)量為100cm2。9.2.1.4 特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗(yàn)量可酌減。除另有規(guī)定

15、外，口服固體制劑不低于3g，液體制劑采用原液者不得少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。9.2.1.5 要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對(duì)照試驗(yàn)）。9.2.2 供試液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。如使用了乳化劑、分散劑、中和劑或滅活劑，其用量應(yīng)證明是有效的，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)和存活無影響性。供試液的制備若需要用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過45，30min。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基不得超過1小時(shí)。除另有規(guī)定外，常用的供試品制備方法如下：9.2.2.1 液體供試品：取供試品10ml，加p

16、H7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為供試液。油劑可先加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻，然后再加0.9%無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml?？扇苄砸后w制劑可用混合的供試品原液作為供試液。9.2.2.2 固體、半固體或黏稠液供試品：取供試品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀（30005000r/min、2min4min）或其他有效的方法，混勻，作為供試液。必要時(shí)加適量的滅菌聚山梨酯80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。蜜丸等需剪碎，放入勻漿杯。9.2.2.3膜、袋等包裝材料供試品：用開孔面積為20cm2的滅菌金屬模板放在試樣的內(nèi)層

17、面上，將無菌棉簽用無菌0.9%氯化鈉溶液稍沾濕，在板孔范圍內(nèi)擦拭，在板孔范圍內(nèi)擦拭5次，換1支棉簽再擦拭5次，每個(gè)位置用2支棉簽共擦拭10次，擦拭5個(gè)位置共100cm2，每支棉簽擦拭后立即剪斷，投入盛有30ml無菌氯化鈉溶液的大試管中。全部擦抹棉簽均投入管中后，將管迅速搖晃1分鐘，即得1：10供試液。9.2.2.4 具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，應(yīng)消除供試液的抑菌活性后，再依法檢查。常用的方法如下：9.2.2.4.1 稀釋法：取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測(cè)定菌數(shù)時(shí)，1ml供試液可等量分注多個(gè)平皿；控制菌檢查時(shí)，可加大增

18、菌培養(yǎng)基的用量。培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。9.2.2.4.2 離心沉淀集菌法：取規(guī)定量的供試液， 500r/min，離心3min，取全部上清液混合，用于細(xì)菌檢查。9.2.2.4.3 薄膜過濾法：采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45微米，直徑一般為50毫米，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以濕潤(rùn)濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)濾膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上

19、的微生物受損傷。取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，（即用1：10的供試液10ml）加至濾杯中過濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml進(jìn)行試驗(yàn)。（即用1：102的供試液各10ml）加至濾杯中，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)依據(jù)每種供試品的特性而定。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基制備一張濾膜。9.2.2.4.4 中和法：凡含貢、砷或防腐劑等的供試品，可用相應(yīng)的試劑鈍化、中和其抑菌活性，制成供試液。9

20、.2.3 供試液的稀釋9.2.3.1 取34支滅菌試管，分別加入9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。加稀釋劑后，試管應(yīng)立即塞上。9.2.3.2 另取1支1ml滅菌吸管吸1：10均勻供試液1ml，加入裝有9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中，混勻，即1：100供試液以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1：103、1：104等適宜的稀釋級(jí)（34）。每遞增1稀釋級(jí)，必須另換一支吸管。9.2.4 細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查法的驗(yàn)證9.2.4.1 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證9.2.4.1.1 驗(yàn)證用菌株 大腸埃希菌CMCC(B)44102、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢桿菌CMCC(

21、B)63501、白色念珠菌CMCC(B)98001、黑曲霉CMCC(B)98003。接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824h；黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天7天。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含50cfu100cfu的菌懸液。9.2.4.1.2 驗(yàn)證方法 驗(yàn)證試驗(yàn)分四組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照試驗(yàn)組的菌回收率。9.2.4.1.2.1 試驗(yàn)組：取最低稀釋級(jí)的供試液，按每1ml供試液加入50cfu100cfu試驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)

22、時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液1ml分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基；薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液2ml過濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。9.2.4.1.2.2 菌液組：取上述試驗(yàn)菌液，測(cè)定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。9.2.4.1.2.3 供試品對(duì)照組：取最低稀釋級(jí)的供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其所含菌數(shù)。9.2.4.1.2.4 稀釋劑對(duì)照組：為考察供試液制備過程對(duì)微生物的影響程度，可用相應(yīng)的稀釋液替代供試液，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml含50cfu100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。 試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)9.2.4.1.2.5 試

