水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星檢測技術(shù)的研究進展

1、收稿日期 :2009-05-07作者簡介 :孫建華 (1981-, 女 , 碩士 , 主要從事水產(chǎn)品藥物殘留檢測。水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星檢測技術(shù)的研究進展孫建華 王慶賀 郭霞 黃德鳳 (上海水產(chǎn)研究所質(zhì)量監(jiān)督檢驗站 , 上海 200433摘 要 :綜述了水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星殘留的各種檢測技 術(shù) , 包 括微生 物法、 液相色 譜法、 高效液 相色譜 法、 高 效薄層色譜法 、 液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法、 免疫分析法、 高效毛細(xì)管電泳法等 , 介紹了各種方法的優(yōu)缺點。 關(guān)鍵詞 :水產(chǎn)品 ; 環(huán)丙沙 星 ; 藥物殘留 ; 檢測技術(shù)1簡介環(huán)丙沙星 (C ipr o floxacin 的分子式為 C 17H 18

2、F N 3O 3, 分子量 331. 34, 是氟喹諾 酮類藥物中抗菌 活性最強的品種 , 其結(jié)構(gòu)式見圖 1。圖 1 環(huán)丙沙星的結(jié)構(gòu)式由于其強抗菌能力和廣譜抗菌特點 , 水產(chǎn)上 過去常用以治療爛鰓病、 赤皮病等細(xì)菌性感染病。但人體長時間低劑量攝入環(huán)丙沙星會導(dǎo)致對所有 喹諾酮類抗生素產(chǎn)生耐藥性。而且研究表明 , 環(huán) 丙沙星具有較嚴(yán)重的肝腎毒性 , 所以歐盟和北美 等 國家已 禁止在 水產(chǎn)養(yǎng) 殖業(yè) 中使用 環(huán)丙沙 星 , 2002年我國農(nóng)業(yè)部也將該藥列 為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用 藥物。但因其療效顯著 , 目前還是有很多漁民違 規(guī)使用。我國是水產(chǎn)品出口和消費大國 , 為保護 水產(chǎn)品國際貿(mào)易的順利進行和保障消費

3、者的食用 安全 , 對水產(chǎn)品中殘留的環(huán)丙沙星進行科學(xué)準(zhǔn)確的檢測顯得非常重要。2對水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的檢測方法目前 , 對水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星的檢測方法包括 微生物法、 液相色譜法、 高效液相色譜法、 液相色 譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法、 免疫分析法等。其中國家公布 的與水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星檢測相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)和公告包括 :農(nóng)業(yè)部公告第 236號 動物源食品中 恩諾沙 星和 環(huán)丙 沙 星殘 留 檢測 方 法 -高效 液 相色 譜 法 ; 農(nóng)業(yè)部 783號公告 -2-2006 水產(chǎn)品中諾 氟沙星、 鹽酸環(huán)丙沙星、 恩諾沙 星殘留量的測定 液相色譜法 ; GB /T20751-2006 鰻魚及制品中十五鐘喹諾酮類藥物殘留量的

4、測定 液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法 ; GB /T20366-2006 動物源產(chǎn)品中 喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜 ; GB /T21312-2007 動物源性食品中 14種喹諾 酮藥物殘留檢測方法 液相色譜 -質(zhì)譜 /質(zhì) 譜法 ; 農(nóng)業(yè)部 1077號公告 -1-2008 水產(chǎn)品中恩諾沙 星、 諾氟沙星和環(huán)丙沙星殘留的快速篩選測定 膠 體金免疫滲濾法 。本文將結(jié)合這些標(biāo)準(zhǔn)對水產(chǎn) 品中環(huán)丙沙星的檢測方法進行綜述。 2. 1微生物法微生物法是抗菌藥物殘留檢測的一種快速篩 選方法。較常用 的是 Oker m an 等 (1998 改進的189水產(chǎn)科技情報 2009, 36(4歐洲四平皿法 (

5、four-p late tes, t FPT, 四平皿法雖 能檢測高濃度藥物的殘留 , 但其檢測限高于歐盟 所規(guī)定的 MRL, 所以在目前的實際檢測工作中已 很少采用。2. 2液相色譜法反向液相色譜法 (liqu i d chro m atography , LC 操作簡單 , 方法靈活 , 是前些年用來檢測氟喹諾酮 類藥物殘留常用的方法。 Jefferry 等 (1994 報道 了用 LC 法測定沙拉沙星在海峽鲇魚中的殘留。 但由于此類藥物結(jié)構(gòu)中的叔胺基和羧基團能在水 中發(fā)生解離 , 固定相表面的這些活性位點可通過 氫鍵或離子交換作用對藥物產(chǎn)生強烈吸附 , 出現(xiàn) 色譜峰拖尾 , 保留值不穩(wěn)定

