克隆基因的表達(dá)

1、第五章 克隆基因的表達(dá)基因表達(dá)(gene expression)是指儲(chǔ)存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個(gè)過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程。基因的表達(dá)主要涉及到兩個(gè)過程：轉(zhuǎn)錄和翻譯。思考:基因表達(dá)與克隆基因表達(dá)的異同? 從表達(dá)的對(duì)象、過程、場(chǎng)所等方面考慮。第一節(jié) 影響外源基因表達(dá)的因素利用基因工程技術(shù)高水平表達(dá)各種外源蛋白質(zhì)，無論在理論研究還是實(shí)際應(yīng)用上都是十分重要的。因此，如何使外源基因在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，成為基因工程中的關(guān)鍵問題。應(yīng)該指出，現(xiàn)在基因工程所涉及的受體細(xì)胞多種多樣，從細(xì)菌到高等動(dòng)植物細(xì)胞，乃至動(dòng)、植物個(gè)體；而所涉及到的基因

2、也是成千上萬，各不相同，這種差別使得對(duì)特定基因的表達(dá)研究就有其特定的個(gè)性。影響外源基因高效表達(dá)的各種因素：1. 外源基因的表達(dá)效率 啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。有效的轉(zhuǎn)錄起始是外源基因能否在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)的關(guān)鍵步驟之一，也可以說，轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的主要限速步驟。因此，選擇強(qiáng)的可調(diào)控啟動(dòng)子及相關(guān)的調(diào)控序列，是組建一個(gè)高效表達(dá)載體首先要考慮的問題。最理想的可調(diào)控啟動(dòng)子應(yīng)該是：在發(fā)酵的早期階段表達(dá)載體的啟動(dòng)子被緊緊地阻遏，這樣可以避免出現(xiàn)表達(dá)載體不穩(wěn)定，細(xì)胞生長緩慢或由于產(chǎn)物表達(dá)而引起細(xì)胞死亡等問題。當(dāng)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到一定的密度，通過多種誘導(dǎo)(如溫度、藥物等)使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始轉(zhuǎn)錄。 核糖

3、體結(jié)合位點(diǎn)的有效性。SD 序列是指原核細(xì)胞 mRNA 5端非翻譯區(qū)同 16S rRNA 3端的互補(bǔ)序列。按統(tǒng)計(jì)學(xué)的原則，一般 SD 序列至少含 AGGAGG 序列中的 4 個(gè)堿基。SD 序列的存在對(duì)原核細(xì)胞 mRNA 翻譯起始至關(guān)重要。 SD 序列和起始密碼子 AUG 的間距。AUG 是最首選的起始密碼子，GUG、UUG、AUU 和AUA有時(shí)也用作起始密碼子，但非最佳選擇。另外，SD 序列與起始密碼子之間的距離以 9±3 為適宜。密碼子組成。盡量避免使用罕用密碼子如：AGG、AGA(Arg)、CUA(Leu)等。 2. 表達(dá)質(zhì)粒的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 多數(shù)情況下，目標(biāo)基因的擴(kuò)增程度同基因表

4、達(dá)成正比，所以基因擴(kuò)增為提高外源基因的表達(dá)水平提供了一個(gè)方便的方法。對(duì)于原核和酵母表達(dá)體系而言，選擇高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，以其為基礎(chǔ)，組建表達(dá)載體。表達(dá)載體的穩(wěn)定性是維持基因表達(dá)的必需條件，而表達(dá)載體的穩(wěn)定性不但同表達(dá)載體自身特性有關(guān)，也與受體細(xì)胞的特性密切相關(guān)。所以在實(shí)際運(yùn)用時(shí)，要充分考慮兩方面的因素而確定好的表達(dá)系統(tǒng)。利用選擇壓力、盡量減少表達(dá)載體的大小、通過建立可整合到染色體中去的載體等待方式，可以增加表達(dá)質(zhì)粒的穩(wěn)定性。 3表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白。融合蛋白的載體部分通過構(gòu)象的改變，使外源蛋白不被選擇性降解。這種通過產(chǎn)生融合蛋白表達(dá)外源基因，特別是相對(duì)分子質(zhì)量較小的多肽或蛋

