電子顯微鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)

1、第七章第七章 免疫電鏡免疫電鏡一一 電鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)概述電鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)概述二二 幾種常用的透射電鏡方法要點(diǎn)幾種常用的透射電鏡方法要點(diǎn)一一 電鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)概述電鏡免疫組織化學(xué)技術(shù)概述 特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，特異性抗體用電子致密物質(zhì)，如鐵蛋白、膠體金等標(biāo)記后，使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所使之與組織超薄切片中的抗原結(jié)合，在電鏡下觀察到標(biāo)記物所在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。在位置，即為抗原抗體反應(yīng)的部位。 v（一）組織固定與取材（一）組織固定與取材v（二）免疫染色（二）免疫染色v（三）包埋（三）包埋 v（四）對(duì)照試驗(yàn)（四）對(duì)照試

2、驗(yàn)（一）組織固定與取材（一）組織固定與取材v原則：原則：既要保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性。既要保存良好的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，又要注意保持組織的抗原性。v固定：固定： 固定劑的要求：固定劑的要求： 不損害細(xì)胞內(nèi)抗原的活性；不損害細(xì)胞內(nèi)抗原的活性； 固定速度快、效果好；固定速度快、效果好； 分子量小，易于滲透；分子量小，易于滲透； 固定后固定后, ,不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標(biāo)記抗體進(jìn)入不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標(biāo)記抗體進(jìn)入抗原位。抗原位。 影響固定的因素有：影響固定的因素有： 固定劑的種類；固定劑的種類； 固定劑的濃度，濃度過大，對(duì)抗原的活性有影響，濃度固定劑的濃度，濃

3、度過大，對(duì)抗原的活性有影響，濃度過小，固定效果差；過小，固定效果差； 固定劑的固定劑的pHpH； 固定劑的溫度固定劑的溫度, ,一般采用一般采用2244冷固定；這樣能降低細(xì)冷固定；這樣能降低細(xì)胞自溶作用和水分抽提；胞自溶作用和水分抽提； 固定時(shí)間與溫度有關(guān)，溫度高，固定快，也與緩沖系的固定時(shí)間與溫度有關(guān)，溫度高，固定快，也與緩沖系的離子強(qiáng)度有關(guān)，離子強(qiáng)度大，滲透壓大，穿透力強(qiáng)，固定要離子強(qiáng)度有關(guān)，離子強(qiáng)度大，滲透壓大，穿透力強(qiáng)，固定要快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時(shí)快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時(shí)間也不一致；間也不一致； 與被固定的細(xì)胞類型有關(guān)。與被固定

4、的細(xì)胞類型有關(guān)。 選用固定劑不宜過強(qiáng)。常采用灌注固定法。選用固定劑不宜過強(qiáng)。常采用灌注固定法。 多聚甲醛多聚甲醛戊二醛混合液戊二醛混合液 過碘酸過碘酸賴氨酸一多聚甲醛液賴氨酸一多聚甲醛液(PLP(PLP液液) )： 對(duì)含糖類豐富的組織固定效果特佳。對(duì)含糖類豐富的組織固定效果特佳。（使用前必須用已知效價(jià)的抗原做一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。如固定劑的（使用前必須用已知效價(jià)的抗原做一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。如固定劑的種類濃度、溫度、種類濃度、溫度、pHpH及固定時(shí)間等。然后做出預(yù)處理的效價(jià)，及固定時(shí)間等。然后做出預(yù)處理的效價(jià)，作為失活參考以再選擇最適條件。）作為失活參考以再選擇最適條件。）v取材：取材：免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫

5、化學(xué)技術(shù)要求更迅速、精細(xì)。免疫電鏡技術(shù)較光鏡免疫化學(xué)技術(shù)要求更迅速、精細(xì)。灌流后需續(xù)固定：四氧化鋨（二）免疫染色（二）免疫染色v包埋前染色包埋前染色 v包埋后染色包埋后染色 v超薄切片免疫染色超薄切片免疫染色 1 1 包埋前染色包埋前染色 即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取即先行免疫染色，在解剖顯微鏡下將免疫反應(yīng)陽性部位取出，修塊；常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包出，修塊；常規(guī)電鏡方法處理，經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋。埋。 特異性免疫反應(yīng)的范圍太小，可作二次包埋：特異性免疫反應(yīng)的范圍太小，可作二次包埋： 即第一次包埋時(shí)將組織置于兩層塑料片之間，中夾環(huán)氧樹即第一次包埋時(shí)

6、將組織置于兩層塑料片之間，中夾環(huán)氧樹脂如夾心面包式，進(jìn)行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出脂如夾心面包式，進(jìn)行高溫聚合，然后在解剖顯微鏡下取出需要部位作第二次包埋。需要部位作第二次包埋。 包埋前染色的組織，以中層較為理想。包埋前染色的組織，以中層較為理想。 表層因受機(jī)械修整，結(jié)構(gòu)保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應(yīng)弱或無。表層因受機(jī)械修整，結(jié)構(gòu)保存不好，深層因抗體不能透入，免疫反應(yīng)弱或無。 半薄切片可在相差顯微鏡下不染色觀察（半薄切片可在相差顯微鏡下不染色觀察（PAPPAP），免疫反應(yīng)部位呈黑點(diǎn)狀；），免疫反應(yīng)部位呈黑點(diǎn)狀； HEHE或甲苯胺藍(lán)染色的半薄切片上，免疫反應(yīng)部位呈棕黃色?；蚣妆桨匪{(lán)