23、驗(yàn)組的菌回收率（%）= 100%菌液組的平均菌落數(shù) 稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)9.2.4.1.2.6 稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（%）= 100%菌液組的平均菌落數(shù)9.2.4.1.3結(jié)果判斷：稀釋劑對(duì)照組的菌回收率菌應(yīng)不低于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，則可按該供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌或酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)建立新的方法，消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。9.2.4.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。9.2.4.2 操作方法9.2.4.2.1 平皿法一般取適宜的連續(xù)23個(gè)稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌

24、數(shù)測(cè)定。取供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15ml溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。陰性對(duì)照試驗(yàn)：取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，菌不得有菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)：一般細(xì)菌計(jì)數(shù)平板倒置于3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)平板倒置于2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。菌落計(jì)數(shù)。9.2.4.2.2 薄膜過濾法 取相當(dāng)1g或1ml供試品的供試液直接過濾，或加至適量稀釋劑中，混勻，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗

25、后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時(shí)不得有空隙或氣泡，否則影響微生物生長(zhǎng)。陰性對(duì)照：取試驗(yàn)用的稀釋劑1ml同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。9.2.4.2.3 培養(yǎng)基稀釋法取低稀釋級(jí)供試液（原液或1：10供試液）2份，每份各1ml，分別注入5個(gè)或5個(gè)以上平皿的中（每皿0.2ml或0.2ml），每1個(gè)平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。每1ml供試液等量分注5個(gè)或5個(gè)以上平板點(diǎn)計(jì)的菌落數(shù)之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得2組數(shù)據(jù)。以2份低稀釋級(jí)供試液菌落數(shù)的平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)

26、告。9.2.4.2.4 結(jié)果報(bào)告按細(xì)菌、霉菌及酵母菌的報(bào)告規(guī)則計(jì)數(shù)，當(dāng)結(jié)果滿足8.2.4.1.3的要求時(shí)，照此檢查法和檢查條件進(jìn)行供試品的微生物限度檢查。如結(jié)果不滿足8.2.4.1.3的要求時(shí)，需改進(jìn)后重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。9.2.5 控制菌檢查法的驗(yàn)證9.2.5.1 驗(yàn)證用菌株及菌液制備9.2.5.1.1 驗(yàn)證用菌種大腸埃希菌CMCC（B）44102金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094銅綠假單胞菌CMCC（B）10104 生孢梭菌CMCC（B）64941菌液制備：分別取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，各

27、接種至5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置3537培養(yǎng)18h24h，取均勻培養(yǎng)物1ml用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10cfu100cfu的菌懸液，其菌數(shù)在做對(duì)照試驗(yàn)的同時(shí)用營養(yǎng)瓊脂注皿或平板涂布，經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定。生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h24h。用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1ml含菌10cfu100cfu的菌懸液。9.2.5.2 供試液的制備見SOP-QC-SW-101微生物限度檢查法6.2.2細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)9.2.5.3 驗(yàn)證方法：除另有規(guī)定外，控制菌培養(yǎng)溫度為3035。9.2.5.3.1 試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10cfu100cfu試驗(yàn)

28、菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)采用大腸埃希菌作為試驗(yàn)菌。當(dāng)采用薄膜過濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。9.2.5.4 結(jié)果判定：若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法作該供試品的控制菌檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)參照8.2.2.4中具抑菌活性的供試品項(xiàng)下操作，以消除供試品的抑菌活性。建立新的方法，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。9.2.5.5大腸埃希菌檢查法驗(yàn)證9.2.5.5.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種

29、至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，加入含10cfu100cfu的大腸埃希菌懸液做試驗(yàn)組，培養(yǎng)18h24h時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。9.2.5.5.2 MUG-Indole檢查:取上述培養(yǎng)物，用滅菌吸管吸取0.2ml接種至含5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，同時(shí)取1支5mlMUG培養(yǎng)基管接種陽性對(duì)照培養(yǎng)物0.2ml,分別在5小時(shí)、24小時(shí),取未接種的MUG培養(yǎng)基管本底對(duì)照,將各管置365nm紫外光觀察有無熒光。陽性對(duì)照應(yīng)呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，否則試驗(yàn)失敗。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，無熒光，MUG陰性。然后加靛基質(zhì)(Indole)試液45滴于上述MUG管內(nèi)，觀察液面顏色，呈玫瑰

