微生物的無菌操作及接種技術(shù)

1、o 微生物無菌操作技術(shù)微生物無菌操作技術(shù)o 接種技術(shù)接種技術(shù)o 工業(yè)生產(chǎn)中的微生物接種工業(yè)生產(chǎn)中的微生物接種微生物無菌操作及接種技術(shù)微生物無菌操作及接種技術(shù)一、一、微生物無菌操作技術(shù)微生物無菌操作技術(shù)無菌操作技術(shù)：無菌操作技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。1 1接種針接種針 2.2.接種環(huán)接種環(huán) 3.3.接種鉤接種鉤 4.5.4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.6.接種圈接種圈 7.7.接種鋤接種鋤 8.8.小解剖刀小解剖刀一、一、微生物無菌操作技術(shù)微生物無菌操

2、作技術(shù)一、一、微生物無菌操作技術(shù)微生物無菌操作技術(shù)二、原理：二、原理：o 無菌技術(shù)：無菌技術(shù)：指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，指在微生物實(shí)驗(yàn)工作中，控制或防止各類微生物的污染及其控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。干擾的一系列操作方法和有關(guān)措施。o 接種：接種：將微生物接到適于它生長繁將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程。的過程。微生物無菌操作技術(shù)與接種技術(shù)微生物無菌操作技術(shù)與接種技術(shù)o 接種的準(zhǔn)備工作接種的準(zhǔn)備工作n 無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持n 進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備n 無菌操作的要求無菌操作

3、的要求o 接種的操作方法接種的操作方法二、二、 微生物接種技術(shù)微生物接種技術(shù)無菌環(huán)境無菌環(huán)境無菌室無菌室超凈工作臺超凈工作臺無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持（一）接種的準(zhǔn)備工作（一）接種的準(zhǔn)備工作（1）無菌室的結(jié)構(gòu)：）無菌室的結(jié)構(gòu)：o 應(yīng)有更衣間、緩沖間、應(yīng)有更衣間、緩沖間、操作間操作間o 應(yīng)有良好的通風(fēng)條件，應(yīng)有良好的通風(fēng)條件，安裝空調(diào)設(shè)備及過濾設(shè)安裝空調(diào)設(shè)備及過濾設(shè)備備無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持1 1、無菌室、無菌室無菌室的結(jié)構(gòu)無菌室的結(jié)構(gòu)（2）無菌室的消毒和防污染）無菌室的消毒和防污染o 無菌室內(nèi)空氣測試應(yīng)基本達(dá)到無菌。無菌室內(nèi)空氣測試應(yīng)基本達(dá)到無菌。o 每日（使用

4、前）紫外線照射（每日（使用前）紫外線照射（12小時(shí)）小時(shí)）.o 每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）小時(shí)）.o 每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。o 定期作實(shí)驗(yàn)室沉降菌計(jì)數(shù)，以檢查無菌室微生物生長繁殖定期作實(shí)驗(yàn)室沉降菌計(jì)數(shù)，以檢查無菌室微生物生長繁殖動態(tài)。動態(tài)。無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持2 2、超凈工作臺、超凈工作臺 超凈工作臺是為實(shí)驗(yàn)室工作提供無菌操作環(huán)境的設(shè)施，以超凈工作臺是為實(shí)驗(yàn)室工作提供無菌操作環(huán)境的設(shè)施，以保護(hù)實(shí)驗(yàn)免受外部環(huán)境的影響，同時(shí)為外部環(huán)境提供某些程保護(hù)實(shí)驗(yàn)免受外部

5、環(huán)境的影響，同時(shí)為外部環(huán)境提供某些程度的保護(hù)以防污染并保護(hù)操作者。度的保護(hù)以防污染并保護(hù)操作者。 原理：超凈工作臺的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔凈空原理：超凈工作臺的潔凈環(huán)境是在特定的空間內(nèi)，潔凈空氣氣( (進(jìn)濾空氣進(jìn)濾空氣) )按設(shè)定的方向流動而形成的。以氣流方向來分，按設(shè)定的方向流動而形成的。以氣流方向來分，現(xiàn)有的超凈工作臺可分為垂直式，由內(nèi)向外式以及側(cè)向式。現(xiàn)有的超凈工作臺可分為垂直式，由內(nèi)向外式以及側(cè)向式。 無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持垂直流超凈工作臺 水平流超凈工作臺水平流超凈工作臺 垂直流超凈工作臺垂直流超凈工作臺 超凈臺的使用與維護(hù)超凈臺的使用與維護(hù)o風(fēng)速保持在風(fēng)速保