7、染色的半薄切片上，免疫反應(yīng)部位呈棕黃色。 取相連續(xù)的超薄切片取相連續(xù)的超薄切片 為避免電鏡鉛、鈾染色反應(yīng)與免疫反應(yīng)之間的混淆，分別以兩個(gè)銅網(wǎng)撈取，為避免電鏡鉛、鈾染色反應(yīng)與免疫反應(yīng)之間的混淆，分別以兩個(gè)銅網(wǎng)撈取，其中之一進(jìn)行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進(jìn)行對(duì)照觀察。其中之一進(jìn)行染色觀察，另一以鈾單染色或不染色進(jìn)行對(duì)照觀察。v包埋前染色法的優(yōu)點(diǎn)是：包埋前染色法的優(yōu)點(diǎn)是： 切片染色前不經(jīng)固定、脫水及包埋等過程，不破壞抗原。切片染色前不經(jīng)固定、脫水及包埋等過程，不破壞抗原。 在免疫反應(yīng)陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢在免疫反應(yīng)陽性部位定位作超薄切片，提高電鏡下的檢出率。適用含抗原量較少的組

8、織。出率。適用含抗原量較少的組織。2 2 包埋后染色（載網(wǎng)染色）包埋后染色（載網(wǎng)染色）v組織標(biāo)本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片；組織標(biāo)本經(jīng)過固定、脫水及樹脂包埋、制成超薄切片； 免疫組化染色（載網(wǎng)染色）免疫組化染色（載網(wǎng)染色）注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)： 四氧化鋨具有保存抗原的作用，但應(yīng)用四氧化鋨可使抗四氧化鋨具有保存抗原的作用，但應(yīng)用四氧化鋨可使抗原活性明顯減低。后固定中一般以不用四氧化鋨為佳，或盡原活性明顯減低。后固定中一般以不用四氧化鋨為佳，或盡量縮短在四氧化鋨中停留的時(shí)間。量縮短在四氧化鋨中停留的時(shí)間。 在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選在載網(wǎng)染色過程中，銅網(wǎng)易與化學(xué)物

9、質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，故需選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)。 在免疫組化處理的全過程中，應(yīng)注意保持網(wǎng)面的濕潤(rùn)，網(wǎng)在免疫組化處理的全過程中，應(yīng)注意保持網(wǎng)面的濕潤(rùn)，網(wǎng)面干燥會(huì)影響抗體活性。面干燥會(huì)影響抗體活性。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡(jiǎn)便，陽性結(jié)果有高度的可重復(fù)性，超微結(jié)構(gòu)保存較好，方法簡(jiǎn)便，陽性結(jié)果有高度的可重復(fù)性，還能在同一超薄切片上進(jìn)行多重免疫染色。還能在同一超薄切片上進(jìn)行多重免疫染色。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 抗原活性在樣品處理過程中可能減弱甚至喪失；抗原活性在樣品處理過程中可能減弱甚至喪失； 環(huán)氧樹脂中可與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)；環(huán)氧樹脂中可與組織成份發(fā)生反應(yīng)而改變抗原性質(zhì)； 包埋在環(huán)氧樹脂中的

10、組織不易進(jìn)行免疫反應(yīng)等。包埋在環(huán)氧樹脂中的組織不易進(jìn)行免疫反應(yīng)等。解決對(duì)策：解決對(duì)策：去除包埋劑：去除包埋劑：飽和苯溶液，無水酒精中飽和苯溶液，無水酒精中NaOHNaOH飽和溶液或乙氧化鈉溶液等。飽和溶液或乙氧化鈉溶液等。去除四氧化鋨：去除四氧化鋨：免疫染色前，將載網(wǎng)超薄切片以免疫染色前，將載網(wǎng)超薄切片以H H2 20 02 2液蝕刻數(shù)分鐘，以去鋨和液蝕刻數(shù)分鐘，以去鋨和增強(qiáng)樹脂的穿透性。增強(qiáng)樹脂的穿透性。3 3 超薄冰凍切片超薄冰凍切片 v將組織置于蔗糖保護(hù)液中，以液氮速凍；將組織置于蔗糖保護(hù)液中，以液氮速凍；v在冰凍超薄切片機(jī)上切片；在冰凍超薄切片機(jī)上切片；v免疫染色。免疫染色。 不需經(jīng)固

11、定、脫水、包埋等步驟，所以抗原性保存不需經(jīng)固定、脫水、包埋等步驟，所以抗原性保存 較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點(diǎn)。但技術(shù)條較好，兼有包埋前和包埋后染色的優(yōu)點(diǎn)。但技術(shù)條 件要求較高、難度較大件要求較高、難度較大。（三）包埋（三）包埋樹脂包埋、低溫包埋樹脂包埋、低溫包埋1 1 樹脂包埋樹脂包埋 環(huán)氧樹脂包埋法環(huán)氧樹脂包埋法 直接脫水后包埋直接脫水后包埋 原位包埋：將小片組織或半薄切片貼在載片上，原位包埋：將小片組織或半薄切片貼在載片上， 將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置將充滿環(huán)氧樹脂的明膠囊倒置 于切片上聚合、硬化，進(jìn)行包埋。于切片上聚合、硬化，進(jìn)行包埋。2 2 低溫包埋低溫包埋 低溫包埋劑：低溫包