30、紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。供試液按照表1的結(jié)果進(jìn)行判斷或做進(jìn)一步的檢查。表1 結(jié)果分析MUGIndole結(jié)果陰性陰性結(jié)果未檢出大腸埃希菌陽性陽性報(bào)告檢出大腸埃希菌陽性陰性需要進(jìn)一步做如下檢查陰性陽性需要進(jìn)一步做如下檢查9.2.5.5.3 分離培養(yǎng)取供試液增菌液及陽性對(duì)照培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18h24h，當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)，若供試液的平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。表2大腸埃希菌菌落形態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、籃紫色或粉紅色，菌

31、落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，帶有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)9.2.5.6 大腸菌群檢查法驗(yàn)證9.2.5.6.1 取裝量10ml的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），加入含10100cfu的大腸埃希菌懸液做試驗(yàn)組，培養(yǎng)18h24h。9.2.5.6.2 膽鹽乳糖發(fā)酵管若無菌生長(zhǎng)、或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管

32、未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18h24h。9.2.5.6.3 若平板上無菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。表3大腸菌群菌落形態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)9.2.5.6.4 確證試驗(yàn) 從上述分離平板上挑選取

33、45個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24h48h。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該膽鹽乳糖發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。9.2.5.7 銅綠假單胞菌檢驗(yàn)法驗(yàn)證9.2.5.7.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，加入含10cfu100cfu的銅綠假單胞菌懸液做試驗(yàn)組，培養(yǎng)18h24h。9.2.5.7.2 取上述培養(yǎng)物，劃線接種于十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18h24h。9.2.5.7.3 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤(rùn)，灰白色，周圍時(shí)有籃綠色素?cái)U(kuò)散。若平板上無菌落生長(zhǎng)

34、，或生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。9.2.5.8 沙門菌檢驗(yàn)法驗(yàn)證9.2.5.8.1 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其它適宜的方法混勻，加入含10cfu100cfu的沙門菌懸液做試驗(yàn)組，培養(yǎng)18h24h。9.2.5.8.2 取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18h24h（必要時(shí)延長(zhǎng)至40h48h）。9.2.5.8.3 若平板上無菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的

35、菌落不同于表4所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。9.2.5.8.4 若平板上生長(zhǎng)的菌落與表5所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)18h24h，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色，底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。表4 沙門菌菌落形態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色9.2.

36、5.9 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)法驗(yàn)證9.2.5.9.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，加入含10100cfu的金黃色葡萄球菌懸液做試驗(yàn)組，培養(yǎng)18h24h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。9.2.5.9.2 取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24h72h。9.2.5.9.3 若平板上無菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于表5所列的特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。表5 金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征培養(yǎng)基菌落形態(tài)甘露醇氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍

37、有黃色環(huán)，菌落直徑0.71mm。卵黃氯化鈉瓊脂金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵磷脂分解后的乳濁圈，菌落直徑12mm。9.2.5.10 梭菌的檢驗(yàn)法驗(yàn)證9.2.5.10.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml）2份，其中1份置80保溫10分鐘后迅速冷卻，上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的0.1新鮮庖肉培養(yǎng)基中，加入含10cfu100cfu的生孢梭菌懸液做試驗(yàn)組各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)72h96h。9.2.5.10.2 如試驗(yàn)管不出現(xiàn)渾濁、產(chǎn)氣、消化碎、臭肉等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌；否則，應(yīng)取上述培養(yǎng)物0.2ml，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧

38、條件下培養(yǎng)48h72h。9.2.5.10.3 若平板上無菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌。9.2.5.11 白色念珠菌的檢驗(yàn)法驗(yàn)證9.2.5.11.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1872小時(shí)。9.2.5.11.2 取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。9.2.5.11.3 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時(shí)間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺褶。若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與上