6、或過長 , 甚至被長期保 留在色譜柱上 , 導(dǎo)致峰形異常和分離度下降 , 這些 都影響了檢測的準(zhǔn)確性。2. 3高效液相色譜法高效 液 相色 譜法 (high -perfor m ance li q u i d chro m atography , HPLC 是目前檢驗水產(chǎn)品中環(huán)丙 沙星最常用的方法。農(nóng)業(yè)部公告第 236號和農(nóng)業(yè) 部 783號公告 -2-2006兩個標(biāo)準(zhǔn)中均采用高效 液相色譜法進行檢測。農(nóng)業(yè)部公告第 236號中規(guī)定的檢測方法 :樣 品經(jīng)鹽酸鹽緩沖液提取 , 離心 , 上清液過固相萃取 柱凈化后用流動相洗脫 , 用帶熒光檢測器的高效 液相色譜儀測定 , 以外標(biāo)法定量。色譜柱 :反相

7、色 譜柱 C18柱 (150mm ! 4. 6mm 或相當(dāng)性能 ; 流 動相 :0. 05m o l/L磷酸溶液 , 三乙胺 -乙腈 (82+ 18; 流速 :1. 0mL /mi n ; 熒光檢測波長 :激發(fā)波長 280nm; 發(fā)射波長 450n m 。該方法的檢出限為 20 g /kg。筆者經(jīng)多次實驗 , 該方法回收率為 80% 95%。農(nóng)業(yè)部 783號公告 -2-2006規(guī)定的檢測方 法 :樣品經(jīng)無水硫酸鈉脫水 , 酸化乙腈提取 , 離心 , 取上清液加正己烷除脂肪。蒸干萃取液 , 流動相 溶解殘渣 , 離心取上清液 , 并經(jīng)微孔濾膜過濾 , 用 帶熒光檢測器的高效液相色譜儀測定 , 以

8、外標(biāo)法 定量。色譜柱 :反相色譜柱 C18柱 (150mm ! 4. 6 mm 或相當(dāng)性能 ; 流動相 :乙腈 :四丁基溴化銨溶 液 =5 95(V V , 流速 1. 5mL /mi n , 熒光檢測器 檢測 , 激發(fā)波 長為 280nm , 發(fā)射波長 為 450n m 。 該方法的檢出限為 1. 0 g /kg。筆者經(jīng)過多次實 驗此外 , 關(guān)于環(huán)丙沙星殘留檢測 HPLC 法的改 進研究也有許多報道?？偟膩碚f , H PLC 法靈敏 度高 , 檢出限低 , 方法穩(wěn)定 , 特異性強 , 較其他檢測 方法具有明顯的優(yōu)勢 , 適合于作確證性檢測 , 所以 目前應(yīng)用非常廣泛。該方法的缺點是樣品的前處

9、 理較繁瑣 , 儀器費用相對較高。2. 4高效薄層色譜法高效薄層色譜法 (h i g h perfor m ance th i n layer chro m atography , H PTLC 的 出 現(xiàn) 使 薄 層 色 譜 法 (thin layer chro m atography , TLC 進 入了 新 的 時 期 , 現(xiàn)已成為僅次于 HPLC 的藥物殘留分析方法。 H PTLC 的斑點原位掃描定量、 定性和高效分離材 料 (5310 m 改變了常規(guī) TLC 在靈敏度和重現(xiàn) 性方面的不足 , 但保持了 TLC 簡便、 快速和樣品 容量大的優(yōu)點 , 可使用正相或反相板 , 分辨率幾乎

10、與 H PLC 相 當(dāng)。 HPTLC 在獸藥殘 留的快速 篩選 性檢測方面應(yīng)用廣泛。但目前用該法進行水產(chǎn)品 中環(huán)丙沙星的檢驗在大批量樣品的檢測中應(yīng)用較 少 , 還處于實驗室方法摸索階段。2. 5液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法液相色譜 -質(zhì)譜 聯(lián)用法 (liquid chr o m atogra phy-m ass spectrog raphy , LC -M S 的靈敏度 高 , 能方便地對微量獸藥殘留組分進行檢測 , 同時能 對獸藥殘留組分進行結(jié)構(gòu)確證。尤其是高效液相 色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC -M S /M S , 其 性能更 是在 LC -M S 的基礎(chǔ)上有了進一步提高 , 是近幾 年迅速

