益氣化瘀方及其拆方對大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡相關(guān)因子的作用

1、益氣化瘀方及其拆方對大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡相關(guān)因子的作用    作者：周泉, 王擁軍, 施杞, 孫鵬, 周重建, 胡志俊, 劉梅    【關(guān)鍵詞】 ,益氣化瘀方    摘要 目的：研究益氣化瘀方及其拆方藥理血清對大鼠誘導(dǎo)凋亡椎間盤纖維環(huán)細胞bcl2、Bax及半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）表達的影響。方法：用細胞免疫化學(xué)和積分光密度分析等方法比較分析益氣化瘀方及其拆方益氣方、化瘀方藥理血清，以及胰島素樣生長因子1（insulinlike growth factor 1,

2、 IGF1）對抗Fas抗體（antiFas antibody）誘導(dǎo)凋亡大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞bcl2、Bax及caspase8表達的影響。結(jié)果：益氣化瘀方、益氣方、化瘀方及IGF1血清處理組與凋亡模型組相比，bcl2表達升高，Bax及caspase8表達降低，均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；益氣化瘀方組與益氣方、化瘀方組比較，Bax表達明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：益氣化瘀方及其拆方可以調(diào)控大鼠椎間盤纖維環(huán)細胞內(nèi)Bax、bcl2和caspase8表達，其延緩椎間盤退變的機制可能與調(diào)控細胞的凋亡相關(guān)因子有關(guān)。 關(guān)鍵詞 益氣化瘀方; 椎間盤; 纖維環(huán)細胞; bcl2; B

3、ax; caspase8 Effects of Yiqi Huayu Recipe and its decomposed formulas on apoptosisrelated factors of anulus fibrosus cells in rats ABSTRACT Objective: To study the effects of Yiqi Huayu Recipe and its decomposed formulasmedicated sera on expressions of bcl2, Bax and caspase8 of apoptotic anulus fibr

4、osus cells in rats. Methods: Immunohistochemical and integral optical density analytic methods were used to observe the effects of Yiqi Huayu Recipe, Yiqi Recipe, Huayu Recipemedicated sera and insulinlike growth factor 1 (IGF1) on the expressions of bcl2, Bax and caspase8 of apoptotic anulus fibros

5、us cells in rats induced by antiFas antibody. Results: As compared with apoptosis group, bcl2 expression was higher, Bax and caspase8 expressions were lower in Yiqi Huayutreated, Yiqitreated, Huayutreated and IGF1 groups (P<0.01). As compared with Yiqitreated group and Huayutreated group, Bax exp

6、ression was lower in Yiqi Huayutreated group (P<0.05). Conclusion: Yiqi Huayu Recipe and its decompsed formulas can delay degeneration of the cervical intervertebral disc, which may be due to its action in regulating the expressions of bcl2, Bax and caspase8. KEY WORDS Yiqi Huayu Recipe; interver

7、tebral disc; anulus fibrosus; bcl2; Bax; caspase8 椎間盤退變主要表現(xiàn)為椎間盤細胞的凋亡和細胞外基質(zhì)合成與分泌的減少,椎間盤細胞自分泌和旁分泌Fas配體觸發(fā)凋亡。益氣化瘀法是施杞教授根據(jù)大量臨床和實驗研究總結(jié)出來的治療頸椎病的法則，本研究探討其對椎間盤細胞凋亡相關(guān)因子的作用。 1 材料與方法 1.1 主要試劑、儀器與材料 達氏修正依氏培養(yǎng)基（Dulbeccos modified Eagles Medium, DMEM），Gibco公司產(chǎn)品；粗品膠原酶，上海市醫(yī)藥工業(yè)研究院產(chǎn)品；胰蛋白酶，Promega公司產(chǎn)品；小牛血清，杭州四季青生物制劑公司產(chǎn)品

8、；鼠抗人bcl2蛋白單克隆抗體，兔抗人Bax蛋白單克隆抗體，鏈霉親和素生物素過氧化物酶復(fù)合物試劑盒，Dako公司產(chǎn)品；兔抗人caspase8蛋白單克隆抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，Heraeus B5060 EKCO2；CSB1超凈臺，上海凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；倒置顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；120目尼龍網(wǎng)篩過濾器、培養(yǎng)瓶，Unclon公司產(chǎn)品；CMIAS99B型醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)，北京航空航天大學(xué)圖像中心產(chǎn)品；益氣化瘀方（黃芪、黨參、川芎、丹參，人工麝香），益氣方（黃芪、黨參），化瘀方（川芎、丹參，人工麝香）1。 1.2 細胞培養(yǎng)及分組 1月齡大鼠，無菌手術(shù)條件下，取下頸部椎間盤

