微生物檢驗(yàn)規(guī)范

1、微生物檢驗(yàn)規(guī)范1.目的明確微生物檢驗(yàn)方法和監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)范微生物檢驗(yàn)的各項(xiàng)操作,通過對(duì)原料、產(chǎn)品及生產(chǎn)線各要求環(huán)節(jié)進(jìn)行微生物測試，從檢測結(jié)果來判定原料、產(chǎn)品及生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的微生物情況是否符合公司和國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，確保產(chǎn)品品質(zhì)。2.適用范圍公司所有需要作微生物檢驗(yàn)的原料、每批產(chǎn)品及微檢監(jiān)控點(diǎn)。3。職責(zé)3。1 品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)微生物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)器材和無菌室的準(zhǔn)備工作。3。2品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)原料和生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的微檢樣品抽樣、保存、登記和微生物檢測工作。3。3成品制程人員負(fù)責(zé)成品微檢樣品的抽樣工作，品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)成品微檢樣品的保存、登記和微生物檢測工作。3。4品保微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)出具檢

2、測報(bào)告并作出符合性判定。3.5品?？崎L負(fù)責(zé)微生物檢測報(bào)告的審核。4。作業(yè)程序4.1實(shí)驗(yàn)器材4。1.1 實(shí) 驗(yàn) 器 材、培 養(yǎng) 基 和 試 劑 1 超凈工作臺(tái) 2 恒溫培養(yǎng)箱 36±13 低溫培養(yǎng)箱 2528 4 恒溫水浴鍋 46±15電子/托盤天平（精確到0。 1g) 6 高壓蒸汽殺菌鍋7 烘箱 8 酒精燈9 記號(hào)筆 10打火機(jī) 11鑷子 12藥匙 13. 生物濾膜 14培養(yǎng)皿 9cm/6cm15。 錐形瓶 300ml/500ml+硅橡膠塞 16試管 17小發(fā)酵管 18試管架19接種環(huán) 20顯微鏡 21塑料籃子 22移液管 1ml、5ml、10ml 23. 膜過濾設(shè)備 24

3、。 醫(yī)用不銹鋼剪刀4.1。2培養(yǎng)基和試劑 1總菌數(shù)培養(yǎng)基 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 2大腸菌群培養(yǎng)基 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）3。 霉菌、酵母菌培養(yǎng)基 虎紅培養(yǎng)基4氯化鈉6乙醇7二氧化氯粉劑8. 過氧乙酸4。2 微 生 物 檢 驗(yàn) 的 前 準(zhǔn) 備 4.2。1檢驗(yàn)所需器具的滅菌4。2。1.1培養(yǎng)皿及移液管的干熱滅菌潔凈干燥的培養(yǎng)皿，倒放于專用培養(yǎng)皿鐵筒內(nèi),潔凈干燥的移液管,尖端朝下,置于移液管專用的鐵筒內(nèi)，把鐵筒放在烘箱中，于 120干熱滅菌120分鐘后，調(diào)至 160-180干熱滅菌120分鐘后，關(guān)掉烘箱，自然冷卻至60以下,方可打開烘箱門取出置無菌室冷卻備用。4.2

4、。1。2錐形瓶及移液管的濕熱滅菌 潔凈的錐形瓶,塞上硅橡膠塞并用牛皮紙包扎好瓶口，潔凈的移液管，用牛皮紙包扎完善后，置于蒸汽滅菌鍋中，于121濕熱滅菌20分鐘即可。4。2.1.3鑷子、接種環(huán)等的火焰滅菌接種環(huán)、鑷子要在酒精燈上須灼燒過方可使用;稀釋操作時(shí)試管口應(yīng)在火焰上方；培養(yǎng)基容器口邊在火焰上方。4.2.1.4化學(xué)滅菌（75%酒精、100×10-6ClO2）無菌超凈臺(tái)，手部及不能加熱滅菌的PE或塑膠制品,桌子等需用化學(xué)滅菌法；操作臺(tái)、桌子、凳子、地面在使用完后均用100×106 ClO2擦洗滅菌.4。2.2培養(yǎng)基及其緩沖稀釋液的配制和濕熱滅菌4.2.2。1 0。9%生理鹽