5、白編碼的基因，尤為合適。 產(chǎn)生可分泌的蛋白。如將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到大腸桿菌細(xì)胞的周質(zhì)或直接分泌到培養(yǎng)基。 外源蛋白可以在宿主細(xì)胞中以包涵體形式表達(dá)，這種不溶性的沉淀復(fù)合物可以抵抗宿主細(xì)胞中蛋白水解酶的降解，也便于純化。 選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞，有可能減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解。 采用位點(diǎn)特異性突變的方法，改變真核蛋白二硫鍵的位置，從而增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。 4. 工程菌的培養(yǎng)條件 由于細(xì)菌在100L以上的發(fā)酵罐中的生長代謝活動(dòng)與實(shí)驗(yàn)室條件下200mL搖瓶中的生長代謝活動(dòng)存在很大差異，在進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，工程菌株大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)和控制對(duì)外源基因的高效表達(dá)至關(guān)重要。優(yōu)化發(fā)酵過程既包括工藝

6、方面的因素也包括生物學(xué)方面的因素。工藝方面的因素如選擇合適的發(fā)酵系統(tǒng)或生物反應(yīng)器，目前應(yīng)用較多的有罐式攪拌反應(yīng)器、鼓泡反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器等。生物學(xué)方面的因素包括多方面，首先是與細(xì)菌生長密切相關(guān)的條件或因素，如發(fā)酵系統(tǒng)中的溶氧、pH 值、溫度和培養(yǎng)基的成分等，這些條件的改變都會(huì)影響細(xì)菌的生長及基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。生物因素的第二方面是對(duì)外源基因表達(dá)條件的優(yōu)化。在發(fā)酵罐內(nèi)工程菌生長到一定的階段后，開始誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，誘導(dǎo)的方式包括添加特異性誘導(dǎo)物和改變培養(yǎng)溫度等。使外源基因在特異的時(shí)空進(jìn)行表達(dá)不僅有利于細(xì)胞的生長代謝，而且能提高表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率。生物因素的第三方面是提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量。

7、外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量取決于外源基因表達(dá)水平和菌體濃度。在保持單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質(zhì)合成的總量。 5細(xì)胞的代謝負(fù)荷 外源基因在細(xì)菌中高效表達(dá)，必然影響宿主的生長和代謝，而細(xì)胞代謝的損傷，又必然影響外源基因的表達(dá)。合理地調(diào)節(jié)好宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系，是提高外源基因表達(dá)水平不可缺少的一個(gè)環(huán)節(jié)。第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)系統(tǒng)外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)是基因工程操作中最初取得成功的途徑。 1 原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn) 同所有的生命過程一樣，外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)包括兩個(gè)主要過程:即 DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA和 mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。與真

8、核細(xì)胞相比，原核細(xì)胞的表達(dá)有以下特點(diǎn): 原核生物只有一種RNA 聚合酶(真核細(xì)胞有三種)識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有 RNA的合成。 原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。操縱子是數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)的結(jié)合，是一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位。調(diào)控區(qū)主要分為三個(gè)部分:操縱基因(operator)、啟動(dòng)子 (promotor)及其他有調(diào)控功能的部位。 由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。原核生物染色體 DNA是裸露的環(huán)形 DNA，轉(zhuǎn)錄成 mRNA 后，可直接在胞漿中與核糖體結(jié)合翻譯形成蛋白質(zhì)。在翻譯過程中，mRNA可與一定數(shù)目的核糖體結(jié)合形成多核糖體(Polyribosome