9、纖維環(huán)，采用連續(xù)酶消化法分離、培養(yǎng)2。細胞生長鋪滿瓶底后，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代，將代細胞以2×104/ml密度接種于內(nèi)置玻片的6孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)第5天時，換無血清培養(yǎng)液孵育，24 h后去上清液，加入含1%小牛血清DMEM配制的抗Fas抗體，濃度為0.25 g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，分為6組：正常對照組、凋亡誘導(dǎo)組、中藥血清治療組（益氣化瘀方、益氣方和化瘀方）1、重組人IGF1（RD Systems Inc產(chǎn)品，用1小牛血清配制成終濃度為50 ng/ml）組，再孵育48 h，然后收集細胞進行觀察。 1.3 Bax、bcl2和caspase8細胞免疫化學(xué)法檢測 取纖

10、維環(huán)細胞玻片，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3 min，3次；85%、95%和100%乙醇脫水，用中性樹脂將蓋玻片無細胞面貼在載玻片上，自然風(fēng)干；0.3% H2O2室溫20 min，PBS洗滌3 min，3次；0.1% Triton×100PBS洗20 min，PBS洗滌3 min，3次；加入一抗；4 冰箱過夜，PBS洗滌3 min，3次；加入二抗為生物素化羊抗兔IgG（1400），37 ，30 min, PBS洗滌3 min，3次；抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin）HRP(140

11、0)，37 ，40 min，PBS洗滌3 min，3次；0.05%聯(lián)苯二胺加0.03%H2O2，12 min；蘇木素襯染，常規(guī)封片。陽性結(jié)果判斷：染色陽性表達為棕黃色，無著色為陰性。以不加一抗為陰性對照。 1.4 圖像分析 取免疫組化染色玻片，200倍光學(xué)顯微鏡下，在上下的基礎(chǔ)上，再分左、中、右，共觀察6個視野，使用CMIAS99B型醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)，用積分光密度對陽性信號進行量化分析。 1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件包，進行單因素方差分析。 2 結(jié)果 正常對照組的Bax和caspase8積分光密度低，輕度表達；凋亡誘導(dǎo)組的Bax和caspase8積分光密度高，表達明顯，高于正常

12、對照組(P<0.01)；正常對照組的bcl2積分光密度高，bcl2高度表達；凋亡誘導(dǎo)組的bcl2積分光密度低，表達不明顯，與正常組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。3種中藥藥理血清及IGF1組和凋亡誘導(dǎo)組比較，Bax和caspase8呈明顯的下調(diào)，而bcl2呈明顯的上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。益氣化瘀方組與益氣方、化瘀方組比較，Bax表達明顯降低（P<0.05）。見表1。 表 1 bcl2、Bax和caspase8積分光密度結(jié)果（略）    Tab 1 Integral optical density results

13、of bcl2, Bax and caspase8 *P<0.05, vs Yiqi Huayutreated group; P<0.05, P<0.01, vs normal control group; P<0.01, vs apoptosis group    3 討論 椎間盤退變是頸椎病發(fā)病的主要原因，細胞凋亡是椎間盤退變的主要表現(xiàn)，椎間盤細胞自分泌和旁分泌Fas配體觸發(fā)的凋亡為其機制之一3,4。Fas是一種跨膜蛋白，它與Fas配體（Fas ligand, FasL）結(jié)合可以啟動凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)引起細胞凋亡。椎間盤細胞按來源

14、部位可分為3種：纖維環(huán)細胞、髓核細胞和軟骨終板細胞。本文纖維環(huán)細胞凋亡研究為椎間盤細胞學(xué)研究中的部分內(nèi)容。 中醫(yī)學(xué)認為頸椎病屬于“痹癥”、“痙證”、“痿證”、“痰飲”、“內(nèi)傷”、“眩暈”、“頭痛”等病證范疇。頸椎病外因包括風(fēng)寒濕、慢性勞損、咽喉部感染等因素，內(nèi)因乃正氣虛弱、氣血失調(diào)、臟腑不和?！把惺Ф龋S損傷之處而停積”，所以“時損痛也”；榮養(yǎng)失職，引起了不榮則痛和肢麻等癥狀。所謂“積勞受損，經(jīng)脈之氣不及貫串”，“血氣不和，百病乃變化而生”。施杞教授在“氣血兼顧，以氣為主，以血為先”理論的基礎(chǔ)上，結(jié)合頸椎病臨床觀察和實驗研究，提出“益氣化瘀、標(biāo)本兼顧”治療頸椎病之法則5。 Osada等6研究

15、證實，在正常的椎間盤與退變的椎間盤中，IGF1 mRNA表達有明顯差異。Gruber等7發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)椎間盤細胞中加入IGF1和血小板衍生生長因子（plateletderived growth factor, PDGF）有明顯抗凋亡作用。因此，本研究選用IGF1作為對照藥物。 細胞凋亡的過程實際上是caspase不可逆有限水解底物的級聯(lián)放大反應(yīng)過程。caspase8前體可被Fas的死亡結(jié)構(gòu)域激活8，并被募集到Fas和腫瘤壞死因子受體1死亡受體復(fù)合物，水解活化，啟動caspase活化后，即開啟細胞內(nèi)的死亡程序9，10。caspase引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondria permeabi

