轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

1、轉(zhuǎn)錄組研究前沿隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)，蛋白組學(xué)，代謝組學(xué)等組學(xué)的不斷涌現(xiàn)，生物學(xué)研究已經(jīng)跨入后基因組時代，轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為一個率先發(fā)展起來的技術(shù)開始在生物學(xué)前沿研究中得到了廣泛的應(yīng)用。廣義轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)系指從一種細(xì)胞或者組織的基因組所轉(zhuǎn)錄出來的RNA的總和，包括編碼蛋白質(zhì)的mRNA和各種非編碼RNA(rRNA,tRNA,snoRNA,snRNA,microRNA和其他非編碼RNA等)。狹義轉(zhuǎn)錄組系指所有參與翻譯蛋白質(zhì)的mRNA總和。轉(zhuǎn)錄組研究歷史：自從上世紀(jì)90年代中期以來，隨著微陣列技術(shù)被用于大規(guī)模的基因表達(dá)水平研究，轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為一門新技術(shù)開始在生物學(xué)前沿研究中展露頭腳并逐漸成為生命

2、科學(xué)研究的熱點(diǎn)。原因如下：1)蛋白質(zhì)組研究需要更多的轉(zhuǎn)錄組研究的信息：因為單一的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)不足以清楚地鑒定基因的功能，因此蛋白質(zhì)組的數(shù)據(jù)需要轉(zhuǎn)錄組的研究結(jié)果加以印證。2)非編碼RNA研究的不斷發(fā)展，使得轉(zhuǎn)錄組研究的范圍不斷擴(kuò)大和深化。3)隨著新一代高通量測序技術(shù)運(yùn)用到轉(zhuǎn)錄組研究之中，轉(zhuǎn)錄組研究中提供的數(shù)據(jù)量呈現(xiàn)爆炸式的擴(kuò)增，極大拓寬了轉(zhuǎn)錄組研究解決科學(xué)問題的范圍。目前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究的技術(shù)主要包括如下三種：1)基于雜交技術(shù)的微陣列技術(shù)；2)基于Sanger測序法的SAGE(serialanalysisofgeneexpression)和MPSS(massivelyparallelsignatu

3、resequencing);3)基于新一代高通量測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序。各種轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)的特點(diǎn)如下：基于雜交技術(shù)的DNA芯片技術(shù)只適用于檢測已知序列，卻無法捕獲新的mRNA。細(xì)胞中mRNA的表達(dá)豐度不盡相同，通常細(xì)胞中約有不到100種的高豐度mRNA,其總量占總mRNA一半左右，另一半mRNA由種類繁多的低豐度mRNA組成。因此由于雜交技術(shù)靈敏度有限，對于低豐度的mRNA,微陣列技術(shù)難以檢測，也無法捕獲到目的基因mRNA表達(dá)水平的微小變化。SAGE是以Sanger測序為基礎(chǔ)用來分析基因群體表達(dá)狀態(tài)的一項技術(shù)。SAGE技術(shù)首先是提取實(shí)驗樣品中RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,隨后用錨定酶(Anchori

4、ngenzyme)切割雙鏈cDNA,接著將切割的cDNA片段與不同的接頭連接，通過標(biāo)簽酶酶切處理并獲得得到SAGE標(biāo)簽，然后PCR擴(kuò)增連接SAGE標(biāo)簽形成的標(biāo)簽二聚體，最后通過錨定酶切除接頭序列，以形成標(biāo)簽二聚體的多聚體并對其測序(關(guān)于SAGE方法細(xì)致的介紹請參考網(wǎng)站)。SAGE可以在組織和細(xì)胞中定量分析相關(guān)基因表達(dá)水平。在差異表達(dá)譜的研究中，SAGE可以獲得完整的轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜以及發(fā)現(xiàn)新的基因并鑒定其功能、作用機(jī)制和通路等。MPSS是SAGE的改進(jìn)版，MPSS技術(shù)首先是提取實(shí)驗樣品RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,接著將獲得的cDNA克隆至具有各種adapto

5、r的載體庫中，并PCR擴(kuò)增克隆至載體庫中的不同cDNA片段，然后在T4DNA聚合酶和dGTP的作用下將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)換為單鏈文庫，最后通過雜交將其結(jié)合在帶有Anti-adaptor的微載體上進(jìn)行測序。MPSS技術(shù)對于功能基因組研究非常有效，能在短時間內(nèi)捕獲細(xì)胞或組織內(nèi)全部基因的表達(dá)特征。MPSS技術(shù)對于鑒定致病基因并揭示該基因在疾病中的作用機(jī)制等發(fā)揮了重要作用。自從2005年上市以來，第二代測序技術(shù)對基因組學(xué)的研究產(chǎn)生了巨大的影響并被廣泛運(yùn)用到了基因組測序工作之中。轉(zhuǎn)錄組測序也被稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序(WholeTranscriptomeShotgunSequencing,WTSS),以下簡稱R