5、水的配制稱取2。25g氯化鈉，溶于250ml蒸餾水中,經(jīng)濕熱滅菌即可。4.2。2。2 75%酒精的配制 取375ml無水酒精，則需加水375/0。75-375=125ml 4.2.2。3培養(yǎng)基的配制和滅菌條件測定項(xiàng)目培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基量/1000ml蒸餾水殺菌條件菌落總數(shù)平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基23.5g121×15分鐘大腸菌群結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂41。5g煮沸滅菌2分鐘大腸菌群煌綠乳糖膽鹽40g121×15分鐘霉菌酵母虎紅培養(yǎng)基35g121×20分鐘滅菌完全后的培養(yǎng)基置于46±1的水浴鍋中,待培養(yǎng)基的溫度降至46±1方可用.4。2。2.4 濕熱滅菌的步驟

6、：（1）檢查蒸壓釜中有否足夠的水。（2)檢查所有載有液體瓶子的螺旋蓋（或塞)是否有松動(dòng)。（3）檢查各待滅菌物品是否已用牛皮紙包裹完善.（4）小心地關(guān)好殺菌釜的蓋/門.除非每個(gè)鎖都已徹底鎖緊，否則不得加壓。(5）檢查排氣道或排氣閥是否打開。（6）加熱，使所有空氣從排氣道中隨著蒸汽自動(dòng)排出。蒸汽要猛烈排放2-3min，以保證蒸壓釜內(nèi)冷空氣全部排出。關(guān)閉通風(fēng)閥或排氣閥。（7）繼續(xù)加熱，至達(dá)到預(yù)定壓力及溫度。設(shè)備和培養(yǎng)基將在121下維持20min，以進(jìn)行滅菌。所需壓力要連續(xù)維持一定時(shí)間.(8）所需加熱時(shí)間一過,停止加熱。在排氣閥不打開的情況下讓壓力自動(dòng)下降到零。否則不要打開蒸壓釜。當(dāng)壓力為零時(shí)，小心打

7、開排氣閥，待蒸氣排盡后,打開蒸壓釜蓋，讓它敞開幾分鐘以泄去多余的熱蒸汽,并將釜內(nèi)原載有的物品充分冷卻。 (9）取出釜內(nèi)原載有培養(yǎng)基或生理鹽水的瓶子，將這些瓶子存放在無菌室的傳遞箱中待之冷卻備用。滅菌完成后的培養(yǎng)基，溫度降至46±1方可使用。所有滅菌完成后的物品，在使用前都必須保持包裹完善無破損的狀態(tài)。4.2.3無菌室及超凈臺(tái)的滅菌4。2.3.1每天實(shí)驗(yàn)前、后把無菌室地面及超凈臺(tái)打掃干凈，每天用100×106 ClO2消毒桌面、地面。每月用2%過氧乙酸熏蒸。4。2.3。2實(shí)驗(yàn)結(jié)束后打開紫外燈對(duì)無菌室空間和表面進(jìn)行殺菌1小時(shí)。4.2.3.3實(shí)驗(yàn)前,提前1小時(shí)打開超凈臺(tái)紫外燈及無

8、菌室紫外燈。關(guān)掉紫外燈后,打開無菌室和超凈臺(tái)通風(fēng)裝置，30分鐘后，即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。4。3。樣品的抽樣和判定標(biāo)準(zhǔn)4.3.1實(shí)驗(yàn)前應(yīng)登記樣品，給樣品編號(hào)，記錄檢驗(yàn)時(shí)間、品項(xiàng)、規(guī)格、生產(chǎn)日期、批號(hào)、檢測項(xiàng)目等，并根據(jù)樣品數(shù)來配制培養(yǎng)基.4。3。2樣品的抽樣和判定標(biāo)準(zhǔn)天然水的產(chǎn)品名，抽樣量、檢測項(xiàng)目、頻率、方法、標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品品項(xiàng)抽樣頻率檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)時(shí)間550ml/1.25L天然水正常：1瓶/2小時(shí)/線開(關(guān)）機(jī)：2瓶/線細(xì)菌總數(shù)濾膜法50個(gè)/100ml恒溫室放置2天后檢驗(yàn)大腸菌群濾膜法不得檢出霉菌酵母濾膜法20個(gè)/100ml細(xì)菌總數(shù)GB-478920個(gè)/ml霉菌酵母GB47895個(gè)/ml