12、埋劑： （1 1）LowicrylsLowicryls： 是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)，包括是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)，包括K4MK4M、HM20HM20、K1lMK1lM、KM23KM23等系列等系列產(chǎn)品。產(chǎn)品。 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 是能在低溫下保持低粘度；是能在低溫下保持低粘度； 具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用與溫度無關(guān)。具有在光照射下聚合的能力，光聚合作用與溫度無關(guān)。K4MK4M和和K11MK11M具有親水性，能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色；具有親水性，能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色；HM20HM20和和HM23HM23具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于

13、掃描、透射電鏡和暗視具疏水性，能產(chǎn)生高反差圖像，適用于掃描、透射電鏡和暗視野觀察切片的制作。野觀察切片的制作。K4MK4M應(yīng)用較多應(yīng)用較多 1 1）包埋劑的配制：）包埋劑的配制： 由三個(gè)部分組成：?jiǎn)误w，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。由三個(gè)部分組成：?jiǎn)误w，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。 調(diào)整單體、交聯(lián)劑比例，增加交聯(lián)劑，可增加組織塊的硬度。調(diào)整單體、交聯(lián)劑比例，增加交聯(lián)劑，可增加組織塊的硬度。 中等硬度的組織塊，其配制比例如下：中等硬度的組織塊，其配制比例如下： K4MK4M：?jiǎn)危簡(jiǎn)?體體 17.30g 17.30g 交聯(lián)劑交聯(lián)劑 2.70g2.70g 引發(fā)劑引發(fā)劑 0.10g0.10g 可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕

14、色玻璃容器避光，用可用微量注射器加針頭抽取后，注入棕色玻璃容器避光，用玻棒輕攪玻棒輕攪35 min35 min或用一小管通入液氮?dú)馀輸嚢?。勿過分?jǐn)嚢?，或用一小管通入液氮?dú)馀輸嚢?。勿過分?jǐn)嚢瑁苑姥醯臍馀葸M(jìn)入包埋劑中。以防氧的氣泡進(jìn)入包埋劑中。K4M K4M 的應(yīng)用的應(yīng)用 2) 2) 生物樣品處理程序生物樣品處理程序 取材，以多聚甲醛一賴氨酸取材，以多聚甲醛一賴氨酸過碘酸鈉固定；過碘酸鈉固定； 含含7 7蔗糖蔗糖PBSPBS，沖洗過夜；，沖洗過夜； 0.1 mol 0.1 molLPBSLPBS， pH 7.2pH 7.2沖洗；沖洗； 系列脫水；系列脫水； 包埋：包埋： 新鮮新鮮K4MK4M置于

15、膠囊內(nèi)，將組織塊移入，在置于膠囊內(nèi)，將組織塊移入，在-30-30-40-40以紫外線燈照射以紫外線燈照射24h24h使之聚合。如為使之聚合。如為100W100W燈泡，照射距離應(yīng)大于燈泡，照射距離應(yīng)大于85 cm85 cm。聚合后的膠囊移。聚合后的膠囊移至室溫在紫外線下繼續(xù)照射至室溫在紫外線下繼續(xù)照射2 23 3天，可增加其硬度，便于切片。天，可增加其硬度，便于切片。 3) 3) 免疫染色免疫染色 切片貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上；切片貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上； 正常羊血清正常羊血清30 min30 min； 稀釋一抗，稀釋一抗，372h372h； 可用燒杯法可用燒杯法( (或塑料壺噴洗法或塑料

16、壺噴洗法) )，以鑷夾鎳網(wǎng)在燒杯中洗蕩；，以鑷夾鎳網(wǎng)在燒杯中洗蕩； 正常羊血清正常羊血清30min30min。 二抗以正常羊血清稀釋，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育。二抗以正常羊血清稀釋，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育。 沖洗如沖洗如。 覆于覆于2 2OsO4OsO4水溶液上，水溶液上，30min30min。 沖洗如沖洗如。 干燥后在電鏡下觀察。干燥后在電鏡下觀察。 注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：所有步驟在室溫、濕盒內(nèi)進(jìn)行；所有溶液需經(jīng)微孔濾紙濾過。所有步驟在室溫、濕盒內(nèi)進(jìn)行；所有溶液需經(jīng)微孔濾紙濾過。 Lowicryls Lowicryls 應(yīng)保存在暗處，一應(yīng)保存在暗處，一44，該物質(zhì)有刺激性，在配制時(shí)應(yīng)戴手套，該物

17、質(zhì)有刺激性，在配制時(shí)應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸汽刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸汽刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部。應(yīng)立即以水沖洗局部。 （2 2）LR whiteLR white和和LR goldLR gold 是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂；是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂； 具有極低粘度和較強(qiáng)嗜水性，穿透性強(qiáng)，有利于抗體具有極低粘度和較強(qiáng)嗜水性，穿透性強(qiáng)，有利于抗體( (或抗原或抗原) ) 和免疫化學(xué)物質(zhì)穿過和免疫化學(xué)物質(zhì)穿過LRLR樹脂，達(dá)到組織結(jié)合部位；樹脂，達(dá)到組織結(jié)合部位； 在免疫細(xì)胞化學(xué)的光鏡在免疫細(xì)胞化學(xué)的光