11、發(fā)展起來并在實 踐中得到廣泛應(yīng) 用的方 法。該方法尤其能在多組分殘留的確證檢測中發(fā) 揮重要作用。在環(huán)丙沙星相關(guān)檢測方法中 , GB /T 20751-2006、 GB /T20366-2006和 GB /T21312 -2007中規(guī)定的方法均采用 H PLC -M S /M S 法。 GB /T20751-2006中規(guī)定的檢測方法 :試樣 中殘留的喹諾酮類藥物采用乙腈提取 , 提取液經(jīng) 正己烷液液分配脫脂后 , 以強陽離子固相萃取小 柱凈化 , 液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜法測定 , 以外標(biāo)法定 量。色譜柱 :C18柱 , 5 m, 150mm ! 2. 1mm 或相 當(dāng)者 ; 流速 :200 L /

12、min , 柱溫 :30#。采 用電噴 霧源 ESI 、 多反應(yīng)檢測 (MR M 正離子模式。該方 法對鰻魚中 15種喹諾酮類藥物的檢出限均為 5 g /kg。筆者經(jīng)多次實 驗總結(jié) , 該 方法的回 收率 在 75%95%。/T190水產(chǎn)科技情報 2009, 36(4中 11種喹諾酮類藥物殘留的檢測 , 其檢測方法 :樣品經(jīng)甲酸 -乙腈 (98 2, V V 提取 , 提取液經(jīng)正 己烷凈化。液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀測定 , 以外標(biāo) 法定量。色譜柱 :C18柱 , 流動相 :乙腈 +2%甲 酸溶液 , 流速 :0. 8mL /mi n , 采 用電噴霧源、 多反 應(yīng)檢測正離子模式。該方法對樣品中環(huán)

13、丙沙星的 檢出限為 0. 1 g /kg, 回收率為 70%100%。 GB /T21312-2007中規(guī)定了 14種喹諾酮類 藥物殘留的檢測方法 :樣品經(jīng) 0. 1m ol/LEDTA -M ellvaine 緩沖液 (p H =4. 0 提取 , 過濾、 離心 , 上 清液經(jīng) HLB 固相萃取柱凈化 , 高效液相色譜 -串 聯(lián)質(zhì)譜檢測。用陰性樣品基質(zhì)加標(biāo)外標(biāo)法定量。 色譜柱 :C18柱 (100mm ! 2. 1mm, 1. 7 m 或其 他等效者 ; 流動相 :A:40+60甲醇 -乙腈溶液 , B : 0. 2%甲酸水溶液梯度淋洗 ; 流速 :0. 2mL /mi n , 采用電噴霧源

14、、 多反應(yīng)檢測正離子模式。該方法 對樣品中環(huán)丙沙星的檢出限為 2. 5 g /kg, 對水 產(chǎn)品樣品的回收率為 75%110%。因其具有檢出限低、 精密度高 , 尤其適合多殘 留藥物同時定量定性檢測等優(yōu)勢 , HPLC-MS /M S 法是近年來在環(huán)丙沙星甚至所有藥物殘留檢測中 最受關(guān)注 的方 法 , 我 國也陸 續(xù)頒 布了 3項采 用 H PLC-M S /MS 方法進行喹諾酮類藥物多殘留檢 測的方法。但該方法的前處理相對比較繁瑣 , 對 操作人員的技術(shù)要求較高 , 儀器費用昂貴。 2. 6免疫分析法免疫分析法 (i m m unoassays , I A S 是以抗原抗 體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)

15、的分析技術(shù) , 特點是特異性 高 , 簡單、 靈敏、 快捷 , 其中核心試劑是抗體。免疫 學(xué)方法較微生物方法和理 化分析方法靈 敏度更 高 , 除質(zhì)譜方法外 , 其特異性最好。免疫學(xué)方法主要有 ELI SA 方法 , 膠體金試紙 條和蛋白質(zhì)芯片 , 流動注射免疫分析 , 熒光免疫測 定法和 免 疫 傳 感 器 等 方法。這 幾 種 方 法 中 以 ELISA 方法靈敏度和特異性最高 , 單個檢測成本 最低。 ELI SA 試劑盒為定量方法 , 靈敏度可達納 克級 , 操作相對簡單 , 樣本處理后一次可進行上千 個樣本的檢測 , 可實行單個藥物檢測或多殘留檢 測。試紙條方法為定性方法 , 其特點