39、述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至72小時(shí)）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出白色念珠菌。9.2.5.11.4 若平板上生長(zhǎng)的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448小時(shí)。取培養(yǎng)物進(jìn)行染色、鏡檢及芽管試驗(yàn)。9.2.5.11.5 牙管試驗(yàn)挑取1%聚山梨酯80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上載玻片，置濕潤(rùn)的平皿內(nèi)，于3537培養(yǎng)13小時(shí)，置顯微鏡下觀察孢子上有否

40、長(zhǎng)出短小芽管。若上述疑似菌為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。9.2.5.11 結(jié)果判斷若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。10 制定檢驗(yàn)方法SOP10.1 各品種經(jīng)方法驗(yàn)證后制定該品種的微生物限度檢驗(yàn)方法SOP。10.2 檢驗(yàn)操作依現(xiàn)行的微生物限度檢驗(yàn)方法SOP規(guī)定進(jìn)行。11檢驗(yàn)方法11.1供試液的制備一般供試品的檢驗(yàn)量為10g或10ml；膜、袋等包裝材料100cm2；貴重藥品、微量包

41、裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗(yàn)量應(yīng)增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對(duì)照試驗(yàn)）。根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需用加溫時(shí)，應(yīng)均勻加熱，且溫度不應(yīng)超過45。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。除另有規(guī)定外，常用供試液制備方法如下。11.1.1液體供試液取供試品10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。11.1.2固體、半固體或粘稠性供試品取供試品10g，加pH7.

42、0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1：10的供試液。必要時(shí)加入適量的無菌聚山梨80，并置水浴中適當(dāng)加溫使供試品分散均勻。特殊情況按客戶提供方法制備，新增品種按驗(yàn)證的方法制備。11.1.3非水溶性供試品取供試品5g(5ml)，加至溶化的（溫度不超過45）5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃棒攪拌成團(tuán)后，慢慢加入45的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為1:20的供試液。11.1.4膜、袋等包裝材料供試品用開孔面積為20cm2的滅菌金屬模板放在試樣的內(nèi)層面上，將無菌

43、棉簽用無菌0.9%氯化鈉溶液稍沾濕，在板孔范圍內(nèi)擦拭，在板孔范圍內(nèi)擦拭5次，換1支棉簽再擦拭5次，每個(gè)位置用2支棉簽共擦拭10次，共擦拭5個(gè)位置100cm2，每支棉簽擦拭后立即剪斷（或燒斷），投入盛有30ml無菌氯化鈉溶液的大試管中。全部擦抹棉簽均投入管中后，將管迅速搖晃1分鐘，即得供試液。11.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為3035；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2328。檢查結(jié)果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2為報(bào)告,特殊品種可以最小包裝單位報(bào)告。計(jì)數(shù)方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時(shí)，按已驗(yàn)證的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)的測(cè)定。按計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證試

44、驗(yàn)確認(rèn)的程序進(jìn)行供試液制備。用稀釋液稀釋成1：10、1:102等稀釋級(jí)的供試液。11.2.1 平皿法11.2.1.1供試品檢驗(yàn)：根據(jù)菌落報(bào)告規(guī)則取相應(yīng)稀釋級(jí)的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15ml20ml溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母進(jìn)出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板。11.2.1.2陰性對(duì)照試驗(yàn)：取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。11.2.1.3培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日觀察

45、菌落成長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌落報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的平均數(shù)不小于15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。一般營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉棟葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營

46、養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌落為計(jì)數(shù)結(jié)果。含蜂蜜、王漿的液體制劑，用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌數(shù)，用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定酵母菌數(shù)，合并計(jì)數(shù)。11.2.1.4 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則細(xì)菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數(shù)在小于100cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。如各稀釋級(jí)的平板均無菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。若兩個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)均超出范圍，需重試。11.2.2 薄膜

47、過濾法11.2.2.1 供試品檢驗(yàn)：采用薄膜過濾法，濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45微米，直徑一般為50毫米，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以濕潤(rùn)濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)濾膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml，總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，（即用1：10的供試液10ml）加至濾杯中過濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數(shù)較多

48、時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液1ml進(jìn)行試驗(yàn)。（即用1：102的供試液各10ml）加至濾杯中，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)依據(jù)每種供試品的特性而定。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基制備一張濾膜。11.2.2.2 陰性對(duì)照試驗(yàn)：取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。11.2.2.3 培養(yǎng)和計(jì)數(shù)：培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。11.2.2.4 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則：（1）若每張濾膜上的菌落數(shù)在100