9、)。兩個(gè)核糖體之間有一定長度的間隔，為裸露的 mRNA。每個(gè)核糖體可獨(dú)立完成一條肽鏈的合成，即這種多核糖體可以同時(shí)在一條 mRNA 鏈上合成多條肽鏈，大大提高了翻譯效率。 在雙鏈 DNA 分子中，只有一條鏈轉(zhuǎn)錄成 mRNA，這條鏈稱為有意義鏈(sense strand)，該基因的另一條鏈則稱反意義鏈(antisense strand)。在含有許多基因的 DNA 雙鏈中，每個(gè)基因的有意義鏈并不是在同一條 DNA 鏈上。也就是說，一條鏈上既具有某些基因的有意義鏈，也含有另外一些基因的反意義鏈。由于 mRNA 聚合酶是沿著 DNA 鏈的 35方向移動(dòng)，DNA 鏈與合成的 RNA鏈有反平行關(guān)系，所以

10、mRNA 鏈的合成方向是 53，mRNA 上的信息的閱讀是從多核苷酸鏈 5'末端向 3末端進(jìn)行。從轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向也可看出，在原核生物細(xì)胞內(nèi)當(dāng) mRNA的合成還沒有完成時(shí)，蛋白質(zhì)或多膚的翻譯就己經(jīng)開始了。 原核基因一般不含有內(nèi)含子(intron)，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。因此當(dāng)克隆的含有內(nèi)含子的真核基因在原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成 mRNA 前體后，其中內(nèi)含子部分不能被切除。 原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對(duì)基因產(chǎn)物的直接控制要慢。對(duì)RNA 合成的控制有兩種方式，一是起始控制(啟動(dòng)子控制)，二是終止控制(衰減子控制)。 在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有

11、一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16S核糖體RNA 3'末端堿基互補(bǔ)的序列，即 SD 序列，而真核基因則缺乏此序列。 從上述特點(diǎn)可以看到，欲將外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，必須考慮表達(dá)載體、外源基因的性質(zhì)、原核細(xì)胞的啟動(dòng)子和 SD 序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說必須滿足以下條件：通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用 cDNA 或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組 DNA(genomic DNA)；必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和 SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放

12、閱讀框架(open reading frame)；利用宿主細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)對(duì)宿主菌的毒害。2 原核生物作為受體細(xì)胞具備的特點(diǎn) 外源基因表達(dá)系統(tǒng)泛指目的基因與表達(dá)載體重組后，導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，并能在其中有效表達(dá)，產(chǎn)生目的基因產(chǎn)物(目的蛋白)。由此可知，外源基因表達(dá)系統(tǒng)由基因表達(dá)載體和相應(yīng)的受體細(xì)胞兩部分組成?；虮磉_(dá)系統(tǒng)有原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)和真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)。目前應(yīng)用最廣泛的是原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)等。原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下的特點(diǎn)： 原核生物大多數(shù)為單細(xì)胞異養(yǎng)，生長快，代謝易于控制，可通過發(fā)酵迅

13、速獲得大量基因表達(dá)產(chǎn)物。 基因組結(jié)構(gòu)簡單，便于基因操作和分析。 多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。 生理代謝途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制比較清楚。 不具備真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物無特定的空間構(gòu)象。 內(nèi)源蛋白酶會(huì)降解表達(dá)的外源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。 近年來，真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展很快，真核生物如酵母菌、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等也被廣泛用作基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞，并構(gòu)建了一系列相應(yīng)的表達(dá)載體。要使外源基因在細(xì)胞中高效表達(dá)，構(gòu)建的表達(dá)載體必須具備基因表達(dá)的基本條件，這些條件包括外源基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)、基因轉(zhuǎn)錄的水平、mRNA 翻譯的速率等。大腸桿菌

