T-SPOT診斷結(jié)核感染臨床應(yīng)用進(jìn)展

1、 T-SPOT.TB診斷結(jié)核感染 臨床應(yīng)用進(jìn)展主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用2主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用3結(jié)核的現(xiàn)狀結(jié)核的現(xiàn)狀 結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)結(jié)核病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球約有統(tǒng)計(jì)，全球約有20億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約億人感染結(jié)核分枝桿菌，每年有約200萬(wàn)人死于結(jié)核。萬(wàn)人死于結(jié)核。 我國(guó)是世界上我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的感染

2、導(dǎo)致的死亡人數(shù)是其他傳染性疾病總死亡人數(shù)的2倍以上。倍以上。4中國(guó)是結(jié)核感染高負(fù)擔(dān)國(guó)家n患者人數(shù)占全球的14.3%，具體表現(xiàn)為“五多”n感染人數(shù)多5.5億人感染過(guò)結(jié)核n患病人數(shù)多現(xiàn)有活動(dòng)性肺結(jié)核患者500萬(wàn)n潛伏感染人數(shù)多受限于檢測(cè)條件較難統(tǒng)計(jì)，2009年流行病調(diào)查結(jié)果為總?cè)丝诘?4.5%（因采用PPD檢測(cè)，假陽(yáng)性較多）n新發(fā)患者多僅活動(dòng)性肺結(jié)核2009年新發(fā)病患107萬(wàn)n死亡人數(shù)多13萬(wàn)/年5結(jié)核的傳統(tǒng)診斷手段結(jié)核的傳統(tǒng)診斷手段u結(jié)核菌素皮試：結(jié)核菌素皮試：低敏感性：低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。低特異性：低特異性：與卡介苗接種和其他環(huán)境分枝桿菌有交叉，易造成“假陽(yáng)性”結(jié)果。u

3、免疫學(xué)診斷 抗原、抗體（膠體金）u細(xì)菌學(xué)檢查：細(xì)菌學(xué)檢查：常規(guī)培養(yǎng)：2月；快速培養(yǎng)：1周； 涂片陽(yáng)性率取決于采集標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量，不利于早期診斷。u病理學(xué)檢查：病理學(xué)檢查：陽(yáng)性率低，對(duì)取材有較高要求，有創(chuàng)傷，對(duì)肉芽腫性病變需進(jìn)一步鑒別。u分子生物學(xué)診斷 PCRu影像學(xué)檢查6 免疫學(xué)診斷PPD皮膚試驗(yàn) 抗體檢測(cè) 假陽(yáng)性率高 48-72h讀取結(jié)果 敏感性、特異性差 7WHO關(guān)于血清學(xué)檢測(cè)聲明n2011年7月20日，世界衛(wèi)生組織（WHO）正式聲明，要求禁止將血清學(xué)檢測(cè)方法（抗原，抗體，蛋白芯片等）用于肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷。WHO warns against the use of inaccurate

4、 commercial serological tests for pulmonary and extra-pulmonary TB. A substandard test with unreliable results TB can be wrongly diagnosed A serological test for diagnosing active TB disease is bad practice Problems of misdiagnosis The inaccurate serological tests are costly Selling substandard test

5、s with unreliable results8 細(xì)菌學(xué)診斷抗酸染色涂片 分枝桿菌培養(yǎng) 陽(yáng)性率低 含菌量1萬(wàn)/mL痰液 需時(shí)4-6周 9快速培養(yǎng)系統(tǒng)1. BD BACTEC MGIT 960培培養(yǎng)系統(tǒng)養(yǎng)系統(tǒng) 2. BacT ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng) 10分子生物學(xué)診斷實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：HRM 線性探針耐多藥檢測(cè)技術(shù)：HAIN技術(shù) 基因芯片 PCR 電離質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù) 11病理學(xué)檢查病理學(xué)檢查n陽(yáng)性率低n對(duì)取材有較高要求，有創(chuàng)傷n對(duì)肉芽腫性病變需進(jìn)一步鑒別12影像學(xué)檢查n目前診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的重要手段，尤其是粟粒性肺結(jié)核n對(duì)潛伏性結(jié)核診斷價(jià)值不大n對(duì)肺外結(jié)核診斷價(jià)值不大13現(xiàn)有檢

