淫羊藿提取物的雌激素樣作用研究

1、淫羊藿提取物的雌激素樣作用研究         11-01-07 15:43:00     編輯：studa20               作者：于燕，顏虹，胡森科，張敬華 【摘要】  目的 評價淫羊藿提取物的雌激素樣作用。方法 采用小鼠子宮增重實驗、雌激素受體陽性細(xì)胞系(MCF7)7【關(guān)鍵詞】  淫羊藿

2、提取物 雌激素樣作用ABSTRACT: Objective  To investigate the estrogenlike effects of Epimedium extractive. Methods  By using the uterus growth test in mice and test of MCF7 proliferation and adding estrogen receptor antagonist Icariin, we evaluated the estrogenic effects of Epimedium and Icariin and

3、the possible mechanism. Results  Epimedium and Icariin increased significantly the uterus coefficient in mice from 0.097±0.008 to 0.156±0.018 and 0.152±0.016, respectively; the weight increased significantly from (18.9±1.3)g to (19.8±1.3)g and (20.03±1.3)g (P<0.

4、05). Icariin increased significantly the serum level of E2 from (132.22±11.45)ng/L to (147.73±12.43)ng/L and decreased FSH level from (50.15±3.36)g/L to (44.47±2.46)g/L (P<0.05), but there was no significant difference in Epimedium group. There was obviously enhanced prolifera

5、tion in MCF7 in 24, 48 and 72h (P<0.05), from 0.238±0.043, 0.387±0.051 and 0.563±0.083 to 0.362±0.045, 0.521±0.046 and 0.648±0.043 as well as 0.324±0.043, 0.465±0.034 and 0.622±0.079, respectively. However, the cell proliferation was inhibited signific

6、antly by Icariin added in 72h, the proliferation ratio decreased to 99.461% and 94.434%, respectively. Conclusion  Epimedium and Icariin have estrogenlike effects and all of their effects are realized through the estrogen receptor.KEY WORDS: Epimedium; extractive; estrogenlike effect淫羊藿作為傳統(tǒng)補(bǔ)腎壯陽

7、藥，具有顯著的生物學(xué)活性1。體內(nèi)藥理實驗研究顯示，淫羊藿提取物具有性激素樣作用，能使雌性小鼠子宮增重2，但其雌激素活性成分及作用機(jī)制尚不清晰。本實驗選用淫羊藿苷含量較高的陜西產(chǎn)淫羊藿3，提取并純化淫羊藿苷4，分別通過體內(nèi)、外實驗評價淫羊藿苷的雌激素樣作用，為更年期婦女保健及雌激素依賴性腫瘤(如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等)患者的臨床用藥提供指導(dǎo)。1  材料與方法1.1  淫羊藿苷的提取及純化4   淫羊藿純化、濃縮后，總干燥物中淫羊藿苷含量為62.3%。淫羊藿藥材為免煎劑，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，生藥含量300mg/mL。1.2 動物

8、、分組及給藥 昆明種小鼠80只，雌性，出生后21d(斷乳鼠)，體重912g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，二級動物室飼養(yǎng)。陽性藥物為雌二醇注射液(E2)，2mg/mL，北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，用植物油配制成35g/mL的懸濁液。實驗動物按體重隨機(jī)分為4組：陰性對照組、陽性對照組、淫羊藿組以及淫羊藿苷組，每組20只。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)6d后，陰性對照組給予等體積植物油；陽性對照組按0.35mg/(kg·d)給予E2；淫羊藿組按3g/(kg·d)給予淫羊藿；淫羊藿苷組按3.5mg/(kg·d)給予淫羊藿苷。早、晚各灌胃1次，連續(xù)4d。各組動物于最后1次

9、給藥后第2天，取10只稱重，脫臼處死，心臟取血，分離血清，ELISA法測定雌二醇(E2)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)水平；分離子宮并稱重，計算子宮系數(shù)(即：子宮濕重/體重×100%)。另10只眼眶后靜脈叢取血，4存放過夜，2000r/min離心10min，小心分離血清，56 30min滅活補(bǔ)體，0.22m微孔濾膜過濾，-20貯存，供細(xì)胞培養(yǎng)用。1.3 細(xì)胞培養(yǎng)試劑及儀器 DMEM(高糖)、無酚紅DMEM(高糖)、活性炭葡聚糖苷處理的胎牛血清(CDTFBS)為Hyclone公司產(chǎn)品；小牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)；E2、MTT、DMSO(Sigma公司