14、是一種革蘭氏陰性細(xì)胞，其遺傳背景清楚，目標(biāo)基因表達(dá)的水平高，培養(yǎng)周期短，目前大多數(shù)外源基因都是以大腸桿菌為受體系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的，它是目前為止應(yīng)用最廣泛的基因。3 在大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，由于待表達(dá)的外源基因結(jié)構(gòu)具有多樣性，尤其是真核生物基因的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌基因結(jié)構(gòu)之間存在較大的差異，因而在構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)時(shí)必須具體情況具體分析。一般來說，高效表達(dá)外源基因必須考慮以下基本原則： 優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)。為了提高外源基因的表達(dá)效率，在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)對(duì)決定轉(zhuǎn)錄起始的啟動(dòng)子和決定 mRNA 翻譯的SD序列進(jìn)行優(yōu)化。具體方法包括組合強(qiáng)啟動(dòng)子和強(qiáng)終止子；增加

15、SD 序列中與核糖體 16S rRNA 互補(bǔ)配對(duì)的堿基因序列，使 SD 序列中68 個(gè)堿基與核糖體16S rRNA 的堿基完全配對(duì)；根據(jù)待表達(dá)外源基因的不同情況調(diào)整 SD 序列與起始密碼子 ATG 之間的距離及堿基的種類；防止核糖體結(jié)合位點(diǎn)附近序列轉(zhuǎn)錄后形成“莖環(huán)”二級(jí)結(jié)構(gòu)。 提高稀有密碼子 tRNA 的表達(dá)作用。多數(shù)密碼子具有簡并性，而不同基因使用密碼子的頻率不相同。大腸桿菌基因?qū)δ承┟艽a子的使用表現(xiàn)了較大的偏愛性，在幾個(gè)同義密碼中往往只有一個(gè)或兩個(gè)被頻繁地使用。如編碼 Pro 的密碼子包括 CCG、CCC、CCU 和CCA 等，而其中的表達(dá)系統(tǒng)。第一個(gè)密碼子在大腸桿菌的基因中都高頻地出現(xiàn)，

16、而另外三個(gè)密碼子出現(xiàn)的頻率很低。同義密碼子使用的頻率與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的 tRNA 的豐度呈正相關(guān)，稀有密碼子的 tRNA在細(xì)胞內(nèi)的豐度很低。在 mRNA的翻譯過程中，往往會(huì)由于外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細(xì)胞內(nèi)稀有密碼子的 tRNA供不應(yīng)求，最終使翻譯過程終止或發(fā)生移碼突變。此時(shí)可通過點(diǎn)突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉(zhuǎn)換為在受體細(xì)胞中高頻出現(xiàn)的同義密碼子。 提高外源基因 mRNA 的穩(wěn)定性。大腸桿菌的核酸酶系統(tǒng)能專一性地識(shí)別外源 DNA或 RNA并對(duì)其進(jìn)行降解。對(duì)于 mRNA 來說，為了保持其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，可采取兩種措施，一是盡可能減少核酸外切酶可能對(duì)外源基因 mRNA的降解，二

17、是改變外源基因 mRNA 的結(jié)構(gòu)，使之不易被降解。 提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶，在外源基因表達(dá)產(chǎn)物的誘導(dǎo)下， 蛋白水解酶的活性可能會(huì)增加。因此，須采用多種措施提高外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。常用的方法包括：將外源基因的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中；選用某些蛋白水解酶缺陷株作為受體菌；對(duì)外源蛋白中水解酶敏感的序列進(jìn)行修飾或改造；在表達(dá)外源蛋白的同時(shí)，表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定因子。 優(yōu)化發(fā)酵過程。由于細(xì)菌在 100L 以上的發(fā)酵罐中的生長代謝活動(dòng)與實(shí)驗(yàn)室條件下200mL 搖瓶中的生長代謝活動(dòng)存在很大差異，在進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，工程菌株大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)化設(shè)計(jì)和控制對(duì)外