9、備注：按抽樣頻率,檢驗(yàn)方法一半采用GB-4789，一半采用濾膜法。4.3。3生產(chǎn)線微檢監(jiān)控點(diǎn)的樣品的抽樣和判定標(biāo)準(zhǔn)各監(jiān)控點(diǎn)名，抽樣量、檢測項(xiàng)目、頻率、方法、標(biāo)準(zhǔn)線別監(jiān)控點(diǎn)檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定檢驗(yàn)頻率水處理源水菌落總數(shù)取合適的稀釋倍數(shù)做濾膜法監(jiān)控項(xiàng)目1次/周大腸菌群霉菌酵母砂濾出水,碳罐出水菌落總數(shù)取合適的稀釋倍數(shù)做濾膜法監(jiān)控項(xiàng)目1次/維護(hù)后大腸菌群霉菌酵母精濾出水菌落總數(shù)取合適的稀釋倍數(shù)做濾膜法監(jiān)控項(xiàng)目1次/天大腸菌群霉菌酵母RO膜系統(tǒng)出水菌落總數(shù)濾膜法10cfu/100ml1次/維護(hù)后大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母5cfu/100ml精濾UV后出水菌落總數(shù)濾膜法50cfu/100m

10、l1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母50cfu/100ml膜出水、膜產(chǎn)水儲(chǔ)罐、兌制水儲(chǔ)罐、兌制水UV后、菌落總數(shù)濾膜法10cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母5cfu/100ml氧化塔出水、洗瓶水菌落總數(shù)濾膜法3cfu/100ml1次/天大腸菌群0cfu/100ml霉菌酵母0cfu/100ml水線灌裝頭（開機(jī)前）菌落總數(shù)霉菌酵母擦拭法2個(gè)/每灌裝頭1次/周灌裝頭5個(gè)/每灌裝頭洗瓶頭(開機(jī)前）2個(gè)/每洗瓶頭洗瓶頭5個(gè)/每灌裝頭封蓋頭5個(gè)/10cm2蓋滑槽5個(gè)/10cm2撥蓋星輪5個(gè)/10cm2蓋貯存槽5個(gè)/10cm2蓋斗5個(gè)/10cm2蓋輸送帶5個(gè)/10cm2

11、洗瓶夾5個(gè)/10cm2門內(nèi)壁20個(gè)/10cm2充填槽外壁或頂部20個(gè)/10cm2風(fēng)送軌道20個(gè)/10cm2輸送帶(接近灌裝機(jī)）20個(gè)/10cm2沖洗后空瓶平均2個(gè)/瓶蓋下滑道中蓋平均2個(gè)/蓋操作人員手部50個(gè)/雙手操作人員衣服50個(gè)/10cm24.4微生物檢測方法 4。4.1濾膜法： 適用于進(jìn)行濾膜法檢測的各種微檢樣品。4。4。1。1 儀器：冰箱：04；恒溫培養(yǎng)箱：36±1/25-28；恒溫水浴鍋:46±1；電子天平：精確至0.1g；滅菌平皿：直徑60mm或90mm；膜過濾設(shè)備;濾杯；0.45m濾膜；超凈工作臺(tái)；真空泵；高壓滅菌鍋；滅菌的剪子、鑷子、玻璃瓶及其它物品。4.4