6、NA-seq。眾所周知，真核生物的基因由三類RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄：RNA聚合酶I和III負(fù)責(zé)其種類稀少，功能重要的看家非編碼RNA基因的轉(zhuǎn)錄，包括rRNA,tRNA,snoRNA,snRNA等；而RNA聚合酶II負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)編碼基因和調(diào)控非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)在加工過程中均會加上3'端多聚腺昔尾。RNA-seq是對用多聚胸腺喀咤進(jìn)行親和純化的RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的成熟mRNA和ncRNA進(jìn)行高通量測序。所獲得的海量數(shù)據(jù)經(jīng)過專業(yè)的生物信息學(xué)分析，既可以還原出一種細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的種種特征。如果對不同種類的細(xì)胞進(jìn)行并行的RNA-seq及生物信息學(xué)分析，即可以獲得多種基因表達(dá)調(diào)控的重要信息

7、。第二代高通量測序技術(shù)賦予了RNA-seq超強(qiáng)的覆蓋度和靈敏性，可以檢出許多不曾被預(yù)測到的由可變剪接或可變3'多聚腺昔化位點(diǎn)選擇導(dǎo)致的mRNAisoforms，以及新的ncRNA和antisenseRNA(反義RNA)。它在研究真核生物的基因表達(dá)調(diào)控，癌癥等疾病的發(fā)生機(jī)制和新治療方案確定，遺傳育種等方面具有不可估量的潛力，是后基因組時代改變?nèi)藗兊纳J(rèn)知和生活質(zhì)量的一股強(qiáng)勁力量。短短幾年，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于解析人類基因組可變剪接，以及從酵母到擬南芥到人的基因表達(dá)中的重要科學(xué)問題。下表是幾種轉(zhuǎn)錄組研究所用技術(shù)的比較：轉(zhuǎn)錄組所用技術(shù)轉(zhuǎn)錄組前沿研究簡介：隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組

8、研究從以前的微陣列技術(shù)，SAGE及MPSS技術(shù)的低通量模式切換至RNA-seq的高通量模式。作為蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)，RNA-seq可以識別比蛋白組高一兩個數(shù)量級的基因，從而幫助科學(xué)家構(gòu)建完整的基因表達(dá)譜以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。RNA-seq對于真核生物的基因表達(dá)調(diào)控，癌癥等疾病的發(fā)生機(jī)制和新治療方案確定，遺傳育種等方面的研究具有不可估量的潛力。以下是關(guān)于轉(zhuǎn)錄組前沿研究的一些介紹：1) 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析隨著高通量測序技術(shù)的不斷成熟，轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)在功能基因組學(xué)的研究中發(fā)揮了非常重要的作用。很多研究表明相同的細(xì)胞類型中的基因表達(dá)水平也常常顯示異質(zhì)性，對于單個細(xì)胞來說，轉(zhuǎn)錄組的隨機(jī)變異性可能決

9、定了細(xì)胞的最終命運(yùn)，因此不同的細(xì)胞具有不同的轉(zhuǎn)錄組表型，所以從理論上講，轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)該以單細(xì)胞為研究模型，科學(xué)家應(yīng)用單細(xì)胞RNA-seq技術(shù)即可獲得單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。2009年SuraliAzim和LaoKaiqin領(lǐng)導(dǎo)的課題組描述了一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)如下圖：(Tangetal.2009NatMethods.6:377-82作者通過對單個小鼠卵裂球細(xì)胞的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析發(fā)現(xiàn)至少5個測序所獲得的reads比微陣列技術(shù)多出75%(5270)的表達(dá)基因，并鑒定了1753個嶄新的剪切位點(diǎn)。除此以外，單細(xì)胞的RNA-seq結(jié)果表明了在相同的卵裂球或卵母細(xì)胞中，至少有8-19%的基

10、因存在兩個以上的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，該現(xiàn)象清楚表明了在胚胎發(fā)育過程中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性。最后，通過對單個Diceri-/-和Ago2-/-卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測序，相對野生型來說，Diceri-/-和Ago2-/-卵母細(xì)胞分別發(fā)現(xiàn)1696和1553個基因異常上調(diào)，1571和1121個基因異常下調(diào)，而619基因是相同的。這種單細(xì)胞RNA-Seq技術(shù)檢測將大大提高我們對單個細(xì)胞在哺乳動物發(fā)育中轉(zhuǎn)錄復(fù)雜性的理解。2) 轉(zhuǎn)錄組測序確定RNA結(jié)構(gòu)非編碼RNA對于基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的研究成為近年來的熱門研究領(lǐng)域，而RNA的結(jié)構(gòu)是RNA行使其功能的基礎(chǔ)，所以測定RNA的結(jié)構(gòu)對于理解RNA功能意義重大。傳統(tǒng)的測定RNA