18、源基因的高效表達(dá)至關(guān)重要。優(yōu)化發(fā)酵過程既包括工藝方面的因素也包括生物學(xué)方面的因素。工藝方面的因素如選擇合適的發(fā)酵系統(tǒng)或生物反應(yīng)器，目前應(yīng)用較多的有罐式攪拌反應(yīng)器、鼓泡反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器等。生物學(xué)方面的因素包括多方面，首先是與細(xì)菌生長密切相關(guān)的條件或因素，如發(fā)酵系統(tǒng)中的溶氧、pH 值、溫度和培養(yǎng)基的成分等，這些條件的改變都會(huì)影響細(xì)菌的生長及基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。生物因素的第二方面是對(duì)外源基因表達(dá)條件的優(yōu)化。在發(fā)酵罐內(nèi)工程菌生長到一定的階段后，開始誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)，誘導(dǎo)的方式包括添加特異性誘導(dǎo)物和改變培養(yǎng)溫度等。使外源基因在特異的時(shí)空進(jìn)行表達(dá)不僅有利于細(xì)胞的生長代謝，而且能提高表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)率。

19、生物因素的第三方面是提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量。外源基因表達(dá)產(chǎn)物的總量取決于外源基因表達(dá)水平和菌體濃度。在保持單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)水平不變的前提下，提高菌體密度可望提高外源蛋白質(zhì)合成的總量。第三節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)系統(tǒng)1. 真核生物表達(dá)的優(yōu)越性和必要性 真核生物具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，可識(shí)別并刪除基因中的內(nèi)含子，剪切加工為成熟mRNA.具備完善的翻譯后加工系統(tǒng)，可進(jìn)行糖基化、乙酰化等修飾，使蛋白形成正確的天然構(gòu)型，因而真核生物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白更接近天然狀態(tài)，有利于其功能、生物活性的研究。某些真核細(xì)胞可將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中，簡化了純化工藝，降低了生產(chǎn)成本。另外，由于真核生物表達(dá)的

20、調(diào)控方式非常復(fù)雜，有助于我們深入了解基因調(diào)控的機(jī)制。2. 真核基因組的復(fù)雜性與原核生物比較，真核生物的基因組更為復(fù)雜，可列舉如下。（1）真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4×106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級(jí)，比細(xì)菌大千倍；大腸桿菌約有4000個(gè)基因，人則約有10萬個(gè)基因。（2）真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的層次和復(fù)雜性。（3）原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體。（4）如前所述，細(xì)菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱元的基因表達(dá)調(diào)控的單元，共同開啟或關(guān)閉

21、，轉(zhuǎn)錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱元的結(jié)構(gòu)，而真核細(xì)胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個(gè)基因協(xié)調(diào)表達(dá)的問題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)要比原核生物復(fù)雜得多。（5）原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實(shí)驗(yàn)表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。（6）原核生物的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon

22、)和內(nèi)含子(intron)，轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接(splicing)去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)。（7）原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個(gè)拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動(dòng)物基因組中則存在大量重復(fù)序列(repetitive sequences)。用復(fù)性動(dòng)力學(xué)等實(shí)驗(yàn)表明有三類重復(fù)序列：高度重復(fù)序列(highly repetitive sequences)，這類序列一般較短，長10300bp，在哺乳類基因組中重復(fù)106次左右，占基因組DNA序列總量的1060%，人的基因組中這類序列約占20%，功能還不明了。中度重復(fù)序列(moderately repetitive

23、sequences)，這類序列多數(shù)長100500bp，重復(fù)101105次，占基因組10-40%。例如哺乳類中含量最多的一種稱為Alu的序列，長約300bp，在哺乳類不同種屬間相似，在基因組中重復(fù)3-×105次，在人的基因組中約占7%，功能也還不很清楚。在人的基因組中18S/28SrRNA基因重復(fù)280次，5SrRNA基因重復(fù)2000次，tRNA基因重復(fù)1300次，5種組蛋白的基因串連成簇重復(fù)30-40次，這些基因都可歸入中度重復(fù)序列范圍。單拷貝序列(single copy sequences)。這類序列基本上不重復(fù)，占哺乳類基因組的50-80%，在人基因組中約占65%。絕大多數(shù)真核生