18、鏡( (半薄切片半薄切片) )和電鏡水平應(yīng)用都具有良好和電鏡水平應(yīng)用都具有良好 效果。效果。 標(biāo)本脫水至標(biāo)本脫水至7070乙醇即可，能較好地保持抗原性。乙醇即可，能較好地保持抗原性。 生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。 （3 3）GMAGMA（乙二醇甲基丙烯酸酯）（乙二醇甲基丙烯酸酯） 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 電子密度大；電子密度大； 影像反差好。影像反差好。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。 聚合過程中易造成組織損傷如人為的細(xì)胞器腫脹。聚合過程中易造成組織損傷如人為的細(xì)胞器腫脹。 缺乏穩(wěn)定性，不

19、能承受電子束轟擊，包埋劑遇熱升缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。 環(huán)氧樹脂：環(huán)氧樹脂：有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形；有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形；影像反差好，分辨率高；影像反差好，分辨率高；半薄切片染色不夠滿意，效果不如半薄切片染色不夠滿意，效果不如GMAGMA包埋切片的染色效果。包埋切片的染色效果。改進(jìn)方法：改進(jìn)方法：增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸丁脂和水、聚乙二醇400400改變其硬度。使之變軟；改變其硬度

20、。使之變軟；加入適量的交聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯以增強(qiáng)其抗電子束加入適量的交聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯以增強(qiáng)其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。轟擊的穩(wěn)定性。選用低溫型引發(fā)劑選用低溫型引發(fā)劑過氧化苯甲酰避免聚合時(shí)過快，產(chǎn)生過氧化苯甲酰避免聚合時(shí)過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結(jié)構(gòu)。高溫，損傷組織結(jié)構(gòu)。GMAGMA已廣泛應(yīng)用于半薄切片已廣泛應(yīng)用于半薄切片(1(13 um)3 um)的光鏡觀察，特別是的光鏡觀察，特別是組織化學(xué)方面的研究和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。組織化學(xué)方面的研究和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 1) 1) 過濾過濾: : GMA GMA單體溶液在出廠時(shí)都加有氫醌類穩(wěn)定劑，用前須單體溶液在出廠時(shí)都加有氫醌

21、類穩(wěn)定劑，用前須以每以每25ml25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5 min5 min，過，過濾以除去氫酯，以免影響聚合。濾以除去氫酯，以免影響聚合。 2) 2) 包埋劑的配制：包埋劑的配制： a. 100a. 100GMAGMA N- N-甲基丙烯酸丁酯甲基丙烯酸丁酯 66.5ml66.5ml 5 5乙烯二甲丙烯酸酯乙烯二甲丙烯酸酯 28.5ml28.5ml 1.5 1.5過氧化苯甲酰過氧化苯甲酰 1.0g1.0g 1.0 1.0PEG 400 1.0mlPEG 400 1.0ml GMAGMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免包埋劑的配制

22、、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法：疫細(xì)胞化學(xué)染色方法：b bA A液：液： GMAGMA單體液?jiǎn)误w液 90ml90ml PFG z300 5 PFG z300 59.4 ml9.4 ml 過氧化苯甲酰過氧化苯甲酰 0.20.20.69 g0.69 g 攪拌溶解后置棕色瓶?jī)?nèi)；攪拌溶解后置棕色瓶?jī)?nèi)；44保存。保存。 B B液：液： PEG z400 20 ml PEG z400 20 ml 二甲基苯胺二甲基苯胺 1 ml1 ml 應(yīng)用時(shí)應(yīng)用時(shí)A A：B B按按1010：1 1比例充分混。比例充分混。3) 3) 生物樣品處理：生物樣品處理： 組織固定可用組織固定可用PLPPLP液或液或

23、1 1戊二醛溶液戊二醛溶液( (磷酸緩沖液配制，磷酸緩沖液配制，Ph7.4)Ph7.4)。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMAGMA單體溶液中浸單體溶液中浸24h24h。 以上步驟可在室溫或以上步驟可在室溫或44進(jìn)行。進(jìn)行。 4) 4) 包埋聚合：包埋聚合： 組織移入盛滿包埋液的膠囊內(nèi)，放在真空泵內(nèi)以去除包組織移入盛滿包埋液的膠囊內(nèi)，放在真空泵內(nèi)以去除包埋液中的氣泡，然后在埋液中的氣泡，然后在44，以紫外線燈，以紫外線燈( (波長(zhǎng)波長(zhǎng)360nm)360nm)在距膠在距膠囊底部囊底部101020cm20cm處進(jìn)行照射處進(jìn)行照射121216h16h，以手指捏膠囊試其硬，以手指捏膠囊

24、試其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟人熱水中以度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟人熱水中以去除膠囊外殼去除膠囊外殼。 5)5) 包埋后染色包埋后染色: :切片貼在鎳網(wǎng)上，按膠體金標(biāo)記蛋白切片貼在鎳網(wǎng)上，按膠體金標(biāo)記蛋白A A技術(shù)（技術(shù)（PAgPAg法）進(jìn)行包埋后染色，鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。法）進(jìn)行包埋后染色，鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。 低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的 包埋后染色。能檢出應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的包埋后染色。能檢出應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的 多種抗原。多種抗原。（四）對(duì)照試驗(yàn)（四）對(duì)照試驗(yàn): 略略免疫電