49、cfu以內(nèi)，以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；（2）若濾膜上無菌落生長(zhǎng)，以1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品），或1乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)；（3）若兩張濾膜上均有菌生長(zhǎng)，以菌數(shù)在100以內(nèi)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)，但菌數(shù)均在100以上，需重試。11.3 控制菌檢查除另有規(guī)定外，控制菌的培養(yǎng)溫度為3035。11.3.1大腸埃希菌（Escherichia coli）11.3.1.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48小時(shí)。另取一瓶膽鹽乳糖培養(yǎng)基

50、加入含10cfu100cfu的菌懸液做陽性對(duì)照，同步培養(yǎng)。11.3.1.2 MUG-Indole檢查:取上述培養(yǎng)物，用滅菌吸管吸取0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，同時(shí)取1支5mlMUG培養(yǎng)基管接種陽性對(duì)照培養(yǎng)物0.2ml，于5小時(shí)、24小時(shí), 在置366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基管做本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，無熒光，為MUG陰性。陽性對(duì)照應(yīng)呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，否則試驗(yàn)失敗。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴（約45滴）靛基質(zhì)(Indole)試液，觀察液面顏色，呈玫瑰紅色為靛基質(zhì)陽性，呈試劑本色為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)

51、陰性。按照表1的結(jié)果進(jìn)行判斷或做進(jìn)一步的檢查。表1 結(jié)果分析MUGIndole結(jié)果陰性陰性結(jié)果未檢出大腸埃希菌陽性陽性報(bào)告檢出大腸埃希菌陽性陰性需要進(jìn)一步做如下檢查陰性陽性需要進(jìn)一步做如下檢查11.3.1.3 分離培養(yǎng)取供試液增菌液及陽性對(duì)照培養(yǎng)液輕輕搖動(dòng)，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時(shí)，當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)，供試液的平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與表2所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若有相符或疑似大腸埃希菌的菌落生長(zhǎng)，需進(jìn)一步進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。表2 大腸埃希菌菌落形

52、態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、淺紫色、藍(lán)紫色或粉紅色，菌落中心呈深紫色或無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)，帶有金屬光澤麥康凱瓊脂鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，圓形，扁平，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)11.3.2 大腸菌群（Coliform）11.3.2.1 取裝量10ml的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或0.01ml）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或0.001ml），另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基管加入稀釋液1ml作為陰性對(duì)照

53、管。培養(yǎng)1824小時(shí)。11.3.2.2 乳糖膽鹽發(fā)酵管若無菌生長(zhǎng)或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應(yīng)將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時(shí)。11.3.2.3 若平板上無菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征不符或?yàn)榉歉锾m陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應(yīng)進(jìn)行確證試驗(yàn)。表3 大腸菌群菌落形態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)麥康凱瓊脂鮮桃紅色或粉紅色，圓形

54、，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)11.3.2.4 確證試驗(yàn) 從上述分離平板上挑選取45個(gè)疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時(shí)。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該乳糖膽鹽發(fā)酵管檢出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。11.3.2.5 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)。按表4報(bào)告1g或1ml供試品中的大腸菌群數(shù)。表4 可能的大腸菌群數(shù)表各供試品量的檢出結(jié)果可能的大腸菌群數(shù)N（1g或1ml）0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml103102N10310N10210注：“+”代表檢出大腸菌群；“-”代表未檢出大腸菌群。11.3.3 沙門菌（Salmonella）11.3.3.1

55、 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至200ml的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其它適宜的方法混勻，培養(yǎng)1824小時(shí)。11.3.3.2 取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)（必要時(shí)延長(zhǎng)至4048小時(shí)）。11.3.3.3 若平板上無菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于表5所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。11.3.3.4 若平板上生長(zhǎng)的菌落與表5所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和

56、高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時(shí)，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色，底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。表5 沙門菌菌落形態(tài)特征培 養(yǎng) 基菌 落 形 態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色。沙門、志賀菌屬瓊脂無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色。曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落。麥康凱瓊脂無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色。11.3.4 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）11.3.4.1 取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)。11.3.4.2 取上述培養(yǎng)物，劃線