整理WesternBlottingProtocol-中山大學(xué)參考

1、WesternBloting（張雪雁）操作步驟:1 .做膠：下層膠7.5ml一塊，以水或乙醇隔離空氣。待下層膠凝固后做上層膠，每塊膠配置3ml,灌膠、插梳子，趕走氣泡。2 .蛋白變性：在膠凝固過程中，變性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的上樣量按事先所測弄濃度計(jì)算準(zhǔn)確，分裝到EP管或，按5ul/100ul樣品的濃度加B一琉基乙醇，然后以PCR儀95c變性10分鐘。3 .上樣、電泳：1）上層膠為安全凝固（大約15分鐘）后，兩只手同時(shí)向上用力取下梳子。以蒸儲(chǔ)水仔細(xì)清洗各泳道內(nèi)殘留得碎膠。2）將SDS-PAGE交轉(zhuǎn)移到電泳槽中，如果只做一塊膠，對面以玻璃板平衡。1x電泳緩沖液充滿電泳槽后，以玻璃棒將電泳槽中的氣泡盡量

2、趕除。3）先以少量加有澳酚藍(lán)1x上樣緩沖液標(biāo)記各泳道。4）變性過的各管蛋白質(zhì)樣品以加有澳酚藍(lán)1x上樣緩沖液補(bǔ)齊至50ulo蛋白Marker也補(bǔ)齊至50ulo5）以一定順序?qū)⒌鞍讟悠泛蚆arker,用微量移液器加至泳道。上樣過程中，手要穩(wěn)，避免將泳道劃破，樣品自槍頭打出時(shí)要緩慢，以免樣品自泳道飄出。剩余未加樣的泳道以50ul上樣緩沖液平衡。6）加樣完畢，紅對紅，黑對黑將電泳槽和電泳儀接好，打開電源，電壓調(diào)至60-100V之間。一般來說樣品在上層膠時(shí)電壓可稍高，進(jìn)入下層膠后較低的電壓容易將個(gè)分子量蛋白粉理清楚。澳酚藍(lán)自膠內(nèi)跑出后電泳結(jié)束。4 .電轉(zhuǎn)：1）準(zhǔn)備PVDF膜及濾紙。PVD次小8.2x55

3、.5,濾紙按電轉(zhuǎn)海綿大小剪，一塊膠準(zhǔn)備四張濾紙。2）將PDVF!置于干凈的容器中，倒入適量甲醇浸泡13分鐘，然后浸泡于電轉(zhuǎn)浸泡液中。3）小心取出兩層玻璃之間的膠，切去上層膠。在電轉(zhuǎn)液中完成如下：電轉(zhuǎn)孔板黑色面鋪放海綿一張，依次鋪放濾紙兩張，膠一塊，PVDF1一張，濾紙?jiān)賰蓮?，海綿再一張，然后小心扣好孔板，將其黑色面對黑色面扣入電轉(zhuǎn)架，將電轉(zhuǎn)架放入電泳槽。電泳槽內(nèi)置小冰盒一個(gè)，整個(gè)電泳槽置于大冰盒中。4）接好電源，按蛋白分子量大小調(diào)整電壓。一般小分子量適合低電壓，大分子量適合高電壓。5 .封閉：1）電轉(zhuǎn)完畢后取出PVD映，置于5%勺脫脂奶溶液中封1一小時(shí)或者4c過夜。2 ）一抗反應(yīng)：將抗體以10

4、ml5%兌脂奶適合稀釋，將PVD瞰浸入其中，置于脫色搖床上促進(jìn)反應(yīng)1小時(shí)。表達(dá)豐度低的蛋白可適當(dāng)加長時(shí)間，比如4c冷庫過夜。6 .回收抗體。7 .TBST液搖洗膜，15分鐘x3次8 .二抗反應(yīng)：相應(yīng)二抗以1:2000比例稀釋至10ml。PVDF1置于其中要洗4050分鐘。9 .TBST液洗膜，15分鐘x3次10 .暗房發(fā)光洗片。所需物品：濾紙，X鮮膜，壓片盒，X光片，小銀子，1000ul移液器，槍頭，配制發(fā)光液，solutionI:solutionn=1:1,一張膜需要2ml。1）用紙吸干PVD缺水分，在保鮮膜上浸泡于發(fā)光液1分鐘，期間用銀子翻轉(zhuǎn)幾次促進(jìn)均勻反應(yīng)。用紙吸干PVD映上剩余的發(fā)光液