25、鏡技術(shù)存在的問題：免疫電鏡技術(shù)存在的問題： 戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存，但對(duì)抗原活戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存，但對(duì)抗原活性有影響；性有影響； H H2 20 02 2能增加樹脂穿透性，但對(duì)微細(xì)結(jié)構(gòu)有損傷，能使反應(yīng)部能增加樹脂穿透性，但對(duì)微細(xì)結(jié)構(gòu)有損傷，能使反應(yīng)部位產(chǎn)生孔洞。位產(chǎn)生孔洞。 染色中清洗工作不徹底，可產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物和其他污染染色中清洗工作不徹底，可產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物和其他污染物，影響特異性反應(yīng)產(chǎn)物的顯示和觀察。物，影響特異性反應(yīng)產(chǎn)物的顯示和觀察。二、幾種常用的透射電鏡方法要點(diǎn)二、幾種常用的透射電鏡方法要點(diǎn) （一）鐵蛋白標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)一）鐵蛋白標(biāo)記免疫電鏡

26、技術(shù) （二）過氧化物酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（二）過氧化物酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù) （三）膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（三）膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù) （四）凝集素標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（四）凝集素標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（一）鐵蛋白標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（一）鐵蛋白標(biāo)記免疫電鏡技術(shù) 1 1 原理原理 鐵蛋白：鐵蛋白：是一種含鐵約占是一種含鐵約占2323的蛋白質(zhì)，鐵蛋白含有致密的鐵離子核的蛋白質(zhì)，鐵蛋白含有致密的鐵離子核 心，含心，含2000200030003000個(gè)鐵原子，分布于四個(gè)區(qū)域，形成四個(gè)圓形致密個(gè)鐵原子，分布于四個(gè)區(qū)域，形成四個(gè)圓形致密 區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。區(qū)，具有很高的電子密度，便于電鏡觀察。 抗體與鐵

27、蛋白通過雙功能試劑結(jié)合為一種雙分子復(fù)合物?？贵w與鐵蛋白通過雙功能試劑結(jié)合為一種雙分子復(fù)合物。此復(fù)合物保留了抗體的免疫活性，通過電鏡可定位抗原。適于細(xì)胞表面此復(fù)合物保留了抗體的免疫活性，通過電鏡可定位抗原。適于細(xì)胞表面抗原的定位抗原的定位 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：鐵蛋白易從馬脾中獲得，呈顆粒狀，易分辨；鐵蛋白易從馬脾中獲得，呈顆粒狀，易分辨；缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：分子量較大，不易穿透細(xì)胞膜和組織，對(duì)于細(xì)胞分子量較大，不易穿透細(xì)胞膜和組織，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)抗原的定位較困難。只適合電鏡檢查，不能用普通光學(xué)顯微鏡觀察。內(nèi)抗原的定位較困難。只適合電鏡檢查，不能用普通光學(xué)顯微鏡觀察。因此，在近年來逐漸被免疫酶和膠體金取代。因此，在近

28、年來逐漸被免疫酶和膠體金取代。 2 2 電鏡標(biāo)本的制備電鏡標(biāo)本的制備v（1 1）固定）固定 同常規(guī)電鏡（醛類和四氧化鋨雙固定）同常規(guī)電鏡（醛類和四氧化鋨雙固定） 鐵蛋白標(biāo)記抗體分子量大，如用于細(xì)胞表面抗原的定位研究，鐵蛋白標(biāo)記抗體分子量大，如用于細(xì)胞表面抗原的定位研究，可將樣品直接放入固定液；細(xì)胞內(nèi)抗原測(cè)定需：可將樣品直接放入固定液；細(xì)胞內(nèi)抗原測(cè)定需：凍融法：凍融法：固定后凍融使細(xì)胞膜破裂，標(biāo)記抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。固定后凍融使細(xì)胞膜破裂，標(biāo)記抗體能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。冰凍切片法：冰凍切片法：固定后速凍，切成固定后速凍，切成10-15um10-15um薄片，融化的切片直接薄片，融化的切片直接浸泡于鐵蛋白標(biāo)

29、記的抗體液中。浸泡于鐵蛋白標(biāo)記的抗體液中。戊二醛固定后，浸入洋地黃皂甙液中戊二醛固定后，浸入洋地黃皂甙液中1-2min1-2min，增強(qiáng)細(xì)胞膜穿透性，增強(qiáng)細(xì)胞膜穿透性，使標(biāo)記抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使標(biāo)記抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)冰凍超薄切片鐵蛋白標(biāo)記抗體免疫電鏡圖冰凍超薄切片鐵蛋白標(biāo)記抗體免疫電鏡圖 艾滋病患者血清的免疫電鏡所見。艾滋病患者血清的免疫電鏡所見。在病毒顆粒表面可見鐵蛋白顆粒的吸附。在病毒顆粒表面可見鐵蛋白顆粒的吸附。 在細(xì)胞質(zhì)的空泡內(nèi)可見到大量的與細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)的空泡內(nèi)可見到大量的與細(xì)胞外所見相同的病毒顆粒。外所見相同的病毒顆粒。 培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)LDLLDL的內(nèi)吞作用的內(nèi)