6、測(cè)手段不能滿足臨床要求n假陰性：免疫力低下或HIV人群，新生兒、老弱人群，藥物影響；n假陽(yáng)性：BCG接種人群，其它分支桿菌感染，交叉污染n肺外的結(jié)核感染無(wú)法明確診斷n抗癆治療療效無(wú)法評(píng)價(jià)n無(wú)法排篩結(jié)核感染，造成生物制劑或移植手術(shù)治療后病患免疫力下降，引發(fā)結(jié)核，形成醫(yī)療事故14主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用1521世紀(jì)結(jié)核檢測(cè)的重大突破n -干擾素釋放實(shí)驗(yàn)（IGRAs)被商化（2006年），用于結(jié)核感染的檢測(cè)n將結(jié)核菌特異性抗原加入含受試者的血液標(biāo)本的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵化，如果受試者受到過(guò)MTB感染，那么被結(jié)核菌激活的記憶T細(xì)胞就會(huì)對(duì)這些

7、特異性抗原產(chǎn)生反應(yīng)，發(fā)生增殖分化并釋放-干擾素n通過(guò)定量檢測(cè)-干擾素的釋放水平，來(lái)診斷MTB感染nT-SPOT.TB(結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn))16干擾素檢測(cè)陰性干擾素檢測(cè)陽(yáng)性TB抗原多肽T細(xì)胞活化T細(xì)胞 干擾素17基于基于T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理n結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以結(jié)核感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)以細(xì)胞免疫細(xì)胞免疫為主，結(jié)核感染為主，結(jié)核感染后體內(nèi)長(zhǎng)期存在后體內(nèi)長(zhǎng)期存在抗原特異性的記憶性抗原特異性的記憶性T細(xì)胞細(xì)胞n當(dāng)再次遇到抗原刺激時(shí)，能迅速活化增殖，釋放當(dāng)再次遇到抗原刺激時(shí)，能迅速活化增殖，釋放r r干擾干擾素素nr r干擾素干擾素是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答

8、中最重要是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞因子的細(xì)胞因子18基于基于T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理T-SPOT.TB技術(shù)：技術(shù)：n利用結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞（利用結(jié)核桿菌感染者外周血單核細(xì)胞（PBMC）中存）中存在結(jié)核特異性在結(jié)核特異性T T細(xì)胞細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核特異抗這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核特異抗原刺激后分泌原刺激后分泌r r干擾素而設(shè)計(jì)的干擾素而設(shè)計(jì)的T T細(xì)胞細(xì)胞免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)。n檢測(cè)外周血中受結(jié)核特異抗原刺激釋放檢測(cè)外周血中受結(jié)核特異抗原刺激釋放r r干擾素的干擾素的T T淋淋巴細(xì)胞，經(jīng)巴細(xì)胞，經(jīng)酶聯(lián)免疫顯色酶聯(lián)免疫顯色后，通

9、過(guò)后，通過(guò)ELISPOTELISPOT分析系統(tǒng)分析系統(tǒng) 對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1 1個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出抗原個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出抗原特異性細(xì)胞的頻率。特異性細(xì)胞的頻率。19基于基于T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理包包20基于基于T淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理淋巴細(xì)胞檢測(cè)結(jié)核感染的原理患者體內(nèi)存在針對(duì)MTB的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞患者體內(nèi)不含針對(duì)MTB的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞21T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義nT-SPOT.TB高靈敏度高靈敏度 22T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義種類種類內(nèi)容摘要內(nèi)容摘要受試者數(shù)受試者數(shù)量量文獻(xiàn)發(fā)表文獻(xiàn)發(fā)表活動(dòng)性結(jié)核活動(dòng)性