12、.1.2試劑與培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽培養(yǎng)基，0。9%生理鹽水，121滅菌20min；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂煮沸滅菌2min;75%乙醇；100ppm二氧化氯.4。4。1。3操作步驟：（1）將樣品搖勻，取100ml倒入膜過濾裝置中，打開抽濾泵，開始抽濾,抽干濾液后關(guān)上抽濾泵.（2）將鑷子在火焰上滅菌，膜用滅菌過的鑷子取下，在火焰旁正面貼于預(yù)先制備的培養(yǎng)基平皿中,平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)菌落總數(shù)，虎紅瓊脂培養(yǎng)基用于培養(yǎng)霉菌和酵母菌，VRBA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸菌群，膜下避免出現(xiàn)氣泡。(3）培養(yǎng)a.菌落總數(shù)：倒置于36±1的恒溫箱中，培養(yǎng)48h±2h.菌落總

13、數(shù)以實(shí)際菌數(shù)報(bào)告之，單位為cfu/100ml或cfu/ml。b。霉菌和酵母菌：倒置于2528恒溫箱中，3d后開始觀察,共培養(yǎng)觀察5d。菌落總數(shù)以實(shí)際菌數(shù)報(bào)告之，單位為cfu/100ml或cfu/ml。c。大腸菌群倒置于36±1的恒溫箱中，培養(yǎng)18h24h。取出平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36±1培養(yǎng)24h48h，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,即可報(bào)告為大腸菌群陽性。大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告：經(jīng)最后

14、證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每100ml樣品中大腸菌群數(shù)。例:在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100×6/10/100ml=60cfu/100ml.4。4。2國標(biāo)法：適用于不能用濾膜法檢測的各種微檢樣品以及規(guī)定用國標(biāo)法檢測的樣品。4。4。2。1菌落總數(shù)4。4。2。1。1設(shè)備與材料：冰箱：04;恒溫培養(yǎng)箱:36±1；恒溫水浴鍋：46±1；電子天平：精確至0.1g；滅菌吸管；滅菌平皿：直徑90mm或60mm；超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋及其它物品

15、。4.4。2。1.2培養(yǎng)基與試劑：平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，0.9%生理鹽水，121滅菌20min；75乙醇；100×10-6 ClO2溶液。4。4。2.1.3操作步驟：(1）樣品稀釋及培養(yǎng)a.以無菌操作取樣品。b。取樣品25（g）ml加入到225ml滅菌生理鹽水中，經(jīng)充分混勻制成1:10的樣品勻液。c。用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面），振搖試管,混合均勻，做成1：100的稀釋液。d。另取1ml滅菌吸管，按上述操作方法，制備10倍系列遞增稀釋樣品勻液,如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。

16、e。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴厩闆r估計(jì),選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度（液體樣品可包括原液），對(duì)于菌數(shù)較少的樣品,采用原倍。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，同時(shí)分別取1ml稀釋液加入無菌平皿中作空白對(duì)照。及時(shí)將67ml或1520ml冷卻至46的培養(yǎng)基傾注入平皿。采用原倍培養(yǎng)的,直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中作為空白。f。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h.（2）菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器.記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(CFU）表示。a。選取菌落數(shù)在30300CFU之

17、間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù).b。其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。c.當(dāng)平板上出現(xiàn)菌藻間無明顯界線的鏈狀生長時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。(3) 菌落總數(shù)的計(jì)算方法 a.若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升)中菌落總數(shù)結(jié)果. b。若

18、有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按下式計(jì)算：N=C/（n1+0.1n2）d 式中： N-樣品中菌落數(shù); C-平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和; n1第一個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；n2第二個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)；d-稀釋因子（第一稀釋度)。 c。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300,則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。 d。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。 e.若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。 f.若所有稀釋

19、度的平板菌落數(shù)均不在30-300之間，其中一部分小于30或大于300時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。（4）菌落總數(shù)的報(bào)告 a.菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。 b。大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約,取前兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。 c。若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù),則報(bào)告菌落蔓延。 d。若空白對(duì)照上有菌落生長,則此次檢測結(jié)果無效. e.稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告,體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。 4。4.2。2酵母和霉菌4.4。2。2