30、吞作用LDLLDL顆粒與含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白共價(jià)相連，顆粒與含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白共價(jià)相連， 電子顯微鏡下所見的黑點(diǎn)是小分子電子顯微鏡下所見的黑點(diǎn)是小分子的鐵。（的鐵。（a a）LDLLDL與細(xì)胞表面的受體結(jié)合并形成有網(wǎng)格蛋白包被的小窩；（與細(xì)胞表面的受體結(jié)合并形成有網(wǎng)格蛋白包被的小窩；（b b） 含有含有LDLLDL的被膜小窩向下凹陷逐漸形成被膜小泡；（的被膜小窩向下凹陷逐漸形成被膜小泡；（c c） 含有轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記的含有轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記的LDLLDL被膜小泡；（被膜小泡；（d d）含有轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記的）含有轉(zhuǎn)鐵蛋白標(biāo)記的LDLLDL顆粒的無被小泡（初級(jí)內(nèi)體）。顆粒的無被小泡（初級(jí)內(nèi)體）。 （2 2） 免疫染色

31、方法免疫染色方法 常采用包埋前免疫染色，分為直接法和間接法。常采用包埋前免疫染色，分為直接法和間接法。 （1 1）直接法：）直接法： 切片直接浸于標(biāo)記的特異性抗體內(nèi)，室溫或切片直接浸于標(biāo)記的特異性抗體內(nèi)，室溫或3713712h2h以上；以上； 緩沖液浸漂，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體溶液；緩沖液浸漂，除去未結(jié)合的標(biāo)記抗體溶液； 再按常規(guī)電鏡后固定、脫水、包埋。再按常規(guī)電鏡后固定、脫水、包埋。 （2 2）間接法：）間接法： 將切片浸入一抗室溫孵育將切片浸入一抗室溫孵育303060min60min； 大量冷緩沖液充分洗滌大量冷緩沖液充分洗滌(3(330min)30min)； 浸入鐵蛋白標(biāo)記二抗中，室溫孵育

32、浸入鐵蛋白標(biāo)記二抗中，室溫孵育30min30min； 充分洗滌后，可以自然沉淀或用離心方法撈取組織片；充分洗滌后，可以自然沉淀或用離心方法撈取組織片； 將離心沉淀小塊，用四氧化鋨固定將離心沉淀小塊，用四氧化鋨固定3030分鐘；分鐘； 常規(guī)電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。常規(guī)電鏡脫水、包埋、切片、染色和觀察。（二）過氧化物酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（二）過氧化物酶標(biāo)記免疫電鏡技術(shù) 1 1 原理：原理：利用酶作為抗原抗體復(fù)合物的標(biāo)記物，再經(jīng)酶對(duì)底物作用生成利用酶作為抗原抗體復(fù)合物的標(biāo)記物，再經(jīng)酶對(duì)底物作用生成有較高電子密度的產(chǎn)物。有較高電子密度的產(chǎn)物。HRPHRP分子量小分子量小(40 000)(40

33、000)，穿透力強(qiáng)，有利于標(biāo)記抗，穿透力強(qiáng)，有利于標(biāo)記抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適于細(xì)胞內(nèi)的抗原定位。體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適于細(xì)胞內(nèi)的抗原定位。2 2 方法方法（1 1）單層細(xì)胞培養(yǎng)物免疫酶染色法）單層細(xì)胞培養(yǎng)物免疫酶染色法 用用4%4%多聚甲醛原位固定多聚甲醛原位固定1h;1h; PBS PBS充分洗滌，用充分洗滌，用HRPHRP標(biāo)記的抗體血清作用標(biāo)記的抗體血清作用18h18h，再用，再用PBSPBS水洗；水洗； 2% 2%戊二醛固定戊二醛固定1h1h，再水洗；，再水洗； DAB DAB顯色顯色 鋨酸固定、樹脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片鋨酸固定、樹脂包埋，半薄切片定位后作超薄切片 （2 2）組織切片酶標(biāo)

34、記抗體染色法）組織切片酶標(biāo)記抗體染色法 1mm 1mm厚組織塊，固定后如蔗糖保護(hù)液厚組織塊，固定后如蔗糖保護(hù)液; ; 做做10-40um10-40um冰凍切片，放入一抗血清作用冰凍切片，放入一抗血清作用12-18h12-18h，用含蔗糖，用含蔗糖的的PBSPBS水洗；水洗； 置于置于HRPHRP標(biāo)記抗體液標(biāo)記抗體液4 4 過夜，再水洗，浸漂過夜；過夜，再水洗，浸漂過夜； 戊二醛再固定戊二醛再固定1h1h，用含蔗糖的，用含蔗糖的PBSPBS水洗；水洗； DAB DAB顯色；顯色； 鋨酸固定、脫水、樹脂包埋，切片復(fù)染和觀察鋨酸固定、脫水、樹脂包埋，切片復(fù)染和觀察 vHRPHRP標(biāo)記抗體，通過標(biāo)記抗