10、結(jié)核/ /靈靈敏度敏度將將T-SPOT.TB的檢測(cè)結(jié)果與最后通過(guò)涂片和培養(yǎng)確診的結(jié)果進(jìn)的檢測(cè)結(jié)果與最后通過(guò)涂片和培養(yǎng)確診的結(jié)果進(jìn)行比較。包括牛型結(jié)核桿菌和非洲型結(jié)核桿菌感染的患者。行比較。包括牛型結(jié)核桿菌和非洲型結(jié)核桿菌感染的患者。T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為97.2%。（。（CI 90.3-99.7%）72Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis(2005)；24: 529-536在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核受試者中，在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核受試者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為96.6%。其中。其中29例免疫力低下患者，例免疫力低下患者，

11、T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為100%87Lee et al. ERJ 2006; 28:2430在確診病例（涂片或培養(yǎng)陽(yáng)性）和臨床診斷病例（有臨床癥狀在確診病例（涂片或培養(yǎng)陽(yáng)性）和臨床診斷病例（有臨床癥狀和抗癆治療有效）中，和抗癆治療有效）中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為90.3%，并且不，并且不受受CD4細(xì)胞數(shù)量影響。細(xì)胞數(shù)量影響。30Clark et al. Clin. Exp. Imm.2007; 150(2):238-44在經(jīng)痰培養(yǎng)或肺部病變組織病理活檢確診的結(jié)核患者中，在經(jīng)痰培養(yǎng)或肺部病變組織病理活檢確診的結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為92%。

12、140Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65在確診的肺結(jié)核患者和疑似肺外結(jié)核患者中，在確診的肺結(jié)核患者和疑似肺外結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的陽(yáng)的陽(yáng)性率性率94%。32Kim et al. Arch Intern Med.2007; 167;20:2255-2259在免疫力正常和免疫力低下的受試人群中，在免疫力正常和免疫力低下的受試人群中，T-SPOT.TB的靈敏的靈敏度分別為度分別為94%和和95%。所有受試者中，所有受試者中，42%為肺外結(jié)核患者。為肺外結(jié)核患者。186Kim et al. Am J Med 2009；122, 189-195經(jīng)培

13、養(yǎng)確診、抗癆治療不超過(guò)經(jīng)培養(yǎng)確診、抗癆治療不超過(guò)2 2周的結(jié)核患者用周的結(jié)核患者用T-SPOT.TB檢檢測(cè)，陽(yáng)性率測(cè)，陽(yáng)性率98%（57/58）。）。58Janssens et al ERJ 2007；30(4):722-8在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核患者中，在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為94%。32Dominguez et al Clin VaccImmunol 2008; 15;168-71在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核患者中，在經(jīng)培養(yǎng)確診的活動(dòng)性結(jié)核患者中，T-SPOT.TB的靈敏度為的靈敏度為94.1%。270Chee et al J Clin Micro

14、biol.2008; 46(6):1935-4023T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義nT-SPOT.TB高特異性高特異性 ESAT-6CFP 10均來(lái)自結(jié)核分枝桿菌基因組均來(lái)自結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)區(qū)域域 僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（人型、牛型、非洲型）存在僅結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（人型、牛型、非洲型）存在 RD1區(qū)區(qū)基因基因 卡介苗和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌缺失卡介苗和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌缺失RD1區(qū)區(qū)基因基因（M.gordonaeM.gordonae、M.kansasiiM.kansasii、M.marinumM.marinum、M.szulgaiM.szulgai） T-SPOT.TB不會(huì)受卡介

