圓二色譜原理與應(yīng)用

1、圓二色譜圓二色譜Circular Dichroism (CD) 原理與應(yīng)用光的性質(zhì)：波粒二象性誕生光的性質(zhì)：波粒二象性誕生 人類對光的研究起源很早，但對光本質(zhì)的認(rèn)識經(jīng)歷了一個較漫長的過程。光究竟是波還是粒子？光的波動說與微粒說之爭從十七世紀(jì)初開始， 其間牛頓、惠更斯、托馬斯楊、菲涅耳、愛因斯坦、波爾等多位著名的科學(xué)家努力揭開了遮蓋在“光的本質(zhì)”外面那層撲朔迷離的面紗，至二十世紀(jì)初以光的波粒 二象性告終，前后共三百多年的時間。粒子性：光是某種粒子即光量子，具有粒子的性質(zhì) 如 反射，散射等現(xiàn)象。 波動性：即光具有波動性，有衍射、干涉等性質(zhì)墨子和他的學(xué)生做了世界上最早的“小孔成像”實驗，并對實驗結(jié)果

2、作出了光沿直線傳播的科學(xué)解釋，并用此原理解釋了物體和投影的關(guān)系。 愛因斯坦提出了光量子論，解釋了光電現(xiàn)象，揭示了微觀客體的波粒二重性 光源發(fā)射光量子從演示中可以看出：光源發(fā)射的單個光量子的運(yùn)動軌跡是一個軌跡為余弦 函數(shù)的簡諧振動 軌跡方程為 xAcos（t）而真實光源向外發(fā)射的是連續(xù)的光量子 如圖所示:圖中不同顏色的小球代表不同的光量子 所有光量子在一個平面上我們稱之為平面偏振光 它的軌跡方程為xAcos（t） 公式中 A為振幅與光強(qiáng)度的平方成正比 為初始相位 t為時間我們平時看到的光為自然光具有我們平時看到的光為自然光具有: 1.方向隨機(jī)性方向隨機(jī)性 自然光源向外發(fā)射方向性是隨機(jī)的光量子 2

3、. 不連續(xù)性不連續(xù)性 會產(chǎn)生無數(shù)初始相位不同的光量子 糖葫蘆z 傳播方向傳播方向 360度旋轉(zhuǎn)的軌跡度旋轉(zhuǎn)的軌跡這兩個性質(zhì)決定自然光具有如圖所示的性質(zhì),既自然光可以看作圓柱形向前傳播的光兩束光的合成兩束光的合成:物理力學(xué)力的矢量合成:F1F3F2物體受到的兩個力F1,F2等同于物體受到這兩個力的矢量合成F3光的合成也遵循矢量合成光的合成也遵循矢量合成:其合成為電場矢量的合成與光強(qiáng)度的平方成正比xytt1t0 t1 t2 t3 t4t0t2t3t4合成平面偏振光圖相互垂直的片面偏振光2-1=0取 t0,t1,t2,t3,t4時間的 截面2-1=pi/2 AX=AY pi=3.141592圓偏振光

4、xy22AA22XY2xAXyAYCOS(22)SIN( )22x=AXcos(Wt+1)y=AYcos(Wt+2)xy22AA22XY2xAXyAYCOS(22)SIN( )22xy如果AX=AY合成軌跡為圓如果AX= AY合成軌跡為橢圓垂直傳播方向下面我們研究以下兩束圓偏振光的合成下面我們研究以下兩束圓偏振光的合成:兩束旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振光如果振幅相同（振幅與光強(qiáng)度的平方成正比）矢量合成為平面偏振光。如果振幅不等則根據(jù)公式合成為下圖右圖所示的橢圓偏振光！xy22AA22XY2xAXyAYCOS(22)SIN( )22圓二色性圓二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶軸垂直晶軸電氣石晶體當(dāng)

5、自然光入射到電氣石晶片的時,晶片強(qiáng)烈地吸收振動平面與晶軸垂直的光波,而只允許振動平面平行與晶軸的光波通過,因此通過晶片的光就變?yōu)榫哂幸欢ㄆ矫娴钠窆? 各向異性的物質(zhì)對不同方向的光吸收不同如圖所示：平面不對稱的分子具有各向異性 如氨基酸核酸、手性分子 也對偏振光有調(diào)節(jié)活性當(dāng)兩束圓偏振光照射到含有這類分子的溶液時:sample solution溶液對左旋和右旋的圓偏振光的吸收不同這會導(dǎo)致EL不等于ER根據(jù)我們前面對振幅不同的兩束圓偏正光的疊加現(xiàn)象可以判斷透過樣品溶液的光變?yōu)橐皇鴻E圓偏振光當(dāng)溶液中的樣品的結(jié)構(gòu)不同,或成分不同我們可以得到不同的橢圓反過來我們可以通過檢測兩束旋轉(zhuǎn)方向相反的圓偏振光透過

