基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組蛋白ppt課件

1、從基因到蛋白的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程從基因到蛋白的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程功能蛋白功能蛋白組裝組裝什么是基因工程什么是基因工程 基因工程基因工程(Genetic Engineering)原稱遺傳工原稱遺傳工程。是指在分子程度上將一種或多種生物體程。是指在分子程度上將一種或多種生物體(供體供體)的的DNA片斷目的基因與載體片斷目的基因與載體DNA分子如質(zhì)分子如質(zhì)粒、病毒等在體外進(jìn)展拼接重組粒、病毒等在體外進(jìn)展拼接重組,產(chǎn)生新的自然界產(chǎn)生新的自然界從未有過(guò)的重組從未有過(guò)的重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體分子，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體(受體受體)內(nèi)，使之按照人們的志愿遺傳并表達(dá)出新的內(nèi)，使之按照人們的志愿

2、遺傳并表達(dá)出新的性狀的技術(shù)?；蚬こ逃袝r(shí)也稱為重組性狀的技術(shù)?；蚬こ逃袝r(shí)也稱為重組DNA技術(shù)技術(shù)(DNA Recombination)或分子克隆技術(shù)或分子克隆技術(shù)(Molecular Cloning)。什么是重組蛋白什么是重組蛋白 重組蛋白是指將一種或多種生物體供體的重組蛋白是指將一種或多種生物體供體的基因?qū)肓硪环N生物體受體內(nèi)，使之按照人們基因?qū)肓硪环N生物體受體內(nèi)，使之按照人們的志愿遺傳并表達(dá)出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。的志愿遺傳并表達(dá)出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。n運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組細(xì)胞并經(jīng)過(guò)重組細(xì)胞培運(yùn)用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組細(xì)胞并經(jīng)過(guò)重組細(xì)胞培育，令其超量合成其它生物體內(nèi)含量極微但卻具有育，令其超量合成

3、其它生物體內(nèi)含量極微但卻具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值重組蛋白是現(xiàn)代生物技術(shù)中最活潑的極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值重組蛋白是現(xiàn)代生物技術(shù)中最活潑的研討方向之一，廣泛運(yùn)用于消費(fèi)藥用蛋白質(zhì)及代謝研討方向之一，廣泛運(yùn)用于消費(fèi)藥用蛋白質(zhì)及代謝工程等領(lǐng)域。工程等領(lǐng)域。n曾經(jīng)投放市場(chǎng)并正在研制開(kāi)發(fā)的重組蛋白藥物幾乎曾經(jīng)投放市場(chǎng)并正在研制開(kāi)發(fā)的重組蛋白藥物幾乎觸及到醫(yī)藥的各個(gè)領(lǐng)域，包括各種抗病毒劑、抗癌觸及到醫(yī)藥的各個(gè)領(lǐng)域，包括各種抗病毒劑、抗癌因子、抗因子、抗AIDS藥物、新型抗生素、重組疫苗、重組藥物、新型抗生素、重組疫苗、重組生長(zhǎng)激素、重組干擾素、重組抗體、免疫輔助劑、生長(zhǎng)激素、重組干擾素、重組抗體、免疫輔助劑、抗衰老保健品、心腦

4、血管防護(hù)急救藥、生長(zhǎng)因子以抗衰老保健品、心腦血管防護(hù)急救藥、生長(zhǎng)因子以及診斷試劑等。及診斷試劑等。 重組蛋白的消費(fèi)包括重組蛋白的消費(fèi)包括 上游技術(shù)和下游技上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是外源基因術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是外源基因重組、克隆和表達(dá)載體以及基因工程菌細(xì)重組、克隆和表達(dá)載體以及基因工程菌細(xì)胞的設(shè)計(jì)與構(gòu)建；而下游技術(shù)那么涉及到胞的設(shè)計(jì)與構(gòu)建；而下游技術(shù)那么涉及到含有重組外源基因的生物細(xì)胞基因工程菌含有重組外源基因的生物細(xì)胞基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培育以及外源基因表達(dá)的或細(xì)胞的大規(guī)模培育以及外源基因表達(dá)的重組蛋白的分別純化過(guò)程。重組蛋白的分別純化過(guò)程。 重組蛋白的整個(gè)過(guò)