5、，裹于干凈的保鮮膜里，只需一層。2）PVD映平鋪于壓片盒，關(guān)燈，取X光片12張鋪與其上，扣緊壓片盒。根據(jù)需要定制曝光時(shí)間。一股第一張15分鐘。將剩余X光片密封避光保存妥善。3）取出壓片盒中X光片投入自動(dòng)洗片機(jī)中沖洗。WesternBloting相關(guān)試齊U：(Bio-Rad161-0101)Acrylamide/Bisacrylamide30%(w/v)acrylamide(丙烯酰胺)0.8%(w/v)methelenebisacrylamide(N-N'亞甲基雙丙烯酰胺)丙烯酰胺(Acr)29g亞甲基雙丙烯酰胺(Bic)1g超純水至100ml37c下溶解后，4Cbrownbottle保

6、存，使用時(shí)恢復(fù)至室溫且無沉淀。4xLowerTris500mlTrisbase(1.5M,m.w.121.1)90.83g10%SDS20ml超純水至500mlPHto8.8(aboutHCL12ml)4xUpperTris,200mlTrisbase(0.5M)12.12g10%SDS8ml超純水至200mlPHto6.8(aboutHCL8ml)10%AmmoniumPersulfate(過硫酰胺，APS,10%,W/V)總量10mlAmmoniumPersulfate1gDH0to10ml溶解后，分裝后-20C保存，每次用一支(200ul),保存時(shí)間為一周(Gibco155-16-024

7、)(Bio-Rad161-0800)Temed:，Glycerol10ml20%SDS15ml4xUpperTris12.5mliH2Oto50ml1xSampleBuffer1.5ml2ml3ml4ml5ml10ml20ml50mlH2O(ml)0.6750.91.351.82.254.5922.52xS.B.(ml)0.7511.522.551025BME(ul)751001502002505001000250010xRunningBuffer4L2L1LGlycine(sigmaG7526)576g288g144gTrisbase(GIBCOBRL15504-038)120g60g30g

8、SDS(GIBCOBRL15525-017)40g20g10g加dHO至相應(yīng)的容量。1xRunningBuffer10xRunningBuffer和dHO按1:9比例配置，溶解后室溫保存；溶液可置于4c重復(fù)使用3次10XTransferBuffer4L2L1LGlycine(sigmaG7526)580g290g145gTrisbase(GIBCOBRL15504-038)116g58g29g加dHO至相應(yīng)的容量1XTransferBuffer,2000mldH2O1400ml;20%methanol（甲醇）400ml1XTransferBuffer200ml混勻。溶解后室溫保存；溶液可置于4

9、c重復(fù)使用3次。10XTBS（PH7.6）4L2L1LTris96.8g48.4g24.2gNacl320g160g80g36%HCL5058ml1XTBS-T,2000mldH2O1800ml1XTBS200ml吐溫-202ml（或20%±溫10ml）（臨時(shí)加入），混勻1XTBS緩沖液（可參考）1mol/LTrisHCL（PH7.5）10mlNaCl8g蒸儲(chǔ)水至1000ml10XPBS4L2L1LNacl320g160g80gKCL8g4g2gNkHPO57.6g28.8g14.4gKHPO9.6g4.8g2.4g加dHO至相應(yīng)的容量0.01mol/LPBS緩沖液(ph7.2-7.

10、4)(可參考)0.2mol/LNaH2PO19ml0.2mol/LNa2HPO81ml蒸儲(chǔ)水至2000mlStrippingBuffer10ml50ml100ml200ml500ml1mol/vTrisHCL(PH6.7)(ml)0.6253.1256.2512.531.2510%SDS(ml)210204010014.4mol/lB-筑基乙醇0.070.350.71.43.5dH2O(ml)*7.305*36.525*73.5*146.1*365.25*力口dHO至相應(yīng)的容量。B-琉基乙醇在Strip前臨時(shí)加入。配置時(shí)，在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。4c保存，可重復(fù)使用1次（Stripping步驟：用St