35、體，通過DABDAB呈色反應(yīng)，呈色反應(yīng)，DABDAB分解產(chǎn)物為不溶性的分解產(chǎn)物為不溶性的棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過棕色吩嗪衍生物，經(jīng)過Os04Os04處理后變黑，具有高電子密度，處理后變黑，具有高電子密度，適合于電鏡觀察；適合于電鏡觀察；vHRPHRP分子量比鐵蛋白將近小分子量比鐵蛋白將近小2020倍，酶標(biāo)抗體較易透過經(jīng)適當(dāng)倍，酶標(biāo)抗體較易透過經(jīng)適當(dāng)處理后的組織細(xì)胞膜，能用于定位細(xì)胞內(nèi)抗原。但酶反應(yīng)產(chǎn)處理后的組織細(xì)胞膜，能用于定位細(xì)胞內(nèi)抗原。但酶反應(yīng)產(chǎn)物的分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高物的分辨率不如顆粒性標(biāo)記物高( (如鐵蛋白，膠體金如鐵蛋白，膠體金) )。 （3 3）包埋前）包埋前PAPPAP法：常用法

36、：常用 固定組織；固定組織； 振動(dòng)切片機(jī)切振動(dòng)切片機(jī)切303050um50um厚片；厚片； 入正常羊血清入正常羊血清(5(51010，PBSPBS稀釋稀釋) )室溫孵育室溫孵育30min30min。 加一抗，加一抗，44濕盒中濕盒中484872h72h。 加二抗，室溫孵育加二抗，室溫孵育30min30min。 PAP PAP復(fù)合物復(fù)合物( (與一抗同種屬動(dòng)物制備與一抗同種屬動(dòng)物制備) )室溫孵育室溫孵育30min30min。 H H2 2O O2 2DABDAB，室溫作用，室溫作用15min15min。 光鏡下選出陽性部位，修整后按常規(guī)電鏡程序，四氧化光鏡下選出陽性部位，修整后按常規(guī)電鏡程序，

37、四氧化 鋨后固定、脫水、包埋、超薄切片、觀察。鋨后固定、脫水、包埋、超薄切片、觀察。（4 4）包埋后）包埋后PAPPAP法：法： 載有超薄切片的鎳網(wǎng)入載有超薄切片的鎳網(wǎng)入5 5H H2 2O O2 2液內(nèi)蝕刻，生理鹽水洗，液內(nèi)蝕刻，生理鹽水洗， 濾紙吸干。濾紙吸干。 5 5正常羊血清，室溫正常羊血清，室溫5min5min。 加一抗加一抗) )，44孵育孵育48h48h，TBSTBS洗。洗。 5 5正常羊血清，室溫正常羊血清，室溫5min5min。 加二抗室溫加二抗室溫5min5min，后用，后用TBSTBS洗。洗。 5 5正常羊血清，室溫正常羊血清，室溫5min5min。 加加PAPPAP復(fù)合

38、物室溫復(fù)合物室溫3min3min。 H H2 2O O2 2一一DABDAB顯色，室溫顯色，室溫3min3min。 入入1 1四氧化鋨液四氧化鋨液101015min15min后，蒸餾水洗，電鏡觀察。后，蒸餾水洗，電鏡觀察。（5 5）PAPPAP免疫電鏡雙重標(biāo)記：免疫電鏡雙重標(biāo)記：連續(xù)超薄切片上進(jìn)行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同連續(xù)超薄切片上進(jìn)行，用包埋后染色法在相鄰的兩張切片上分別以不同的抗體進(jìn)行免疫染色?？稍诔⒔Y(jié)構(gòu)水平判定細(xì)胞內(nèi)抗原共存的情況。的抗體進(jìn)行免疫染色?？稍诔⒔Y(jié)構(gòu)水平判定細(xì)胞內(nèi)抗原共存的情況。（三）膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)（三）膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)v1971197

39、1年首創(chuàng)膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)。年首創(chuàng)膠體金標(biāo)記免疫電鏡技術(shù)。v膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電，使其與抗體相吸附，從而標(biāo)記抗體；膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電，使其與抗體相吸附，從而標(biāo)記抗體；v金標(biāo)抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，在光鏡膠體金液呈櫻紅色，不需另外染色；金標(biāo)抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，在光鏡膠體金液呈櫻紅色，不需另外染色；v電鏡下，膠體金顆粒，具有高電子密度，清晰可辨；在電鏡比鐵蛋白顆電鏡下，膠體金顆粒，具有高電子密度，清晰可辨；在電鏡比鐵蛋白顆粒更致密，易于辨認(rèn)，可代替鐵蛋白作為掃描免疫電鏡的標(biāo)記物；定位粒更致密，易于辨認(rèn)，可代替鐵蛋白作為掃描免疫電鏡的標(biāo)記物；定位比酶反應(yīng)物精確。比酶反應(yīng)物精確。v膠體金容易和多