6、持在0.32-0.480.32-0.48米米/ /秒秒o使用前打開紫外燈照射使用前打開紫外燈照射4060mino開啟超凈工作臺工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用開啟超凈工作臺工作電源，關(guān)閉紫外燈，并用75%的酒精或的酒精或0.5%過氧乙過氧乙酸噴灑擦拭消毒工作臺面。酸噴灑擦拭消毒工作臺面。o使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布檫拭；使用中，有機(jī)玻璃罩受到污染，嚴(yán)禁用酒精棉球擦拭，請用含水棉布檫拭；o請保持超凈臺整潔、干燥，不要堆積雜物；請保持超凈臺整潔、干燥，不要堆積雜物；o使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈；使用完畢，關(guān)閉煤氣開關(guān)或酒精燈；o使用完畢后，使用完畢后，用消毒液擦拭工

7、作臺面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照用消毒液擦拭工作臺面，關(guān)閉工作電源，重新開啟紫外燈照射射15min. .o定期做無菌試驗(yàn)，以測定凈化臺是否符合無菌要求。定期做無菌試驗(yàn)，以測定凈化臺是否符合無菌要求。無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持3 3、無菌器材準(zhǔn)備、無菌器材準(zhǔn)備o 滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等. o 消毒器材：接種試管、無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、消毒器材：接種試管、無菌室內(nèi)的凳子、試管架、天平、工作臺等工作臺等無菌環(huán)境的要求與保持無菌環(huán)境的要求與保持（1）定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；）定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；（

8、2）用紫外線滅菌處理）用紫外線滅菌處理3060min；（3）檢查無菌器材是否完備；）檢查無菌器材是否完備；（4）實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入無菌室前先用肥皂洗手，然后用）實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入無菌室前先用肥皂洗手，然后用75酒酒精棉球?qū)⑹植粮蓛?。精棉球?qū)⑹植粮蓛簟＃?）緩沖室內(nèi)換上洗凈并經(jīng)紫外線燈照射過的工作衣、帽、）緩沖室內(nèi)換上洗凈并經(jīng)紫外線燈照射過的工作衣、帽、鞋。鞋。進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備進(jìn)入無菌室前的準(zhǔn)備（1 1）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；）在操作中不應(yīng)有大幅度或快速的動作；（2 2）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。）使用玻璃器皿應(yīng)輕取輕放。（3 3）在火焰上方操作；）在火焰上方操作；（4 4）接種用具在使用前、后

9、都必須灼燒滅菌；）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5 5）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)）在接種培養(yǎng)物時(shí)，協(xié)作應(yīng)輕、準(zhǔn)。（6 6）不能用嘴直接吸吹吸管。）不能用嘴直接吸吹吸管。（7 7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有）帶有菌液的吸管、玻片等器材應(yīng)及時(shí)置于盛有5%5%來蘇爾溶液的來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒。消毒桶內(nèi)消毒。 無菌操作要求無菌操作要求無菌操作要求無菌操作要求無菌操作要求無菌操作要求n 接種的基本程序接種的基本程序n 常用接種方法常用接種方法o 斜面接種斜面接種o 劃線接種劃線接種o 液體接種液體接種o 穿刺接種穿刺接種 （二）接種的操作方法（二）接種的操作方法1 1、接種