24、物為蛋白質(zhì)編碼的基因在單倍體基因組中都不重復(fù)，是單拷貝的基因。 從上述可見真核基因組比原核基因組復(fù)雜得多，至今人類對(duì)真核基因組的認(rèn)識(shí)還很有限，使現(xiàn)在國際上制訂的人基因組研究計(jì)劃(human gene project)完成，繪出人全部基因的染色體定位圖，測(cè)出人基因組109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互關(guān)系，特別是要明了基因表達(dá)調(diào)控的全部規(guī)律，還需要經(jīng)歷很長期艱巨的研究過程。3真核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)盡管我們現(xiàn)在對(duì)真核基因表達(dá)調(diào)控知道還不多，但與原核生物比較它具有一些明顯的特點(diǎn)。（1）真核基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)更多如前所述，基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整

25、個(gè)過程。同原核生物一樣，轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核(線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi))，翻譯則多在胞漿，兩個(gè)過程是分開的，因此其調(diào)控增加了更多的環(huán)節(jié)和復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控占有了更多的分量此外，真核細(xì)胞中還會(huì)發(fā)生基因擴(kuò)增(gene amplification)，即基因組中的特定段落在某些情況下會(huì)復(fù)制產(chǎn)生許多拷貝。最早發(fā)現(xiàn)的是蛙的成熟卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過程中其rRNA基因(可稱為rDNA)可擴(kuò)增2000倍，以后發(fā)現(xiàn)其他動(dòng)物的卵細(xì)胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精后迅速發(fā)育分裂要合成大量蛋白質(zhì)，需要有大量核糖體。又如MTX (methotrexate)是葉酸的

26、結(jié)構(gòu)類似物，一些哺乳類細(xì)胞會(huì)對(duì)含有利用葉酸所必需的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA區(qū)段擴(kuò)增4000倍，使DHFR的表達(dá)量顯著增加，從而提高對(duì)MTX的抗性?；虻臄U(kuò)增無疑能夠大幅度提高基因表達(dá)產(chǎn)物的量，但這種調(diào)控機(jī)理至今還不清楚。（2）真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)真核基因組DNA絕大部分都在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)中NA和組蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài)都影響轉(zhuǎn)錄，至少有以下現(xiàn)象：1）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄細(xì)胞分裂時(shí)染色體的大部分到間期時(shí)松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)(euchromatin)，松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄

27、。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)(heterochromatin)，其中從未見有基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)；原本在常染色質(zhì)中表達(dá)的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會(huì)停止表達(dá)；哺乳類雌體細(xì)胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活?？梢娋o密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)阻止基因表達(dá)。2）組蛋白的作用早期體外實(shí)驗(yàn)觀察到組蛋白與DNA結(jié)合阻止DNA上基因的轉(zhuǎn)錄，去除組蛋基因又能夠轉(zhuǎn)錄。組蛋白是堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基相結(jié)合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉(zhuǎn)錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質(zhì)中

28、的非組蛋白成分具有組織細(xì)胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉(zhuǎn)錄作用。發(fā)現(xiàn)核小體后，進(jìn)一步觀察核小體結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)活躍轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)段，有富含賴氨酸的組蛋白(H1組蛋白)水平降低，H2AH2B組蛋白二聚體不穩(wěn)定性增加、組蛋白乙?；?acetylation)和泛素化(ubiquitination)，以及H3組蛋白巰基化等現(xiàn)象，這些都是核小體不穩(wěn)定或解體的因素或指征。轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結(jié)構(gòu)。這些都表明核小體結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄。3）轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾尤旧|(zhì)DNA受DNase 作用通常會(huì)被降解成00、400bp的片段，反映了完整的核小體規(guī)則的重復(fù)結(jié)構(gòu)。但活躍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)域受DNase 消化