格列酮對內皮祖細胞增殖、黏附及遷移能力的影響

1、格列酮對內皮祖細胞增殖、黏附及遷移能力的影響         08-07-05 14:14:00     作者：林杰    編輯：studa0714【摘要】  目的:觀察羅格列酮(rosiglitazone，Ros)對體外培養(yǎng)內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs) 增殖、黏附及遷移能力的影響。方法:以密度梯度離心法獲取臍血單個核細胞，培養(yǎng)7 d后收集貼壁細胞并分為正常對照組、單獨Ros

2、 (1mol/L、5mol/L及10mol/L)組、H2O2（500mol/L）氧化應激模型組、Ros(1mol/L、5mol/L及10mol/L)和H2O2共同干預組，培養(yǎng)24 h。用流式細胞儀檢測細胞表達CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin并用熒光顯微鏡觀察細胞吞噬DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1來鑒定EPCs。分別用CCK-8、普通光學倒置顯微鏡、改良的Boyden小室檢測EPCs的增殖、黏附和遷移能力。結果:與正常對照組相比，單獨Ros干預組呈濃度依賴性促進臍血來源的EPCs增殖、黏附及遷移能力（均P<0.05），但是Ros 5mol/L和10m

3、ol/L組間沒有顯著差異（P>0.05）；與H2O2氧化應激損傷組相比，Ros能呈濃度依賴性改善H2O2對EPCs增殖、黏附及遷移功能的抑制（均P<0.05），Ros 5mol/L和10mol/L干預保護組之間沒有顯著差異（均P>0.05）。結論:噻唑烷二酮（TZDs）類藥物Ros除具有激動PPAR-受體降糖作用外，還具有抗氧化應激損傷作用。Ros能促進EPCs功能，改善H2O2致EPCs功能的氧化應激損傷。 【關鍵詞】  羅格列酮 內皮祖細胞 過氧化氫 氧化應激    Abstract:  Objective: To stu

4、dy the effect of rosiglitazone on the ability of proliferation, conglutination and transfere of endothelial progenitor cell in vitro. Methods: Total mononuclear cells were isolated from the umbilical cord blood with ficoll density gradient centrifugation, after the red    內皮祖細胞（endoth

5、elial progenitor cells， EPCs）被認為是表達CD34/CD133/VEGFR-2的一群細胞，可以分化為內皮細胞，參與成體血管新生，同成熟內皮細胞相比具有遲發(fā)性的高增殖性。EPCs具有干/祖細胞增殖分化的特性，大量的動物實驗和一些臨床研究證明，EPCs是治療缺血性疾病和修復血管內皮的良好種子細胞，具有巨大的臨床應用潛能。越來越多的研究結果揭示，心血管危險因素如高血壓、糖尿病、高血脂、年齡、吸煙都會抑制EPCs的功能，促進細胞衰老和凋亡1，2，EPCs的數(shù)量和功能可作為心血管疾病危險程度新的預測因子。近年來我國的糖尿病發(fā)病率明顯上升，糖尿病被認為是冠心病的等危癥，糖尿病患

6、者10年心腦血管疾病發(fā)病率大于20%。噻唑烷二酮(TZDs)Ros是選擇性激活過氧化物酶體增殖激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor-，PPAR-）激活劑,是治療糖尿病的常用藥。最近研究發(fā)現(xiàn)，TZDs類藥物具有抗炎、抗免疫、保護血管內皮、抗動脈粥樣硬化、降血壓等胰島素增敏效果的外作用3-5。本實驗旨在觀察Ros在體外正常培養(yǎng)和H2O2氧化應激損傷模型下對EPCs功能的影響，為明確Ros治療糖尿病外的血管保護作用提供新的依據(jù)。    1  材料和方法    1.1

7、0; 材料  6%羥乙基淀粉（購自Sigma公司），纖維連接蛋白（購自Roche公司），VEGF（購自Peprotech EC公司），PE-CD34（購自Caltag laboratories），F(xiàn)ITC-VE-cadherin（購自Bender system公司），PE-VEGF-2及FITC-AC133（購自RD System），胎牛血清、M199（購自GIBCO公司），Dil-ac-LDL（購自Molecular probe公司），F(xiàn)ITC-UEA-1、rosiglitazone（購自Sigma公司），改良的Boyden小室(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠生產)，CCK-8細胞計數(shù)試劑