11、二級結(jié)構(gòu)的方法是用化學(xué)試劑或RNA酶切割RNA然后通過測序膠進(jìn)行分析。這種方法的工作量巨大而且對于技術(shù)要求很高。2010年12月份美國加州大學(xué)圣克魯茲分?；羧A德休斯醫(yī)學(xué)研究院SofieSalama教授所領(lǐng)導(dǎo)的課題組描述了一種通過轉(zhuǎn)錄組高通量測序方法測定RNA結(jié)構(gòu)的方法(Fragmentationsequencing,FragSeq),該方法發(fā)表在自然一方法學(xué)。(Underwoodetal.2010.NatMethods.7:995-1001)該方法利用核酸酶P1只切割單鏈RNA的特性對小鼠RNA進(jìn)行片段化，片段化RNA的大小在20-100nt之間，然后在片段的5'和3'端分別加

12、上測序接頭，再進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增,最后構(gòu)建FragSeq文庫并對其進(jìn)行高通量測序。同時作者通過生物信息學(xué)分析大量的高通量測序結(jié)果，并輔以實(shí)驗數(shù)據(jù)成功測定了小鼠的非編碼RNA的二級結(jié)構(gòu)。3)轉(zhuǎn)錄組測序在疾病中的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)是最近發(fā)展起來的利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的一種技術(shù)可全面快速地獲得特定細(xì)胞或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有的成熟mRNA和ncRNAo相對于傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)，RNA-seq技術(shù)不需要針對已知序列設(shè)計探針，即可檢測細(xì)胞或組織的整體轉(zhuǎn)錄水平。RNA-seq技術(shù)具有更靈敏的數(shù)字化信號更高的通量以及更廣泛的檢測范圍。在疾病的機(jī)制研究以及疾病治療領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組

13、測序作為一個有力的工具已經(jīng)被廣泛使用。2010年7月，密歇根大學(xué)ArulMChinnaiyan實(shí)驗室分析了15例前列腺癌樣本的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)其中有兩例前列腺癌樣本的ETS基因沒有發(fā)生融合，進(jìn)一步的研究表明存在于Raf信號途彳5中的BRAF和RAF1基因會發(fā)生融合現(xiàn)象，作者同時利用q-PCR和FISH技術(shù)驗證了上述現(xiàn)象的存在。除此以外，作者通過對大批不同的癌癥樣本進(jìn)行熒光原位雜交實(shí)驗，并精確統(tǒng)計了BRAF和RAF1基因的重排頻率，統(tǒng)計結(jié)果表明了各種癌癥樣本如胃癌，肝癌，黑色素瘤和前列腺癌的研究結(jié)果具有高度的一致性。此項成果證明了RAF信號途徑在一系列癌癥如前列腺癌、胃癌和黑色素瘤發(fā)病過

14、程中起到了非常重要的角色，同時研究成果也表明了RAF信號途徑中的融合基因有潛力成為抗腫瘤治療與抗腫瘤藥物篩選的靶標(biāo)。參考文獻(xiàn)：BrennerS,JohnsonM,BridghamJ,GoldaG,LloydDH,JohnsonD,LuoSJ,McCurdyS,FoyM,EwanM,RothR,GeorgeD,EletrS,AlbrechtG,VermaasE,WilliamsSR,MoonK,BurchamT,PallasM,DuBridgeRB,KirchnerJ,FearonK,MaoJ,CorcoranK.Geneexpressionanalysisbymassivelyparallel

15、signaturesequencing(MPSS)onmicrobeadarrays.NatBiotechnol,2000,18(6):630£34.LockhartDJ,WinzelerEA.Genomics,geneexpressionandDNAarrays.Nature,2000,405(6788):827-836.Palanisamyetal.2010.RearrangementsoftheRAFkinasepathwayinprostatecancer,gastriccancerandmelanoma.NatureMedicine.16:793-798.ShendureJ,JiH.Next-generationDNAsequencing.NatBiotechnol,2008,26(10):1135-1145.Tangetal.2009.mRNA-Seqwhole-transcriptomeanalysisofasinglecell.NatMethods.6:377-82.Underwoodetal.2010.FragSeq:transcriptome-wideRNAstructureprobingusinghigh-throughputsequencing.NatMethods.7:995-1001.V