15、苗接種及其他分枝桿菌的影響不會(huì)受卡介苗接種及其他分枝桿菌的影響 24T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義種類種類內(nèi)容摘要內(nèi)容摘要受試者數(shù)受試者數(shù)量量文獻(xiàn)發(fā)表文獻(xiàn)發(fā)表特異性特異性用用T-SPOT.TB檢測(cè)檢測(cè)14例鳥(niǎo)分枝桿菌感染者，例鳥(niǎo)分枝桿菌感染者，13例陰性，例陰性，1例為例為臨界值，復(fù)查也為陰性。臨界值，復(fù)查也為陰性。14Adams et al Sc. J Inf. Dis.2008;40(3):196-203.經(jīng)過(guò)結(jié)核篩查的無(wú)癥狀的受試者，經(jīng)過(guò)結(jié)核篩查的無(wú)癥狀的受試者，T-SPOT.TB檢測(cè)結(jié)果全部為檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，特異性陰性，特異性100%。47Clark et al. Clin

16、. Exp. Imm.2007; 150(2):238-44在德國(guó)用在德國(guó)用T-SPOT.TB對(duì)健康的衛(wèi)生保健工作者進(jìn)行篩查。僅對(duì)健康的衛(wèi)生保健工作者進(jìn)行篩查。僅1例陽(yáng)性例陽(yáng)性（1/95） ，為影像學(xué)工作者，接觸病人超過(guò)，為影像學(xué)工作者，接觸病人超過(guò)35年。年。 TST檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果34% （32/95）。）。 95Barsegian et al. J of Hospital Inf 2008；69(1):69-76在接觸結(jié)核的健康醫(yī)務(wù)工作者和健康對(duì)照受試者中用在接觸結(jié)核的健康醫(yī)務(wù)工作者和健康對(duì)照受試者中用TST和和T-SPOT.TB檢測(cè)。檢測(cè)。155健康醫(yī)務(wù)工作者中，健康醫(yī)務(wù)工

17、作者中，TST陽(yáng)性的陽(yáng)性的27例，而例，而T-SPOT.TB僅僅3例陽(yáng)性。健康對(duì)照組例陽(yáng)性。健康對(duì)照組T-SPOT.TB全部陰性而全部陰性而TST有有3例陽(yáng)性。例陽(yáng)性。 218 Storla et al. BMC Infectious Diseases 2009,9:60 25T-SPOT.TB 的高特異性與靈敏度，給臨床準(zhǔn)確、快速的診斷結(jié)果 特異性美國(guó)FDA臨床研究數(shù)據(jù)：特異性97.1%(297/306)國(guó)內(nèi)臨床研究數(shù)據(jù)：特異性94.1%(478/508) 靈敏度美國(guó)FDA臨床研究數(shù)據(jù)：靈敏度95.6%(175/183)國(guó)內(nèi)臨床研究數(shù)據(jù)：靈敏度95.3%(624/655)26T-SPOT.T

18、B的臨床意義的臨床意義n基于結(jié)核抗原特異性基于結(jié)核抗原特異性T細(xì)胞向病變部位集細(xì)胞向病變部位集中的特點(diǎn)，中的特點(diǎn)， T-SPOT.TB的檢測(cè)物已不局的檢測(cè)物已不局限于靜脈血，支氣管肺泡灌洗液、痰液、限于靜脈血，支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等也可用于對(duì)肺內(nèi)及肺外胸腹水、腦脊液等也可用于對(duì)肺內(nèi)及肺外結(jié)核的診斷。結(jié)核的診斷。n敏感性優(yōu)于敏感性優(yōu)于ADA、TB-DNA，約在，約在62-75%，特異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。，特異性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。27T-SPOT.TB的臨床意義的臨床意義n在結(jié)核病治療中的評(píng)價(jià)意義在結(jié)核病治療中的評(píng)價(jià)意義n效應(yīng)效應(yīng)T細(xì)胞隨結(jié)核桿菌的清除而消失，其陰細(xì)胞隨結(jié)核桿菌的清除而消