5、程由工程菌重組蛋白的整個(gè)過(guò)程由工程菌(細(xì)胞細(xì)胞)的設(shè)計(jì)構(gòu)建上游技的設(shè)計(jì)構(gòu)建上游技術(shù)和基因產(chǎn)物重組蛋白的消費(fèi)下游技術(shù)兩大部分術(shù)和基因產(chǎn)物重組蛋白的消費(fèi)下游技術(shù)兩大部分組成，前者的單元操作過(guò)程如下組成，前者的單元操作過(guò)程如下: (1) 從供體細(xì)胞中分別出基因組從供體細(xì)胞中分別出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源別將外源DNA(包括外源基因或目的基因包括外源基因或目的基因)和載體分子切開(kāi)和載體分子切開(kāi)(簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱切稱切); (2) 用用DNA銜接酶將含有外源基因的銜接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子片段接到載體分子上，構(gòu)成上，構(gòu)成DNA重組分子重組分子(簡(jiǎn)稱接簡(jiǎn)稱接

6、); (3) 借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中(簡(jiǎn)簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)稱轉(zhuǎn)); (4) 短時(shí)間培育轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增短時(shí)間培育轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中受體細(xì)胞的基因組中(簡(jiǎn)稱增簡(jiǎn)稱增); (5) 挑選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的挑選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞基因工程菌或細(xì)胞(簡(jiǎn)稱檢簡(jiǎn)稱檢)。 由此可見(jiàn)，基因工程的上游操作過(guò)程可簡(jiǎn)化為由此可見(jiàn)，基因工程的上游操作過(guò)程可簡(jiǎn)化為:切、接、轉(zhuǎn)切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。、增、檢。nThe DNA containin

7、g the gene must be isolated away from its genomic contextnThat should be simple but there are big problemsGene of interestCloning can supply large quantities of recombinant DNASingle bacterium transformed with single copy of plasmid which is subsequently replicatedGrowth to a colonyProvides several

8、mg of recombinant DNAProvides several mg of recombinant DNAInoculate into liquid broth重組蛋白表達(dá)的典型穿越載體。重組蛋白表達(dá)的典型穿越載體。MCS = 多克隆位點(diǎn)；多克隆位點(diǎn)；Op = 細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)；細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)； Mp = 細(xì)菌中的選擇性基因；細(xì)菌中的選擇性基因；ME = 真核生物中的選擇性基因；真核生物中的選擇性基因； OE = 真核復(fù)制起始位點(diǎn)；真核復(fù)制起始位點(diǎn)；PE = 真核啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子；TE = 真核中止子；真核中止子；hG = 表達(dá)的外源基因。表達(dá)的外源基因。重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)重組

9、蛋白的表達(dá)系統(tǒng) 所謂重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，是指消費(fèi)重組蛋白所謂重組蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，是指消費(fèi)重組蛋白的基因工程宿主菌或宿主細(xì)胞。的基因工程宿主菌或宿主細(xì)胞。 目前常用的表達(dá)系統(tǒng)宿主要有原核的細(xì)菌主目前常用的表達(dá)系統(tǒng)宿主要有原核的細(xì)菌主要是大腸桿菌，要是大腸桿菌，E. Coli.和真核的酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)和真核的酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞系以及近年開(kāi)展起來(lái)的盤(pán)基網(wǎng)柄菌系胞、動(dòng)物細(xì)胞系以及近年開(kāi)展起來(lái)的盤(pán)基網(wǎng)柄菌系統(tǒng)。統(tǒng)。1、原核生物表達(dá)系統(tǒng)細(xì)菌 (E. coli.)2、真核生物表達(dá)系統(tǒng)酵母菌(Yeast)3、動(dòng)物細(xì)胞4、昆蟲(chóng)細(xì)胞4、新型真核表達(dá)系統(tǒng)盤(pán)基網(wǎng)柄菌 盤(pán)基網(wǎng)柄菌盤(pán)基網(wǎng)柄菌(Dictyosteli

10、um discoideum)屬于真屬于真菌界的粘菌亞界的聚粘霉綱菌界的粘菌亞界的聚粘霉綱(Acrasiomzcetes)。1869年真菌學(xué)家年真菌學(xué)家Oskar Brefeld初次描畫(huà)了盤(pán)基網(wǎng)柄初次描畫(huà)了盤(pán)基網(wǎng)柄菌。盤(pán)基網(wǎng)柄菌屬菌。盤(pán)基網(wǎng)柄菌屬D. discoideum由由Raper 1935年年發(fā)現(xiàn)。在自然界中發(fā)現(xiàn)。在自然界中D. discoideum 經(jīng)過(guò)吞噬土壤外經(jīng)過(guò)吞噬土壤外表的細(xì)菌攝取營(yíng)養(yǎng)和繁衍。表的細(xì)菌攝取營(yíng)養(yǎng)和繁衍。生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)階段 (growth phase)重組基因工程菌的高密度培育重組基因工程菌的高密度培育n培育基組成的優(yōu)化培育基組成的優(yōu)化n 流加流加n固定化固定化n罐流床

