基因功能分析基本策略-碩士

1、基因功能分析基本策略-碩士后基因組研究焦點：基因功能研究后基因組研究焦點：基因功能研究Central DogmaDNARNAtranscriptionProteintranslationTranscription FactorsAlt. SplicingAlt. Poly-A,Alt. Translatin StartCentral DogmaDNARNAtranscriptionProteintranslationTranscription FactorsTGSPTGSTGS: Transcriptional Gene SilencingPTGS: Post Transcriptional

2、Gene Silencing反向遺傳學(xué)Reverse GeneticsGene DNASequenceGene DisruptionPhenotypeAnalysisFunctionDevelopmentPhysiologyCell BiologyGenetically LinkHomologous recombinationOverexpressionAnti-senseRNAi抑制基因表達抑制基因表達觀察功能變化觀察功能變化KnockOut 法法Antisense法法Ribozyme法法RNAi法法RNA干擾技術(shù)基因敲除技術(shù)基因轉(zhuǎn)染細胞模型轉(zhuǎn)基因動物模型基因功能分析的基本策略將某一基因從動

3、物基因組中剔除或?qū)⑼庠椿蛞雱游锘蚪M產(chǎn)生經(jīng)過基因工程修飾（改造）的動物實現(xiàn)在整體和細胞水平認識基因的功能第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因技術(shù)transgenic technology將外源基因?qū)胧芫鸭毎蚺咛ジ杉毎型ㄟ^外源基因與細胞染色體DNA之間隨機發(fā)生重組將外源基因插入到受體細胞染色體DNA中n轉(zhuǎn)基因動物n基因轉(zhuǎn)染細胞模型轉(zhuǎn)基因動物 轉(zhuǎn)基因動物模型實驗步驟轉(zhuǎn)基因動物模型實驗步驟轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建；將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細胞或胚胎干細胞；將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細胞植入假孕小鼠子宮內(nèi)；對轉(zhuǎn)基因動物進行鑒定。轉(zhuǎn)基因載體結(jié)構(gòu)基因報告基因增強子啟動子受精全能性細胞注射 植入假孕小鼠后代Southern blo

4、tRT-PCRWestern blot轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠基因轉(zhuǎn)染細胞模型實驗步驟基因轉(zhuǎn)染細胞模型實驗步驟 真核重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建；在原核細胞中復(fù)制擴增和克隆化真核重組表達質(zhì)粒；將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的克隆化篩選、保存；轉(zhuǎn)染細胞表達目的蛋白、提取、鑒定。脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法脂質(zhì)體法將待轉(zhuǎn)染的DNA溶液與磷脂混合，形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，將脂質(zhì)體懸液加入到細胞培養(yǎng)液中，與受體細胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進入細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)。 在外加電場的作用下，細胞膜電位發(fā)生改變，在外加電場的作用下，細胞膜電位發(fā)生改變，細胞質(zhì)膜瞬間出現(xiàn)可逆性的電穿孔，從而使一細胞質(zhì)膜瞬間出現(xiàn)可逆性的電穿

5、孔，從而使一定數(shù)量的外源定數(shù)量的外源DNA從細胞外擴散到細胞質(zhì)和從細胞外擴散到細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，并進一步整合到宿主細胞核內(nèi)，并進一步整合到宿主DNA上，達上，達到轉(zhuǎn)基因目的。到轉(zhuǎn)基因目的。 將外源將外源DNA在顯微操作系統(tǒng)的輔助下，在顯微操作系統(tǒng)的輔助下，直接將外源直接將外源DNA注入哺乳動物受精卵的注入哺乳動物受精卵的原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，原核內(nèi)，使外源基因整合到基因組上，制備轉(zhuǎn)基因動物。制備轉(zhuǎn)基因動物。 將要轉(zhuǎn)染的將要轉(zhuǎn)染的DNA吸附到高黏度的金吸附到高黏度的金屬顆粒上，在加速裝置的作用下，將屬顆粒上，在加速裝置的作用下，將這些粒子高速打入細胞或組織內(nèi)，達這些粒子高速打入細胞或

6、組織內(nèi)，達到轉(zhuǎn)基因目的。到轉(zhuǎn)基因目的。 將待轉(zhuǎn)染的將待轉(zhuǎn)染的DNA溶解在磷酸緩沖溶解在磷酸緩沖液中，使液中，使DNA片段與磷酸鈣共沉淀并片段與磷酸鈣共沉淀并形成大的顆粒；加入貼壁培養(yǎng)的細胞形成大的顆粒；加入貼壁培養(yǎng)的細胞中被吸收，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。中被吸收，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因。第二節(jié) RNA干擾技術(shù)RNA Interference (RNAi)QuickTime and aGIF decompressorare needed to see this picture.加工加工dsRNA形成形成 21-23 nt 小片段小片段Dicer RNAi的要素：的要素：DicerDicer contains two R

7、NAse III domainssiRNAslong dsRNAsiRNA19 nt duplex2 nt 3 overhangs RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC對靶mRNA的切割是以內(nèi)切的方式進行的，而且切割僅發(fā)生在與siRNA同源的部分。RNAi的要素：的要素：RISCRISC: RNA-Induced Silencing ComplexExonucleaseHomology search activityEndonucleaseHelicase53Target mRNAOH35P形成形成RISC復(fù)合物，降解目的復(fù)合物，降解目的mRNAdsRNADicer cleavage of dsRNA