40、種大分子物質(zhì)、包括抗體、膠體金容易和多種大分子物質(zhì)、包括抗體、A A蛋白、凝集素等結(jié)合。根蛋白、凝集素等結(jié)合。根據(jù)制備方法不同，可以得到直徑在據(jù)制備方法不同，可以得到直徑在3-150nm3-150nm之間的各種大小的膠體金顆之間的各種大小的膠體金顆粒；分別使用不同直徑的膠體金顆粒制備標(biāo)記物，可以在同粒；分別使用不同直徑的膠體金顆粒制備標(biāo)記物，可以在同- -標(biāo)本片上標(biāo)本片上顯示兩種或多種抗原物質(zhì)，即所謂雙標(biāo)記或多標(biāo)記。顯示兩種或多種抗原物質(zhì)，即所謂雙標(biāo)記或多標(biāo)記。 原理：原理： 膠體金是表面帶負(fù)電荷的疏水性顆粒，可與抗體相吸附，膠體金是表面帶負(fù)電荷的疏水性顆粒，可與抗體相吸附，從而標(biāo)記抗體。用金

41、標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，光鏡觀察從而標(biāo)記抗體。用金標(biāo)記的抗體與抗原反應(yīng)時(shí)，光鏡觀察呈櫻紅色。由于金顆粒具有很高的電子密度，電鏡觀察清呈櫻紅色。由于金顆粒具有很高的電子密度，電鏡觀察清晰可辨。晰可辨。 金顆粒可分為三種，小顆粒直徑金顆?？煞譃槿N，小顆粒直徑3 35nm5nm，中顆粒，中顆粒10nm10nm，大，大顆粒顆粒20nm20nm。膠體金可標(biāo)記許多大分子，最常用的是蛋白。膠體金可標(biāo)記許多大分子，最常用的是蛋白A A一金和一金和IgIg一金。可以利用不同直徑的金顆粒標(biāo)記不同抗體一金。可以利用不同直徑的金顆粒標(biāo)記不同抗體研究不同物質(zhì)共存于同一細(xì)胞組織；也可以與研究不同物質(zhì)共存于同一細(xì)胞組織；

42、也可以與PAPPAP法相結(jié)法相結(jié)合進(jìn)行雙重或多重超微結(jié)構(gòu)定位。合進(jìn)行雙重或多重超微結(jié)構(gòu)定位。 方法：方法：1 1 電鏡水平的免疫金染色法電鏡水平的免疫金染色法包埋前染色：膠體金對(duì)質(zhì)膜的穿透力較差，只用于細(xì)胞表面的抗原標(biāo)記。包埋前染色：膠體金對(duì)質(zhì)膜的穿透力較差，只用于細(xì)胞表面的抗原標(biāo)記。包埋后染色：現(xiàn)在普遍采用。包埋后染色：現(xiàn)在普遍采用。（1 1）包埋后染色：）包埋后染色：超薄切片置于鎳網(wǎng)上超薄切片置于鎳網(wǎng)上 1 1H H2 2O O2 2液內(nèi)蝕刻，雙蒸水洗滌液內(nèi)蝕刻，雙蒸水洗滌3 3次次浮于正常羊血清滴上，室溫浮于正常羊血清滴上，室溫30-60min30-60min；孵育于一抗上，孵育于一抗上

43、， ，44過夜，過夜，PBSPBS水洗；水洗；PBSPBS（內(nèi)含（內(nèi)含1%1%的牛血清白蛋白）的牛血清白蛋白）PH8.2PH8.2，5min5min，為膠體金結(jié)合做準(zhǔn)備；，為膠體金結(jié)合做準(zhǔn)備；膠體金標(biāo)記抗體液，室溫孵育膠體金標(biāo)記抗體液，室溫孵育10min-1h10min-1h，雙蒸水洗滌；，雙蒸水洗滌；如做雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復(fù)上述步驟；如做雙重染色，則應(yīng)將鎳網(wǎng)翻過來，用另一類抗體血清，重復(fù)上述步驟；醋酸鈾染色醋酸鈾染色5min5min，雙蒸水洗滌，枸櫞酸鈾染色，雙蒸水洗滌，枸櫞酸鈾染色5min5min，雙蒸水洗滌；，雙蒸水洗滌；電鏡觀察電鏡觀察（2 2）包埋前染色

44、：）包埋前染色：組織經(jīng)適當(dāng)固定，為增強(qiáng)細(xì)胞穿透力，可在固定液中加入皂角素；組織經(jīng)適當(dāng)固定，為增強(qiáng)細(xì)胞穿透力，可在固定液中加入皂角素；TBSTBS洗滌；洗滌；正常羊血清處理；正常羊血清處理；一抗孵育，一抗孵育， 44過夜，過夜，0.05mol/L TBS0.05mol/L TBS水洗；水洗； 0.02mol/L TBS 0.02mol/L TBS水洗，為膠體金結(jié)合做準(zhǔn)備；水洗，為膠體金結(jié)合做準(zhǔn)備；正常羊血清再次阻斷非特異性吸附；正常羊血清再次阻斷非特異性吸附； 金標(biāo)二抗體液，室溫孵育金標(biāo)二抗體液，室溫孵育1h1h，TBSTBS水洗；水洗；1%1%鋨酸鋨酸1h1h，雙蒸水洗，雙蒸水洗15min15min；系列酒精或丙酮脫水、包埋、超薄切片；系列酒精或丙酮脫水、包埋、超薄切片；枸櫞酸鉛對(duì)照染色枸櫞酸鉛對(duì)照染色2 2 膠體金標(biāo)記蛋白膠體金標(biāo)記蛋白A A技術(shù)（技術(shù)（PAgPAg法）法）在免疫電鏡中應(yīng)用較為廣泛。在免疫電鏡