16、lity transition pore, MPTP)的打開，導(dǎo)致線粒體的跨膜電位下降，同時細胞色素C被釋放到胞質(zhì)中，凋亡抑制因子bcl2被滅活。bcl2的生理功能是阻遏細胞凋亡，延長細胞壽命，它在不同的細胞類型可以定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及核膜上，并通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。bcl2的過度表達可引起細胞核谷胱苷肽的積聚，導(dǎo)致核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低了caspase的活性。caspase介導(dǎo)細胞凋亡的信號傳導(dǎo)，與凋亡效應(yīng)器細胞色素C、bcl2蛋白家族間相互作用。Bax是bcl2家族中參與細胞凋亡的一個成員，當(dāng)誘導(dǎo)凋亡時，它從胞液遷移到線粒體和核膜，增加線粒體膜的通透

17、性11，造成細胞色素C從線粒體膜間隙釋放到胞質(zhì)12。抑制Bax基因表達，提高bcl2/Bax比值，有可能會抑制凋亡、促進細胞存活13，14。    在椎間盤退變研究中，李小川等15發(fā)現(xiàn)退變腰椎間盤組織中bcl2蛋白表達越弱，Bax蛋白表達越強，凋亡細胞數(shù)越多。認為bcl2和Bax蛋白均參與了腰椎間盤組織中細胞凋亡的調(diào)節(jié)，并在腰椎間盤退行性變發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣化瘀方可以增加椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)16，17，促進神經(jīng)元的增生，加快神經(jīng)肌肉接頭的重建，顯著縮短神經(jīng)再生修復(fù)的進程18，抑制退變椎間盤中炎癥介質(zhì)19，上調(diào)型膠原mRNA的表

18、達20，對椎體骨贅內(nèi)血清堿性磷酸酶活性21和椎間盤中生長因子具有調(diào)控作用22，23。頸椎間盤退變與椎間盤細胞凋亡有關(guān)，芪麝頸康丸（益氣化瘀藥為主組成）有抑制椎間盤細胞凋亡的可能性24。我們使用免疫細胞化學(xué)法觀察3種中藥血清(益氣化瘀方、益氣方和化瘀方)和IGF1對抗Fas抗體誘導(dǎo)凋亡纖維環(huán)細胞Bax、bcl2和caspase8的表達的影響，3種中藥藥理血清以及IGF1均下調(diào)Bax和caspase8，上調(diào)bcl2，這說明益氣化瘀方可能通過增強bcl2表達而降低了caspase8的活性，阻斷了Fas死亡信號的傳導(dǎo)和執(zhí)行，中藥血清有生長因子IGF1樣作用，這可能是其抑制凋亡的機制所在。益氣化瘀方與益

19、氣方和化瘀方比較，Bax表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義，益氣化瘀方作用優(yōu)于拆方。本研究在細胞學(xué)水平證實益氣化瘀方對纖維環(huán)細胞凋亡的影響可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子實現(xiàn)的，提示益氣化瘀方延緩椎間盤退變的機制，可能是通過對椎間盤纖維環(huán)細胞凋亡的調(diào)控而產(chǎn)生。 參考文獻 1 王擁軍, 孫 鵬, 周 泉, 等. 益氣化瘀中藥對大鼠椎間盤軟骨細胞基因表達的影響J. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報, 2005, 3(2): 111114. 2 周 泉, 王擁軍, 施 杞. 椎間盤纖維環(huán)細胞培養(yǎng)研究J. 脊柱外科雜志, 2003, 1(4)： 226229. 3 Park JB, Kim KW, Han CW, et al. Expre

20、ssion of Fas receptor on disc cells in herniated lumbar disc tissueJ. Spine, 2001, 26(2): 142146. 4 Park JB, Chang H, Kim KW. Expression of Fas ligand and apoptosis of disc cells in herniated lumbar disc tissueJ. Spine, 2001, 26(6): 618621. 5 王擁軍. 施杞教授關(guān)于頸椎病理論與臨床的探討J. 中國中醫(yī)骨傷科雜志, 1997, 5(3)： 6062. 6 O

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24、60;   11 Marzo I, Brenner C, Zamzami N, et al. Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosisJ. Science, 1998, 281(5385): 20272031. 12 Shaham S, Shuman MA, Herskowitz I. Deathdefying yeast identify novel apoptosis genesJ. Cell, 1998, 92(4): 425427. 13 Lacronique V, Mignon A, Fabre M, et al. bcl2 protects from lethal hepatic apoptosis induced by an antiFas antibody in miceJ. Nat Med, 1996, 2(1): 8086. 14 Holmstrom TH, Chow SC, Elo I, et al. Suppression of Fas/APO1mediated apoptosis by mitogenactivated kinase signalin