16、為操作簡單 , 樣本處理后檢測時間短 , 但靈敏度比 EL I SA 試劑 盒低 510倍 , 特異性差 , 僅適合殘留限量要求不 進行多殘留檢測 , 但靈敏度需進一步提高。 膠 體 金 免 疫 測 定 法 (collo i d al go l d i m m une technique CGI A 是一項利用膠體金顆粒作為標(biāo)記 物的新技術(shù)?？乖蚩贵w能夠吸附膠體金顆粒表 面形成一個蛋 白質(zhì)層 , 形成穩(wěn)定的蛋 白質(zhì)溶液。 以條狀纖維層析材料為固相 (通稱試紙條 , 通過 毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動 , 并同時使 樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體 (如抗體或抗原 發(fā)生高特異、

17、高親和性的免疫反 應(yīng) , 層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截流在層析 材料的一定區(qū)域 (檢測帶 , 通過酶反應(yīng)或直接運 用可目測的標(biāo)記物 (如膠體金 而得到直觀的實 驗現(xiàn)象 (如顯色 。而游離標(biāo)記物則越過檢測帶 , 達到與 結(jié) 合 標(biāo) 記 物 自 動分 離 之 目 的。農(nóng) 業(yè) 部 1077號公告 -1-2008中規(guī)定了對水產(chǎn)品中恩諾 沙星、 諾氟沙星和環(huán)丙沙星殘留的快速篩選測定 的膠體金免疫滲濾法。該方法只適合于大批量樣 品的粗篩 , 對于陽性樣品需經(jīng)色譜檢測定性。 2. 7高效毛細(xì)管電泳法高效毛細(xì)管電泳法 (h i g h-perfor m ance capil lar y e lectroph

18、oresis , H PCE 是 近年來發(fā)展起 來的 一項新技術(shù) , 具有操作簡單、 色 譜柱不受樣品污 染、 分析速度快、 分離效率高、 樣品用量少、 運行成 本低等優(yōu)點 , 有利于實際樣品的分析。目前這一 方法在實際檢測水產(chǎn)品中的環(huán)丙沙星時應(yīng)用得較 少。3結(jié)語自各國相繼在水產(chǎn) 養(yǎng)殖中禁用環(huán)丙 沙星以 來 , 對于其檢測方法的研究也越來越 受到關(guān)注。 我國于近幾年加緊頒布了多個相關(guān)檢測方法 , 許 多研究人員也在從事相關(guān)領(lǐng)域的研究。隨著技術(shù) 的發(fā)展和完善 , 檢測方法的準(zhǔn)確性和精密度等也 會繼續(xù)提高 , 在具體的檢測工作中 , 應(yīng)根據(jù)實際情 況選擇合適的檢驗方法。參考文獻1中華人民共和國農(nóng)業(yè)

19、部 . 農(nóng)業(yè)部公告第 236號 動物源食品中 恩諾沙星和環(huán)丙沙星 殘留檢測 方法 -高效液 相色譜 法 S .北京 :中國農(nóng)業(yè)出版社 , 2007.2中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 . 農(nóng)業(yè)部 783號公告 -2-2006水產(chǎn) 品中諾氟沙星、 鹽酸環(huán)丙沙星、 恩諾沙星殘留量的測定 液相 ( 191水產(chǎn)科技情報 2009, 36(43討論據(jù)報道 , 有機磷農(nóng)藥對動物體內(nèi)的乙酰膽堿 脂酶具有顯著的抑制作用 , 會導(dǎo)致乙酰膽堿代謝 紊亂。一般當(dāng)乙酰膽堿脂酶抑制達 40%60%時 , 動物可在幾秒內(nèi)死亡 1, 5, 6, 所以 , 有機磷農(nóng)藥 對水生生物的危害極大。根據(jù)表 2, 南美白對蝦 對 毒死蜱 %極為敏

20、感 , 96h 的 LC 50值為 0. 89 g / L 。也就是說 , 即使帶有極微量 毒死蜱 %的稻田 水流入養(yǎng)殖水體 , 也會對南美白對蝦產(chǎn)生嚴(yán)重危 害。因此 , 田間使用 毒死蜱 %, 要注意對周圍養(yǎng) 殖生物的安全距離和濃度。本次試驗中觀察到 , 低濃度組中 96h 后存活 下來的南美白對蝦個體很少死亡 , 不攝食的情況 下能存活 56d , 說明南美白對蝦受到輕度的影 響后也有一定存活率。在池塘養(yǎng)殖環(huán)境中 , 有機 磷農(nóng)藥污染后 , 易造成養(yǎng)殖池內(nèi)部分水體藥物濃 度過高 , 導(dǎo)致南美白對蝦中毒。有研究表明 , 用微 生物對環(huán)境中的有機磷農(nóng)藥進行凈化處理是行之 有效的 7。每年 78