10、)；ICI 182，780(Tocris公司)。雌激素敏感性人乳腺癌MCF7細(xì)胞購自中科院細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。CO2培養(yǎng)箱(BD)；酶聯(lián)免疫檢測儀(EPSON LX800)；倒置顯微鏡(Olympus)。1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF7于含100mL/L小牛血清的DMEM高糖溶液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37、50mL/L CO2、相對飽和濕度。實驗開始前4d將細(xì)胞用PBS洗滌2次后，改為在無酚紅DMEM(含50mL/L CDTFBS)中培養(yǎng)，以耗盡細(xì)胞內(nèi)儲存的雌激素。1.5 MTT細(xì)胞增殖實驗MCF7細(xì)胞經(jīng)無酚紅DMEM(含50mL/L CDTFBS)培養(yǎng)4d后，選取對數(shù)生長期細(xì)

11、胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS(pH 7.4)洗2次，加入無血清DMEM，以每孔2×103個的濃度接種于96孔板內(nèi)。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含100mL/L試驗血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每種血清設(shè)8個復(fù)孔。分別于24、48、72h時，加入MTT(5g/L，每孔15L)繼續(xù)孵育4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150L，震蕩510min，使結(jié)晶物完全溶解。以DMSO調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm下測定各孔吸光度(A)值，計算平均A值和增殖率(proliferation rate，PR)。PR=(實驗組A值/陰性對照組A值)×100%。1.6 ICI細(xì)胞增

12、殖拮抗實驗 取經(jīng)無酚紅DMEM(含50mL/L CDTFBS)培養(yǎng)4d后的MCF7細(xì)胞，以每孔2×103個接種于96孔板。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含100mL/L試驗血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，各孔分別加入ICI(終濃度：1×10-8mol/L)，每種受試物設(shè)8個復(fù)孔。于72h加入MTT(5g/L，每孔15L)，孵育4h后吸去培養(yǎng)液，以DMSO溶解，在570nm下測定各孔A值，計算平均A值和增殖率。1.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包建立數(shù)據(jù)文件并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料均數(shù)比較，經(jīng)方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析(oneway AN

13、OVA)，組間多重比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 淫羊藿及淫羊藿苷對性未成熟小鼠體重及子宮濕重的影響 淫羊藿及淫羊藿苷組小鼠體重增幅明顯高于陰性對照組，且均能明顯增加子宮重量，但增幅與E2對照組比較相對較小(表1)。表1  淫羊藿及淫羊藿苷對小鼠體重和子宮濕重的影響（略）     11-01-07 15:43:00     編輯：studa202.2 淫羊藿及淫羊藿苷對性未成熟小鼠血清E2、LH、FSH水平的影響 與陰性對照組比較，淫羊藿苷可

14、明顯提高血清雌激素水平，降低FSH水平，但淫羊藿組僅表現(xiàn)為FSH水平降低(表2)。2.3  淫羊藿及淫羊藿苷對MCF7細(xì)胞增殖及增殖拮抗的影響 在24、48、72h，淫羊藿、淫羊藿苷對MCF7細(xì)胞增殖均有明顯的促進(jìn)作用，但與E2組比較細(xì)胞增殖作用明顯較弱。加入ICI后，對細(xì)胞增殖作用均受到抑制，與陰性對照組相比無顯著性差異(表3)。表2  淫羊藿及淫羊藿苷對小鼠血清E2、LH和FSH的影響（略）表3  MTT法檢測淫羊藿及淫羊藿苷對MCF7細(xì)胞增殖及增殖拮抗的影響（略）3 討論    淫羊藿是一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)腎陽、

15、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等多種功效。淫羊藿苷是其主要單體成分，對于改善心血管系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等均表現(xiàn)出生理活性1。整體藥理實驗表明，淫羊藿及淫羊藿提取物可能具有雌激素樣作用5，提示淫羊藿苷可能是發(fā)揮藥理活性的主要物質(zhì)。    本研究應(yīng)用體內(nèi)實驗小鼠子宮增重法檢測受試物的雌激素樣作用6。由于子宮含有大量的雌激素受體(ERs)，雌激素或具有雌激素活性的化合物通過與該受體結(jié)合，可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，使子宮的雌激素誘導(dǎo)蛋白(IPs)含量增加，而表現(xiàn)為子宮組織增生。為了減少內(nèi)源性雌激素的分泌對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響，本實驗選用的是初斷乳、性未成熟的雌性小鼠，以子宮濕重與