20、.1設(shè)備與材料：冰箱：04；恒溫培養(yǎng)箱：2528；恒溫水浴箱：46±1；電子天平：精確至0. 1g;滅菌具塞錐形瓶：500ml；滅菌平皿：直徑90mm或60mm；滅菌試管及其它滅菌設(shè)備；4.4。2。2。2培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基，0.9生理鹽水，121滅菌20min,75乙醇，100×10-6 ClO2溶液。4。4.2。2.3操作步驟（1）樣品稀釋及培養(yǎng)a。以無菌操作取樣品。b.取樣品25（g）ml加入到225ml滅菌生理鹽水中,經(jīng)充分混勻制成1：10的樣品勻液.c。用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不

21、要觸及稀釋液液面）,振搖試管,混合均勻，做成1：100的稀釋液.d.另取1ml滅菌吸管，按上述操作方法，制備10倍系列遞增稀釋樣品勻液，如此每遞增稀釋一次,即換用1支1ml滅菌吸管。e。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴厩闆r估計(jì),選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度（液體樣品可包括原液)，對(duì)于菌數(shù)較少的樣品，采用原倍.在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí),每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi),同時(shí)分別取1ml稀釋液加入無菌平皿中作空白對(duì)照.及時(shí)將6-7ml或15-20ml冷卻至46的培養(yǎng)基傾注入平皿。采用原倍培養(yǎng)的，直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中作為空白。f。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板,置于25-28霉酵培養(yǎng)箱中。

22、3d后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5d . （2）計(jì)算方法：通常選擇菌落數(shù)在10-150之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，同稀釋度的兩個(gè)平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）檢樣中含霉菌和酵母數(shù),稀釋度選擇及菌落報(bào)告方式可參考菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)方法。(3）報(bào)告：每克（或毫升）樣品中所含的霉菌和酵母菌數(shù)以cfu/g（ml）表示.4.4.2.3大腸菌群4.4。2.3。1設(shè)備與材料:冰箱：04；恒溫培養(yǎng)箱：36±1；恒溫水浴鍋：46±1；電子天平：精確至0.1g;滅菌吸管；滅菌平皿：直徑90mm或60mm；超凈工作臺(tái)；高壓滅菌鍋及其它物品。4.4。2.3.2培養(yǎng)基與試劑：煌綠乳糖膽鹽(BGLB)

23、,0.9生理鹽水，121滅菌20min；結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA）,煮沸滅菌2分鐘；75乙醇；100×10-6 ClO2溶液。4。4.2。3。3操作步驟(1)樣品稀釋a。以無菌操作取樣品.b.取樣品25（g）ml加入到225ml滅菌生理鹽水中，經(jīng)充分混勻制成1：10的樣品勻液。c.用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入盛有9ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液液面)，振搖試管，混合均勻,做成1:100的稀釋液。d.另取1ml滅菌吸管，按上述操作方法，制備10倍系列遞增稀釋樣品勻液，如此每遞增稀釋一次,即換用1支1ml滅菌吸管。e。根據(jù)食品

24、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇游廴厩闆r估計(jì)，選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度(液體樣品可包括原液）,對(duì)于菌數(shù)較少的樣品，采用原倍。在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí),每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無菌平皿內(nèi),同時(shí)分別取1ml稀釋液加入無菌平皿中作空白對(duì)照。及時(shí)將67ml或15-20ml冷卻至46的培養(yǎng)基傾注入平皿。采用原倍培養(yǎng)的,直接將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中作為空白. (2）平板計(jì)數(shù) a.選取2個(gè)3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)無菌平皿，每皿1mL。同時(shí)分別取1mL生理鹽水加入兩個(gè)無菌平皿作空白對(duì)照。 b.及時(shí)將67ml或1520ml冷至46的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA）傾注于每個(gè)平皿中，小心旋轉(zhuǎn)平皿，

25、將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后，再加3mL4mLVRBA覆蓋平板表層,翻轉(zhuǎn)平板，置于36±1培養(yǎng)18h24h.(3）平板菌落的選擇選取菌落數(shù)在30150之間的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落.典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0。5mm或更大。(4）證實(shí)試驗(yàn)從VRBA平板上挑去10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，分別移種與BGLB肉湯管內(nèi)，36±1培養(yǎng)18h24h，觀察產(chǎn)氣情況,凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽性。(5）大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽性的試管比例乘以(3）中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為