10、的基本程序、接種的基本程序滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)沾取標(biāo)本沾取標(biāo)本接種接種滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染標(biāo)本殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境殺滅接種環(huán)沾染的微生物，以免污染環(huán)境操作需在無菌室或超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行操作需在無菌室或超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行無菌室、超凈工作臺使用前后需進(jìn)行無菌室、超凈工作臺使用前后需進(jìn)行消毒。消毒。實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌實(shí)驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌（二）接種的操作方法（二）接種的操作方法2 2、常用的接種方法、常用的接種方法斜面接種斜面接種劃線接種劃線接種液體接種液體接種穿刺接種穿刺接種 （二）接種的操作方

11、法（二）接種的操作方法 斜面接種：斜面接種： 從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮從已生長好的菌種斜面上挑取少量菌種移植至另一新鮮斜面培養(yǎng)基上的接種方法。斜面培養(yǎng)基上的接種方法。 用于用于好氣性微生物好氣性微生物的接種。的接種。2 2、常用的接種方法、常用的接種方法1)標(biāo)記：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人姓名標(biāo)記：接種前在試管上注明菌名、接種日期、接種人姓名2)點(diǎn)燃酒精燈。點(diǎn)燃酒精燈。3)接種：接種：（1）手持試管）手持試管 將菌種管和待接斜面管用大姆指和其他四指握將菌種管和待接斜面管用大姆指和其他四指握在左手中，中指位于兩管之間。斜面向上，在左手中，中指位于兩管之間。斜

12、面向上，盡量放平盡量放平。（2）旋松管塞）旋松管塞（3）接種環(huán)灼燒滅菌接種環(huán)灼燒滅菌 斜面接種斜面接種 斜面接種斜面接種（4）拔管塞：拔管塞： 用右手的無用右手的無名指、小指和手掌邊先后名指、小指和手掌邊先后取下菌種管和待接試管的取下菌種管和待接試管的管塞，讓試管口緩緩過火管塞，讓試管口緩緩過火滅菌滅菌(切勿燒得過燙切勿燒得過燙) 斜面接種斜面接種（5）取菌）取菌: 接種環(huán)冷卻，輕接種環(huán)冷卻，輕沾取少量菌體或胞子，沾取少量菌體或胞子，然后將接種環(huán)移出菌種然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使接種環(huán)管，注意不要使接種環(huán)碰到管壁，取出后帶菌碰到管壁，取出后帶菌接種環(huán)不可通過火焰。接種環(huán)不可通過火焰。

13、斜面接種斜面接種 （6）接種）接種: n 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面管。從在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)伸入待接斜面管。從斜面培養(yǎng)基底部向上作斜面培養(yǎng)基底部向上作“Z”形來回密集劃線，勿劃破培形來回密集劃線，勿劃破培養(yǎng)基。養(yǎng)基。n 有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作有時(shí)也可用接種針僅在斜面培養(yǎng)基的中央拉一條直線作斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長特點(diǎn)。斜面接種，直線接種可觀察不同菌種的生長特點(diǎn)。 斜面接種斜面接種 (7) 塞管塞：塞管塞： 取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞取出接種環(huán)，灼燒試管口，并在火焰旁將管塞旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動時(shí)

14、納入不潔旋上。不要用試管去迎棉塞，以免試管在移動時(shí)納入不潔空氣?？諝狻?(8) 將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。將接種環(huán)灼燒滅菌。放下接種環(huán)，再將棉花塞旋緊。 斜面接種示意圖斜面接種示意圖由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。由斜面菌接種到液體培養(yǎng)基（如試管或三角瓶等）中的方法。操作方法：操作方法： 與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)使與斜面法基本一致，只是在將接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)使環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上棉環(huán)在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上棉塞再輕輕搖勻。塞再輕輕搖勻。 如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一

15、般用移液管或滴管如果菌種是培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中時(shí)，一般用移液管或滴管接種接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法 液體接種液體接種2 2、常用的接種方法、常用的接種方法劃線劃線接種接種目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長，形成單個(gè)菌落，以便獲得目的：使混合的細(xì)菌呈單個(gè)分散生長，形成單個(gè)菌落，以便獲得純菌、活菌計(jì)數(shù)。純菌、活菌計(jì)數(shù)。方法：方法： 分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標(biāo)本 連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標(biāo)本2 2、常用的接種方法、常用的接種方法劃線劃線接種接種分區(qū)劃線法分區(qū)劃線法第一區(qū)劃線第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第二區(qū)

