實驗六蛋黃總膽固醇的測定(鄰苯二甲醛法)

1、實驗六 蛋黃總膽固醇的測定（鄰苯二甲醛法）一、實驗目的1、學習分光光度計的原理及操作。2、學習用分光光度法測定蛋黃中總膽固醇（脂肪）含量及標準曲線的制作。 二、基本原理膽固醇及其酯在硫酸存在下與鄰苯二甲醛作用，產生紫紅色物質，此物質在550nm由最大吸收值，可用比色法測定。膽固醇含量在400mg/100ml之內與吸光度呈現良好線性關系。本法操作簡便，靈敏、穩(wěn)定。實驗相關原理根據物質對光的吸收特征和吸收強度，對物質進行定性和定量的分析方法，稱為分光光度法(spectrophotometry)。該法具有一定的靈敏度和準確度，分析手續(xù)較簡便快速，儀器設備也不復雜，故應用很廣。 吸光度與液層厚度和溶液

2、濃度的乘積成正比，稱為朗伯比爾定律，簡稱比爾定律，即光的吸收定律。 吸光系數的大小，取決于物質(溶質、溶劑)的本性和光的波長。 1. 物質不同，則吸光系數不同，所以吸光系數可作為物質的特性常數。在分光光度法中，常用摩爾吸光系數來衡量顯色反應的靈敏度，值越大，靈敏度越高。 2. 溶劑不同，其吸光系數亦不同。3. 光的波長不同，其吸光系數亦不同。如將不同波長的單色光依次通過被分析物質，分別測得吸光度，然后繪制吸光度波長曲線，稱為吸收曲線(absorption curve)，吸收曲線上有極大值的部分，稱為吸收峰。吸收峰所對應的波長，稱為最大吸收波長，以符號max表示 ，這是物質定性的依據之一。4.單

3、色光的純度也影響吸光系數。單色光越純，即經單色器分光后的波長范圍越窄，其吸光系數越大。定量方法：1、吸光系數法 2、標準曲線法 不是任何情況下都能適用的。特別是在單色光不純的情況下，測得的吸光度值可以隨所用儀器不同而在一個相當大的幅度內變化不定，若用吸光系數換算成濃度，則將產生很大誤差。 先配制一系列濃度不同的標準溶液，在測定條件相同情況下，分別測定其吸光度，然后以標準溶液的濃度為橫坐標，以相應的吸光度為縱坐標，繪制AC關系圖，在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，就可以從標準曲線上查出樣品溶液的濃度。 3、對照法 標準曲線的制作（1）配置一系列濃度不同的標準溶液。（2）在測定條件相同的情況下，分

4、別測定其吸光度。（3）以標準溶液濃度為橫坐標，以相應的吸光度為縱坐標，繪制A-C關系圖。（4）在相同條件下測出樣品溶液的吸光度，從標準曲線上查出濃度。定性方法： 將一系列不同波長的單色光，照射到含待測組分的溶液，可測得相應的一系列吸光度。如果以吸光度為縱坐標，以波長為橫坐標作圖，便可得到該待測物質的吸收曲線。由于每一種物質均有其特征的吸收曲線，故可與其標準品比較而定性。但在實際工作中常用max 和來定性，max可從吸收曲線中吸收峰所對應的波長直接找出；通常需配制待 測物質三種不同濃度的溶液，于1cm吸收池中，在max處分別測定其吸光度，根據A=bc，即=A/bc，計算出，將三次結果平均，即得該

5、物質的摩爾吸光系數。三、試劑1. 鄰苯二甲醛試劑2. 90%醋酸3. 混合酸：等體積濃硫酸+等體積90%醋酸mg/ml標準膽固醇應用液5. 小牛血清四、操作步驟1、標準曲線的繪制： ，蒸餾水0.01ml，加入4ml混合酸，震蕩混勻，10分鐘后于550nm測定吸光值，以膽固醇量mg/100ml為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。2、樣品測定： 取2支試管，編號后加入醋酸0.4ml，血清0.01ml，再按照下表加入試劑。對照樣品鄰苯二甲醛0無水乙醇0混合酸3、加畢，混勻，靜置10分鐘后，以對照管校0于550nm測定吸光值，從標準曲線中查出相應的濃度。五、實驗結果試管編號標準膽固醇（6mg/mL）吸光度值10mL2345樣品吸光度因為K為如圖所畫直線斜率，所以樣品中的膽固醇量為：A/K2.10(mg/100mL)由于樣品中的蛋黃含量為600mg/