8、盒（購自日本株式會社同仁化學研究所），胃癌細胞株(SGC7901，中國科學院上海生科院細胞資源中心提供)。    1.2  EPCs培養(yǎng)及鑒定    1.2.1  人臍血培養(yǎng)EPCs：外周血采集于溫州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院分娩室（已獲得知情同意）。參考文獻6，取健康孕婦分娩后臍血50 ml，6%羥乙基淀粉沉淀紅細胞，以密度梯度離心法分離臍血單個核細胞，以5×106/cm2接種于包被有纖維連接蛋白的6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml包含有20%胎牛血清、VEGF(10 ng/ml)，青霉素(100 IU/ml)及鏈

9、霉素(100 IU/ml)的M199培養(yǎng)液，置37 、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后，洗去未貼壁細胞，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每隔3 d換培養(yǎng)液。    1.2.2  EPCs鑒定：在培養(yǎng)的第7天，細胞以0.25%胰酶消化，制成1×106/ml的單細胞懸液，加入熒光標記的抗CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133單克隆抗體各10l(1mg/ml)，流式細胞儀分析內皮祖細胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133的表達情況。根據(jù)EPCs具有吞噬DiI-ac-LDL的特性，將DiI-ac-LDL

10、以2.4g/ml的終濃度加入培養(yǎng)液共孵育3 h，以2%的多聚甲醛固定10 min，再加入3l FITC-UEA-1(避光操作)，于37 孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察。以不加DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1的同批培養(yǎng)細胞為對照。陰性對照采用SGC7901。    1.3  實驗分組  在培養(yǎng)第7天后，以0.25%胰酶將各孔細胞消化下來制成細胞懸液，以等數(shù)量細胞接種，隨機分為正常對照組、Ros組(濃度分別為1、5、10mol/L)、H2O2（500mol/L）氧化應激損傷模型組、Ros+H2O2共同干預組，每組6孔培養(yǎng)24 h后，進行細胞

11、功能檢測。    1.4  CCK-8增殖能力檢測  單細胞懸液以1×104/孔的接種密度接種到96孔板，隨機分組培養(yǎng)24 h后，更換新鮮培養(yǎng)液，每孔加入10l CCK-8細胞計數(shù)試劑，于37 孵育2.5 h，酶標儀450 nm下讀取吸光度OD值。    1.5  黏附能力檢測  單細胞懸液以5×104/孔的接種密度接種到24孔板，隨機分組，培養(yǎng)24 h后，各組細胞以0.25%胰酶消化制成細胞懸液，以相同細胞數(shù)接種96孔板，置37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，洗去未貼壁細胞，倒

12、置顯微鏡下隨機選取10個視野(×400)，計數(shù)黏附細胞數(shù)。            1.6  遷移能力檢測  單細胞懸液以5×104/孔的接種密度接種到24孔板，隨機分組，培養(yǎng)24 h后，各組細胞以0.25%胰酶消化制成細胞懸液，并計數(shù)。將培養(yǎng)液100l加入改良Boyden小室的下室，將2×104/ml EPCs懸浮在150l培養(yǎng)液，注入上室，培養(yǎng)24 h，刮去濾膜上未移動的細胞，用甲醛固定，蘇木素染色，隨機選擇4個顯微鏡視野(×200)

13、，計數(shù)遷移的細胞。    1.7  統(tǒng)計學處理方法  用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗。    2  結果    2.1  EPCs鑒定培養(yǎng)3 d洗去不貼壁細胞及碎片后，可見典型細胞集落:中間為大量的圓形細胞， 層層疊疊，外周為紡錘形細胞，向外擴散(見圖1A)。培養(yǎng)第7天熒光顯微鏡檢顯示:細胞吞噬DiI-ac-LDL，顯微鏡下激發(fā)紅色熒光(見圖1B)，細胞吞噬FITC-UEA-1，顯微鏡下激發(fā)綠色熒光（見圖1C），空白對照及陰性對照均無熒光。用流式細胞儀分析表明，表達CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的細胞分別為(51.21±3.53)%、(19.15±3.45)%、(39.24±3.61)%及(54.28±3.56)%。    2.2  Ros對EPCs增殖能力的影響  由表1可知，與對