16、劃線第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)滅菌接種環(huán)2 2、常用的接種方法、常用的接種方法劃線劃線接種接種連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法2 2、常用的接種方法、常用的接種方法劃線劃線接種接種用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的用接種針從菌種斜面上挑取少量菌體并把它穿刺到固體或半固體的深層培養(yǎng)基中的接種方法。深層培養(yǎng)基中的接種方法。 用于用于厭氣性厭氣性細(xì)菌培養(yǎng)、檢查細(xì)菌的細(xì)菌培養(yǎng)、檢查細(xì)菌的運(yùn)動能力、運(yùn)動能力、保藏菌種保藏菌種。 只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)只適宜于細(xì)菌和酵母的接種培養(yǎng)2 2、常用的接種方法、常用的接種方法穿刺穿刺接種接種穿刺接種方法：穿刺接種

17、方法： 1) 標(biāo)記標(biāo)記 2) 點(diǎn)燃酒精燈點(diǎn)燃酒精燈 3）接種）接種 （1）手持試管）手持試管 （2）旋松棉塞旋松棉塞 （3）接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也接種針灼燒滅菌，把在穿刺中可能伸入試管的其他部位也灼燒滅菌灼燒滅菌 2 2、常用的接種方法、常用的接種方法穿刺穿刺接種接種（4 4）拔出棉塞）拔出棉塞（5）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種）取菌：用冷卻接種針的針尖沾取少量菌種（6）穿刺：將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入培養(yǎng)）穿刺：將接種針自培養(yǎng)基中心平穩(wěn)、快速垂直刺入培養(yǎng)基，至接近試管底部，然后沿接種線拔出基，至接近試管底部，然后沿接種線拔出（7）塞上棉塞）塞上

18、棉塞（8）接種針灼燒滅菌）接種針灼燒滅菌2 2、常用的接種方法、常用的接種方法穿刺穿刺接種接種1 1、什么是無菌技術(shù)？、什么是無菌技術(shù)？2 2、如何做好無菌室的消毒和防污染工作？、如何做好無菌室的消毒和防污染工作？3 3、如何做好超凈臺的使用與保養(yǎng)？、如何做好超凈臺的使用與保養(yǎng)？4 4、無菌操作的目的是什么？、無菌操作的目的是什么？5 5、進(jìn)入無菌室前要做好哪些準(zhǔn)備工作？、進(jìn)入無菌室前要做好哪些準(zhǔn)備工作？6 6、驗(yàn)操作過程的無菌操作要求包括哪些內(nèi)容？、驗(yàn)操作過程的無菌操作要求包括哪些內(nèi)容？7 7、 接種時(shí)，為何要盡量使試管平放？接種時(shí)，為何要盡量使試管平放？8 8、穿刺接種時(shí)能否將接種針直接穿透培養(yǎng)基？、穿刺接種時(shí)能否將接種針直接穿透培養(yǎng)基？ 問題和討論問題和討論 工業(yè)生產(chǎn)中培養(yǎng)的菌種接入種子罐時(shí)，一般先制成菌懸液。工業(yè)生產(chǎn)中培養(yǎng)的菌種接入種子罐時(shí)，一般先制成菌懸液。常用的方法有壓差法、火焰封口法等。常用的方法有壓差法、火焰封口法等。 1 、火焰封口法、火焰封口法 種子罐的接種口周圍設(shè)有溝槽，接種時(shí)先在溝槽里注入少種子罐的接種口周圍設(shè)有溝槽，接種時(shí)先在溝槽里注入少量酒精，然后用火焰點(diǎn)燃酒精，使接種口被包圍在一堆火量酒精，然后用火焰點(diǎn)燃酒精，使接種口被包圍在一堆火焰之中，接著將菌懸液倒入種子罐中即可。焰之中，接著將菌懸液倒入種子罐中即可。 工業(yè)生產(chǎn)中的微生物接種