19、失，其陰性及陽(yáng)性結(jié)果可作為評(píng)估治療效果的手段之性及陽(yáng)性結(jié)果可作為評(píng)估治療效果的手段之一一 。 28T-SPOT.TB的缺點(diǎn)的缺點(diǎn)n仍有一定的假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果n實(shí)驗(yàn)結(jié)果是對(duì)結(jié)核感染的判斷，陽(yáng)性結(jié)果包括了活動(dòng)性結(jié)核及潛伏性結(jié)核感染的可能，需要結(jié)合臨床來(lái)確診是否是結(jié)核病患者n不能夠提示臨床患者的病變部位，需要結(jié)合臨床來(lái)判斷29主要內(nèi)容n結(jié)核病及其診斷現(xiàn)狀nT-SPOT.TB的原理及其特點(diǎn)nT-SPOT.TB技術(shù)的應(yīng)用30病例1患者，男，35歲 患者于一月前開(kāi)始無(wú)誘因下出現(xiàn)高熱、胸悶，動(dòng)則氣急，無(wú)咳嗽，咯血，盜汗 。 胸片：兩肺（），右側(cè)胸腔積液，心包積液 心超：心包積液 心包穿刺：血性 診斷：腫瘤

20、？結(jié)核？細(xì)菌感染？ 31檢測(cè)結(jié)果外周血T-SPOT.TB：陽(yáng)性 心包積液T-SPOT.TB：陽(yáng)性 診斷：結(jié)核性心包炎 治療： INH、RFP、PZA、EMB、強(qiáng)的松 體會(huì)：診斷快速 心包積液結(jié)核培養(yǎng) 6周后報(bào)陽(yáng) 32病例2患者，女性，60歲，浙江溫州人 主訴：反復(fù)發(fā)熱2月余，頭痛2周伴意識(shí)障礙2天 外院頭顱MRI見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)彌漫性點(diǎn)狀、結(jié)節(jié)狀及環(huán)形病灶。 有皮肌炎史，外院予激素治療 33腰穿壓力250mmH2O，有核細(xì)胞420 x106/L，糖0.6mmol/L，蛋白1688mg/L，氯化物136mmol/L 隱球菌乳膠凝集試驗(yàn)：陰性 34治療：抗細(xì)菌+抗結(jié)核美羅培南、利奈唑胺、異煙肼、利福平、

21、吡嗪酰胺、乙胺丁醇治療，同時(shí)予甘露醇250ml q8h及地塞米松每天7.5mg。 2天后患者體溫即平，意識(shí)障礙好轉(zhuǎn) 腦脊液T-SPOT.TB：陽(yáng)性 診斷：傾向結(jié)核性腦膜腦炎 35五聯(lián)抗結(jié)核給予HRZE及左氧五聯(lián)抗結(jié)核 2周后，CSF分枝桿菌快速培養(yǎng)：陽(yáng)性 3個(gè)月后： 36病例3女性，14歲，初中學(xué)生主訴：發(fā)熱1月余 患者5月初無(wú)明顯誘因下出現(xiàn)發(fā)熱，Tmax：39，以午后為著。伴頭暈、畏寒、盜汗，不伴寒戰(zhàn)、咳嗽、咳痰、四肢肌肉痛、皮疹等，家人自行予退燒藥（具體藥物不詳），體溫可恢復(fù)正常，但午后體溫仍反復(fù) 2013-05-24患者就診，查血常規(guī)示：WBC: 4.7x109/L， N:43.2% 。查尿常規(guī)示：WBC:8-10個(gè)/HP，Pro(+)。考慮為尿路感染，予頭孢丙烯等抗感染治療，但仍出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱，病程中，患者無(wú)尿頻、尿急、尿痛、腹脹、腹痛、腰痛等不適 2013-06-01予?？虅?.5g及羅氏芬2.5g對(duì)癥治療后體溫有所好轉(zhuǎn)，但停藥后體溫仍上升 2013-06-09查肺CT示：左肺上葉炎性病變。增強(qiáng)CT示：左肺上葉