26、每克(每毫升)樣品中大腸菌群數(shù)。例：104樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105(CFU/g）CFU/mL.附：大腸菌群檢驗(yàn)程序 檢樣25g(25mL）樣品+225mL稀釋液，均質(zhì)稀 釋選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品均液，接種VRBA平板36±1 18h24h計(jì)數(shù)典型和可疑菌落BGLB肉湯或復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 36±1 18h24h 報(bào)告4.4。3空氣落菌檢驗(yàn) 4.4.3。1設(shè)備與材料：恒溫培養(yǎng)箱：36&#

27、177;1；霉酵培養(yǎng)箱：2528；電子天平：精確至0. 1g；滅菌平皿：直徑90mm；高壓滅菌鍋及其它物品。4。4.3.2培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，121滅菌20min。4。4。3.3操作步驟（1） 在已經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中分別傾注已經(jīng)過滅菌后的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基 ，靜置使其自然凝固.（2）將已凝固的培養(yǎng)基正向放置于需檢測空氣落菌的地點(diǎn)，將培養(yǎng)皿的蓋取下,蓋口朝下,輕輕搭放在培養(yǎng)皿的邊緣。（3） 將培養(yǎng)皿放置30分鐘后,蓋好培養(yǎng)皿蓋取回，菌落總數(shù)平板倒放于36±1恒溫箱中培養(yǎng)48h±2h，霉酵平板倒放于2528低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。（4）計(jì)數(shù)：

28、可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。4。4。4空氣浮游菌檢驗(yàn) 4.4。4。1設(shè)備與材料：浮游空氣塵菌采樣器；恒溫培養(yǎng)箱：36±1;霉酵培養(yǎng)箱：25-28，電子天平:精確至0。 1g;滅菌平皿:直徑90mm;高壓滅菌鍋及其它物品。4.4。4。2培養(yǎng)基與試劑：虎紅培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，121滅菌20min。4.4。4.3操作步驟（1）在已經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)皿中分別傾注已經(jīng)過滅菌后的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基或虎紅培養(yǎng)基,靜置使其自然凝固。（2）將浮游空氣塵菌采樣器置于被測區(qū)域,打開采樣蓋，對(duì)采樣蓋進(jìn)行擦拭消毒，將預(yù)先制備的平皿開口置于采樣器上，蓋上采樣蓋。設(shè)置采樣的流量為50L。（3）

29、采樣結(jié)束后，打開采樣蓋取出平皿蓋好。菌落總數(shù)平板倒放于36±1恒溫箱中培養(yǎng)48h±2h,霉酵平板倒放于2528低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。（4）計(jì)數(shù):可用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏.4.4.5棉簽擦拭試驗(yàn) 表面微生物評(píng)估4.4.5。1 儀器擦拭用棉簽,0。9%生理鹽水，121滅菌20min；酒精燈；75酒精；記號(hào)筆；其它同菌落總數(shù)的檢測方法。4.4。5.2 培養(yǎng)基與試劑平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基 4.4.5.3操作步驟（1）將棉簽和生理鹽水121滅菌20min。（2）手經(jīng)75酒精消毒后，或戴用酒精浸泡過的手套持棉簽的后端部擦拭； (3）擦拭：a。設(shè)備及其它平整的表面：用無菌棉簽擦拭10cm2 面積的設(shè)備或其它平整的表面， 往返涂擦兩遍,每擦拭一遍，將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次。如檢測表面狹長,可使其總面積達(dá)到10cm2，如所檢測表面面積較小，可適當(dāng)減少擦拭面積。b.灌裝頭或其它不規(guī)則表面:用無菌棉簽擦拭灌裝頭表面,盡量擦拭整個(gè)灌裝頭，往返涂擦兩遍，每擦拭一遍,將棉簽轉(zhuǎn)動(dòng)一次.c.手部: 讓受試者張開手指,用無菌棉簽擦拭