11、罐流床n微過(guò)濾微過(guò)濾 下下 游游培育基組成的優(yōu)化培育基組成的優(yōu)化碳源種類(lèi)的選擇碳源種類(lèi)的選擇下游：培育基組成的優(yōu)化下游：培育基組成的優(yōu)化2L發(fā)酵罐中流加培育盤(pán)基網(wǎng)柄菌消費(fèi)發(fā)酵罐中流加培育盤(pán)基網(wǎng)柄菌消費(fèi)hFasL基因工程菌的固定化培育基因工程菌的固定化培育n將基因工程菌固定在多孔載體上，可提高菌體將基因工程菌固定在多孔載體上，可提高菌體密度，實(shí)現(xiàn)延續(xù)發(fā)酵，為利用其消費(fèi)異源蛋白密度，實(shí)現(xiàn)延續(xù)發(fā)酵，為利用其消費(fèi)異源蛋白提供了有效途徑。提供了有效途徑。n多孔載體：多孔陶瓷、浮石、片狀硅膠泡沫和多孔載體：多孔陶瓷、浮石、片狀硅膠泡沫和柱狀硅膠泡沫等。柱狀硅膠泡沫等。固定化培育基因工程菌細(xì)胞固定化培育基因

12、工程菌細(xì)胞載體外表和內(nèi)部的細(xì)胞固定化電鏡掃描照片載體外表和內(nèi)部的細(xì)胞固定化電鏡掃描照片多孔陶瓷多孔陶瓷浮石浮石生物微膠囊固定化生物微膠囊固定化經(jīng)過(guò)一層半透膜圍成的微囊將細(xì)胞包埋，使目的蛋白細(xì)胞留在微囊經(jīng)過(guò)一層半透膜圍成的微囊將細(xì)胞包埋，使目的蛋白細(xì)胞留在微囊中，而培育基營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)胞分泌的小分子物質(zhì)可以自在出入。中，而培育基營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)胞分泌的小分子物質(zhì)可以自在出入。羧甲基纖維素鈉海藻酸鈣羧甲基纖維素鈉海藻酸鈣 CMCALG體系體系罐流床反響器延續(xù)培育固定化細(xì)胞罐流床反響器延續(xù)培育固定化細(xì)胞NoImageair inair humidifierair outproductreservoirtr

13、icklebedrecirculationpumpfeedreservoir利用微過(guò)濾實(shí)現(xiàn)工程菌高密度培育利用微過(guò)濾實(shí)現(xiàn)工程菌高密度培育airreactormediumfiltrateCross-flow-Filter 采用新型陶瓷等微過(guò)濾模塊采用新型陶瓷等微過(guò)濾模塊, ,使之使之既能截流細(xì)胞既能截流細(xì)胞, ,又能分別限制細(xì)胞又能分別限制細(xì)胞密度的自分泌因子等抑制物密度的自分泌因子等抑制物, ,從而從而提高細(xì)胞密度及目的蛋白的產(chǎn)量提高細(xì)胞密度及目的蛋白的產(chǎn)量重組蛋白的分別純化下游技術(shù)n預(yù)處置及固液分別技術(shù)n 細(xì)胞破碎n 重組蛋白的包涵體處置技術(shù)n 離心n 膜分別技術(shù)n 雙水相萃取n 反膠束提取純化技術(shù)n 超臨界萃取技術(shù)n吸附色譜分別技術(shù)吸附色譜分別技術(shù)n 活性炭活性炭n 氧化鋁氧化鋁n 硅膠硅膠n 滑石粉滑石粉n 硅藻土硅藻土n 大網(wǎng)格聚合物吸附大網(wǎng)格聚合物吸附n固相析出分別法固相析出分別法n 鹽析法鹽析法n 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法n 等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)沉淀n 其它沉淀法其它沉淀法n 水溶性非離子型聚合物沉淀劑水溶性非離子型聚合物沉淀劑n 金屬離子和絡(luò)合物沉淀金屬離子和絡(luò)合物沉淀n 離子型多聚物沉淀劑離子型多聚物沉淀劑n