6、樣品所產(chǎn)生的橢圓的不同來判斷樣品所含的成分,和結(jié)構(gòu)信息。泰勒一階展開式in proper units (CD spectroscopists use decimol) Per residue2)為了方便比較我們用來描述橢圓的信息度圓二機(jī)器測量值光譜學(xué)家一般采用摩爾橢圓率 和 Deltaepslon大家形成統(tǒng) 一的單位易于比較tan(i0)n2/n1 時i0 被稱為布魯斯特角 此時的反射光為平面偏振光，利用該原理可制造起偏器。n1折射率n2折射率i0平面偏振光折射：折射：雙折射：雙折射：o-raye-ray當(dāng)一束光經(jīng)過各向異性的晶體或其他狀態(tài)的介質(zhì)時產(chǎn)生相互垂直的兩束偏振光 o, e當(dāng)光離開晶體

7、時的2-1=2*pi*l/(n0-ne)*入 四分之一波片四分之一波片 如果l=入/4 /(n0-ne) 則2-1=pi/2 此時如果入射光與光軸夾角為45度 時o,e的振幅相同則o,e合成的為圓偏振光.45deg45deg光軸光軸偏振光的產(chǎn)生:圓二色譜儀器刨面圖M為鏡子,p為起偏器 ls代表等和水晶CD特點 測量的非常小 CD測量的為2.32*(AL-AR) 弧度 以樣品有圓二信號一定要有紫外吸收但有紫外吸收不一定由遠(yuǎn)而信號CD譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用譜在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用The peptide bond is inherently asymmetric & is always opt

8、ically active蛋白質(zhì)分子的固有不對稱性決定了蛋白質(zhì)的光學(xué)活性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)的不同表現(xiàn)出其對圓二色性特征的差異所以我們可以通過圓二信號來測量蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息圖為一些蛋白的(或肽)的標(biāo)準(zhǔn)園二譜圖我們以肌紅蛋白為例 193nm208nm223nm我們從圖中看到了193,208,223特征峰與上一圖中全螺旋的蛋白的特征峰基本相同我們可以從這個信息斷定我們樣品的結(jié)構(gòu)主要為螺旋結(jié)構(gòu)當(dāng)我們得到一個圖譜可以通過下表來和前面提到的標(biāo)準(zhǔn)圖譜來判斷我們樣品的結(jié)構(gòu)信息對于螺旋性較高的蛋白可以通過下式初步估算螺旋的含量: 但是準(zhǔn)確性較差不推薦 chymotrypsin (all b) lysozyme (a

9、+ b) triosephosphate isomerase(a/b) myoglobin (all a)但一般蛋白的結(jié)構(gòu)信息是較復(fù)雜的并非標(biāo)準(zhǔn)的螺旋或折疊之類的結(jié)構(gòu) 對于這些蛋白結(jié)構(gòu)的分析我們要選擇合適的軟件和算法進(jìn)行分析CD譜的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法譜的分析算法很多但是最主要的都是基于最小二乘法:v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.180nm260nmHelixa +v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.sheetb +v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.c=

10、測量的樣品譜v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.Random coila/(a+b+c)=螺旋含量b/(a+b+c)=折疊含量c/(a+b+c)=無規(guī)卷曲含量通過最最小二乘法求解出最優(yōu)a,b,c的值Recommended MethodsFor determination of globular protein conformation in solution: SELCON, CDNN and K2D.For determination of polypeptide conformation: LINCOMB with a suitable polypep

11、tide set of references.For determining the effects of mutation s, ligands and perturbants on protein structure: LINCOMB.For evaluating the number of folding states giving rise to a set of spectra: The CCA algorithm and SVD.The Protein Circular Dichroism DataBank (PCDDB)http:/pcddb.cryst.bbk.ac.uk /

12、On Line Circular Dichroism Analysis http:/public-1.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cca分析 http:/www2.chem.elte.hu/cgi-bin/ccaform061122-5lyxPGDxoLsM6-00園二二級結(jié)構(gòu)分析相關(guān)文獻(xiàn)/sreeram/PDF/index.html下載軟件分析: /cdrwjweb/#InstructionsCdpro分析:定期更新:SELCON3, CDSSTR,and CONTIN CLU

13、STER/sreeram/CDPro/ 從CD譜分析準(zhǔn)確性對全a、 a /b和變性蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確度90-100%對a + b的準(zhǔn)確度為85%對全b的準(zhǔn)確度為75%Applications of CD in structural biologyDetermination of secondary structure of proteins that cannot be crystallised Investigation of the effect of e.g. drug binding on protein secondary structur

14、e Dynamic processes, e.g. protein folding Studies of the effects of environment on protein structure Secondary structure and super-secondary structure of membrane proteins Study of ligand-induced conformational changes Carbohydrate conformation Investigations of protein-protein and protein-nucleic a

15、cid interactions Fold recognition CD實驗要點儀器操作及參數(shù)儀器操作及參數(shù):Nitrogen flushingFlushing the optics with dry nitrogen is a must: Xe lamp has a quartz envelope, so if operated in air itll develop a lot of ozone, harmful for the mirrors below 195nm oxygen will absorb radiation氮氣流量15-20 for 180nm 20 for 95% 所用試劑盡量用光譜純 要確定蛋白的分子量和濃度 防止氣泡干擾 超聲波除氣泡 防止粒子的散射 使用0.02um濾膜對過濾樣品P