21、月份是稻田使用 毒死蜱 %的高峰期 , 可采用提高生物制劑使用頻率的方法 來進行預(yù)防 , 利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶進行 水體中有機磷農(nóng)藥的去毒與凈化 , 維持水體穩(wěn)定。 本試驗初步研究了 毒死蜱 %對南美白對蝦 的單因子毒性 , 需要指出的是 , 溫度、 溶解氧和 p H 等理化因子的改變也會對有機磷類農(nóng)藥的毒性產(chǎn) 生影響 , 影響 LC 50值 , 因 此在實際應(yīng)用時 還應(yīng)考 慮這些因子的變化。有關(guān)問題尚待進一步探討。 參考文獻1楊先樂 , 湛嘉 , 黃艷平 . 有機磷農(nóng)藥對水生生物毒性影響的研 究進展 J.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報 , 2002, 11(4:378-382. 2簡慧敏 , 姚慶禎

22、 , 臧維玲 , 等 . 銅、 鎘、 敵敵畏和 甲胺磷 對南美 白對蝦的亞急性 毒性作用 J.生 態(tài)毒理學(xué) 報 , 2007, 2(2: 237-242.3吳邦燦 , 費龍 . 現(xiàn) 代環(huán)境監(jiān) 測技術(shù) M.北 京 :中國環(huán) 境科學(xué) 出版社 , 1999:252-254.4雷衍之 . 養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué) M.北京 :中國農(nóng)業(yè)出版社 , 2004: 201-203.5吳鼎勛 , 柴敏娟 , 鄧小紅 , 等 . 敵敵 畏對金魚 攝食行為 的影響 J.廈門大學(xué)學(xué)報 (自然科學(xué)版 , 2001, 40(3:827-831. 6毛德壽 , 同宗燦 . 環(huán)境生化毒理學(xué) M.沈陽 :遼寧大學(xué)出版 社 , 1986.

23、7劉云煥 , 陳東海 . 微生物降解有機磷農(nóng)藥的研究進 展 J.北 方環(huán)境 , 2005, 30(1:22-24.(上接第 191頁 色譜法 S .北京 :中國農(nóng)業(yè)出版社 , 2007.3中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督 檢驗檢疫 總局 , 中國 國家標(biāo)準(zhǔn) 化管理委員會 . GB /T20751-2006鰻 魚及制 品中十 五鐘喹 諾酮類藥物殘留 量的 測定 液 相色譜 -串聯(lián)質(zhì) 譜法 S.北 京 :中國標(biāo)準(zhǔn)出版社 , 2007.4中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督 檢驗檢疫 總局 , 中國 國家標(biāo)準(zhǔn) 化管理委員會 . GB /T20366-2006動 物源產(chǎn) 品中喹 諾酮類 殘留量的測定 液相色譜 -串聯(lián)

24、質(zhì)譜 S .北京 :中國標(biāo)準(zhǔn)出 版社 , 2007.5中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督 檢驗檢疫 總局 , 中國 國家標(biāo)準(zhǔn) 化管理委員會 . GB /T21312-2007動物源性食品中 14種喹 諾酮藥物殘留檢測方法 液相色譜 -質(zhì)譜 /質(zhì)譜法 S .北京 :中國標(biāo)準(zhǔn)出版社 , 2008.6中華人民共和國農(nóng)業(yè)部 . 農(nóng)業(yè)部 1077號公告 -1-2008水產(chǎn) 品中恩諾沙星、 諾氟沙星和環(huán)丙沙星殘留的快速篩選測 定 膠 體金免疫滲濾法 S.北京 :中國農(nóng)業(yè)出版社 , 2008.7劉麗貞 , 周婉蘋 , 薛冰 . 高效液相色譜 -熒光檢測法同時測定 魚肉組織中的諾氟沙星、 環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留 J.中國衛(wèi)生檢驗雜志 , 2008, 18(7:1296-1297.8謝東華 , 俞雪鈞 , 殷居易 , 等 . 高效 液相色譜 -質(zhì)譜聯(lián) 用法檢 測烤鰻中環(huán)丙沙星