8、siRNARNAi 抑制基因表達的機理抑制基因表達的機理siRNA associatedWith RISC complexCell Membrane5POH3Target mRNARNAi機制 DicerRISC堿基互補堿基互補酶解酶解RNA干擾實驗的基本過程干擾實驗的基本過程1. 1. 確定干擾靶點確定干擾靶點干涉靶點序列應(yīng)具備的條件： 盡量避開蛋白結(jié)合位點； 一般應(yīng)具有AA（N19）TT或AA（N21）序列特征； GC比比例為50%左右； 被干涉的靶序列應(yīng)該是特異性的，和其它RNA沒有同源性； 通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列提供RNAi 在線技術(shù)支

9、持的公司（網(wǎng)站） 2. 2.將候選的靶點序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)將候選的靶點序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫等進行庫等進行BLASTBLAST比較比較 3.3.制備制備siRNAsiRNAsiRNA制備常用的五種方法：化學(xué)合成體外轉(zhuǎn)錄長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 siRNA表達載體在細胞中表達形成shRNAs PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達 化學(xué)合成質(zhì)量高，高純度，高成本適用于已經(jīng)驗證過抑制效率的靶點序列不適于篩選靶點序列 體外轉(zhuǎn)錄成本適中，省時，適用于篩選靶點序列不適用于長期的研究或者針對某個特定靶點序列的大量研究長片斷dsRNA酶解法dsRNA在體外被Rnase家族成員切

10、割成siRNA不需要驗證篩選多個靶點序列不適用于長期研究或者特定siRNA序列的研究siRNA表達質(zhì)?；蛘卟《据d體在細胞中表達siRNAs AAACCAGCAGAACGTGTACGA 載體介導(dǎo)的細胞內(nèi)表達siRNA 方法的特點操作簡便，穩(wěn)定性好siRNA表達載體一旦構(gòu)建成功，可以無限制的應(yīng)用于研究適用于長期的對于某個基因的研究，尤其是帶有篩選標記的載體，能夠用于構(gòu)建特定基因缺陷的細胞株4.4.對目標對目標RNARNA的干擾的干擾轉(zhuǎn)染靶細胞對目標RNA干涉程度進行分析：可采用RT-PCR在RNA水平上監(jiān)測、Western blot在蛋白質(zhì)水平上進行監(jiān)測RNAi實例(載體法)： Target ge

11、ne：c-myc n 查找靶基因mRNAn 利用網(wǎng)絡(luò)在線支持，尋找siRNA序列n 根據(jù)查找的siRNA序列，合成長鏈oligon 構(gòu)建載體n 轉(zhuǎn)染n 檢測效應(yīng)（包括干擾效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)）1、檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）目的基因mRNA獲?。狠d體構(gòu)建：載體構(gòu)建： dsDNA形成：退火 載體的酶切和回收 連接 轉(zhuǎn)化 鑒定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染：瓶頸之一：瓶頸之一 含有真核細胞篩選標志 含有熒光標志效應(yīng)檢測效應(yīng)檢測：mRNA水平和蛋白水平兼顧(a)(b)24 h 48 h干擾組陰性對照組1.00.80.60.40.2 0 m RNA相對表達量c-actinPokemon 500300500300

12、(d) Pokemon-actin(a)Pokemon蛋白相對表達量干擾組陰性對照組48 h 72 h1.00.80.60.40.2 0 RNA干擾的應(yīng)用基因治療方面基因治療方面 抗腫瘤 應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制腫瘤細胞血管生長因子如血管生成素、angi1、angi2、angi3及VEGF等或其受體的表達，抑制腫瘤細胞癌基因bcl2、RAS、Tp53等突變基因及其蛋白的表達達到抗腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的目的 抗器官移植排斥反應(yīng) 細胞間粘附分子-1（ICAM-1）是重要的介導(dǎo)細胞粘附和T細胞激活的分子，應(yīng)用與ICAM-1基因序列特異的siRNA阻斷 ICAM-1 mRNA和蛋白的表達，可以明顯降低大鼠同種移植心的移植物血管病的發(fā)生的程度和缺血再灌注損傷。 抗病毒斯坦福醫(yī)學(xué)院運用此技術(shù)來治療丙型肝炎 把dsRNA轉(zhuǎn)入小鼠的肝細胞，被分解成siRNA后與小鼠體內(nèi)的丙型肝炎病毒mRNA相結(jié)合，使之分解并失去轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)的功能。已從體外試管實驗階段推進至體內(nèi)的動物實驗且在小鼠模型看到丙型肝炎病毒被阻斷的明顯效果利用siRNA治療疾病需要解決幾個問題： 導(dǎo)入問題：使用高效載體傳遞siRNA； 給藥方式：因為RNA容易被降解，如何提高siRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性； 高選擇性：如何靶向特定細胞而不影響其他細胞。第三節(jié) 基因敲除技術(shù)Gene Knock-out通過DNA同源重組定向?qū)⑼庠椿虿?/p>