16、體重之比作為評價雌激素活性的指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示，淫羊藿及淫羊藿苷均能明顯誘導(dǎo)子宮增重，與文獻(xiàn)報道淫羊藿或淫羊藿提取物具有雌激素樣作用一致7；且淫羊藿及淫羊藿苷的子宮增重作用與E2比較相對較弱，提示植物雌激素的作用相對緩和。該結(jié)果為絕經(jīng)期婦女因卵巢功能減退、體內(nèi)雌激素水平低下而采取植物雌性激素替代療法提供了安全性保證。    資料顯示植物雌激素可改變體內(nèi)E2、FSH、LH水平，發(fā)揮雌激素樣作用。本實驗結(jié)果顯示，淫羊藿苷可提高小鼠血清雌激素水平，其機(jī)制可能是由于其所含的活性成分提高了LH水平，但其具體途徑尚不清楚。而淫羊藿對血清雌激素影響不顯著，這可能是由于其結(jié)構(gòu)與雌

17、激素類似，與下丘腦的ER結(jié)合，從而對促黃體生成激素釋放激素(LHRH)、促卵泡激素釋放激素(FSHRH)的分泌產(chǎn)生反饋抑制作用，導(dǎo)致垂體FSH、LH分泌減少，并最終導(dǎo)致血清雌激素水平無明顯變化。但淫羊藿苷與E2相比雌激素作用相對較弱，再次從生化水平證實，植物雌激素作用相對緩和的特點。    資料顯示植物雌激素如異黃酮植物雌激素，能明顯促進(jìn)動物的生長8。本實驗結(jié)果顯示，用藥后動物體重增幅顯著高于陰性對照組，提示淫羊藿及淫羊藿苷有生長促進(jìn)作用。其原因可能是淫羊藿及淫羊藿苷直接作用于肌肉細(xì)胞的雌激素受體，促進(jìn)動物肌肉蛋白質(zhì)積累，使肌細(xì)胞增大，并促進(jìn)肝臟蛋白質(zhì)合成，使血清

18、白蛋白等含量升高9。且有研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素在作用于動物性腺軸的同時也作用于其生長軸，通過與下丘腦、垂體等部位雌二醇受體結(jié)合，降低生長抑素水平，從而提高生長激素(GH)水平，并上調(diào)肝臟GH受體，使胰島素樣生長因子1(IGF1)水平升高，從而促進(jìn)動物生長8。    應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)，特別是通過檢驗受試物與雌激素依賴性腫瘤細(xì)胞增殖間的關(guān)系，不僅可揭示受試物的雌激素樣作用，也可以進(jìn)一步探索其發(fā)揮作用途徑和機(jī)制10。MCF7細(xì)胞是A型雌激素受體(ERA)陽性的人乳腺癌細(xì)胞株，可特異性地與雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)作用而增殖，對細(xì)胞增殖具有正性作用。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SE

19、RM)與ERA結(jié)合，在不同的組織或在不同的生理條件下可產(chǎn)生雌激素樣作用或抗雌激素樣作用11。葉海涌等7研究淫羊藿苷及其衍生物淫羊藿素和去甲淫羊藿素的雌激素樣作用時發(fā)現(xiàn)，體外直接給予淫羊藿苷未呈現(xiàn)促MCF7細(xì)胞增殖作用?？赡苁怯捎谝蜣杰张c其他黃酮化合物類似，需經(jīng)過胃內(nèi)水解反應(yīng)以及大腸細(xì)菌作用，使糖苷水解成苷元，才能具有雌激素樣活性。本實驗通過灌胃途徑給予小鼠淫羊藿及淫羊藿苷，取其血清，結(jié)合體外細(xì)胞培養(yǎng)，結(jié)果顯示淫羊藿及淫羊藿苷對MCF7細(xì)胞增殖均有明顯促進(jìn)作用，但與E2組比較細(xì)胞增殖作用明顯較弱。可見淫羊藿及淫羊藿苷經(jīng)過體內(nèi)一系列活化作用后，可促MCF7細(xì)胞增殖，均具有雌激素樣作用。這一結(jié)果提

20、示淫羊藿及淫羊藿苷的給藥途徑應(yīng)為口服給藥，以提高藥效。    ICI是一種實驗用ER完全拮抗劑，可以顯著地減弱或抑制由配體與雌激素受體結(jié)合所引發(fā)的、受雌激素應(yīng)答元件調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的作用12。本實驗結(jié)果顯示，加入ICI可明顯抑制淫羊藿及淫羊藿苷細(xì)胞增殖作用，提示淫羊藿及淫羊藿苷促細(xì)胞增殖作用可能使是通過ER介導(dǎo)而產(chǎn)生的，與E2對細(xì)胞增殖的機(jī)制類似，但其作用強(qiáng)度較為緩和。    綜上所述，淫羊藿及淫羊藿苷具有雌激素樣作用，且其作用強(qiáng)度較為緩和。本研究可為更年期婦女保健及雌激素依賴性腫瘤治療的臨床用藥提供指導(dǎo)。【參考文獻(xiàn)】 

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