11、rippingBuffer在50c洗膜10min,之后于室溫下在TBST中洗膜3次，每次10min.封閉后開始加相應(yīng)抗體）附：其他部分試劑配制：母液1mol/LTrisHCLTris（MW121.14）30.29g蒸儲(chǔ)水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)PH至所需點(diǎn)（如下所示），最后用蒸儲(chǔ)水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。PHHCL7.4約17ml7.5約16ml7.6約15ml8.0約10ml1.74mg/ml(10mmol/l)PMSFPMSF0.174g;異丙醇100ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，一20C保存。0.2mol/lNaH2PO4NaHPO(MW119.98)12g蒸

12、儲(chǔ)水至500ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。0.2mol/lNa2HPO4NaHPO12HO(MW358.14)71.6g蒸儲(chǔ)水至1000ml溶解后，高壓滅菌，室溫保存。10%SDSSDS10g蒸儲(chǔ)水至100ml50c水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用10%過硫酸胺(AP)過硫酸胺0.1g超純水1.0ml溶解后，4c保存，保存時(shí)間為一周。TrisHCL(PH8.8)Tris(MW121.1415.13g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)PH至8.8,最后用超純水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/lTrisHCL(PH6.8)Tris(MW12

13、1.14)15.14g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)PH至6.8,最后用超純水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。20%Tween2020ml100mlTween20蒸儲(chǔ)水至使用液單去污劑裂解液(50mol/lTris1mol/lTrisHCL(PH8.0)NaCLTritonX-100混勻后，4c保存HCL(PH8.0),150mmol/lNaCL,1%TritonX-100,100ug/lPMSF:2.5ml0.438g0.5ml混勻后，4c保存。使用時(shí)，加入PMSF®終濃度為100ug/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50ul）G250考馬斯亮藍(lán)溶

14、液（測蛋白含量專用）考馬斯亮藍(lán)G25Q100mg95%>50ml磷酸：100ml蒸儲(chǔ)水至1000ml配制時(shí)，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4c保存0.15mol/lNaClNaCL（MW58.44）0.877g蒸儲(chǔ)水至100ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）BSA0.1g0.15mol/lNaCl1ml溶解后，-20C保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，用0.15mol/lNaCL進(jìn)彳T100倍稀釋1mg/ml,-20C保存還原型5XSDS上樣緩沖液(0.25mol/lTris?HCL(PH6.8),0.5mmol/l二硫叔糖醇，10

15、%SDS,0.5%I酚藍(lán)，50%T油)0.5mol/lTris?HCL(PH6.8)2.5ml0.5mmol/l二硫叔糖醇0.39gSDS0.5g澳酚藍(lán)0.025甘油2.5ml混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4c保存10X麗春紅染液三氯乙酸30g磺基水楊酸30g蒸儲(chǔ)水至100ml使用時(shí)將其稀釋10倍。封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液）脫脂奶粉2.5gTBST50ml溶解后4c保存。使用時(shí)，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用顯影液（5X）自來水(50c60C)700ml（以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸鈉240g亞硫酸鈉（無水）15g冰乙酸12.6ml硼酸7.5g水溫

16、冷至30c以下再加入）鉀明研15g（加水定容至1000ml,室溫保存。WesternBlotting配膠6%SsperationGel7.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)123415L.T.(ml)1.252.53.75518.75Acry1(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.725.438.1510.8740.75L.T.(ml)1.252.53.75518.75APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138HaO(ml)2

17、.474.937.49.8737APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.13385ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)1.534.5622.5L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.724.46.68.833APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)1.753.505.257.0026.25L.T.(ml)1.252.53.75518.75HbO(ml)246830APS(ul)26

18、.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.13389%SsperationGel10.5%sperationGel12%SsperationGel13.5%sperationGel5ml10ml15ml20ml75mol5ml10ml15ml20ml75molAcry1(ml)246830L.T.(ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)1.733.745.206.9326.00APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)2.254.56.75933.75L.T.(ml)1.252.53.75518.75HbO(ml)1.472.934.45.8722APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.133815%SsperationGelStackingGel5ml10ml15ml20ml75mol2ml4ml5ml8ml30mlAcry1(ml)2.557.51037.5Acry1(ml)0.220.440.660.883.3L.T.(ml)1.252.53.75518.75U