功能基因組學(xué)

1、功能基因組學(xué)李家大李家大遺傳疾病遺傳疾病基因鑒定基因鑒定模型建立模型建立基因功能研究基因功能研究治療治療/ /診斷診斷1953年,Watson & Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。2003年4月14日，國際人類基因組宣布：人類基因組列圖-“完成圖”提前繪制成功。人類基因組計(jì)劃的信息 人類基因組大小約為2.9-3.2 Gb； 人類基因組中編碼蛋白的序列不足5%； 人類基因組中有大約30，000個功能基因（即編碼蛋白質(zhì)）； 其中將近40%的基因功能尚不清楚。功能基因組學(xué)就是動態(tài)的來研究基因的轉(zhuǎn)錄，翻譯以及蛋白蛋白之間的相互作用。I：轉(zhuǎn)錄水平RNA表達(dá)水平的研究 基因芯片 定量PCR 差異顯示P

2、CR 原位雜交 Northern印跡DNA array/gene chip基因芯片Real-time Quantitative PCR（qPCR，實(shí)時定量PCR）PCR-Polymerase Chain ReactionExponentialLinearPlateauTaqman probe vs. SYBR Green dyeCt: Cycle thresholdData analysis原位雜交In situ hybridization利用標(biāo)記的特定RNA做為探針，與細(xì)胞或組織切片中的mRNA進(jìn)行雜交，從而對特定基因進(jìn)行精確定量定位的過程。原位雜交II：轉(zhuǎn)錄后調(diào)控RNAi (RNA int

3、erference)microRNA (miRNA)siRNA (small interfering RNA)MicroRNA的發(fā)現(xiàn) MicroRNA (miRNA) 是小的非編碼RNA（21-23nt)，它在翻譯水平上來調(diào)節(jié)真核基因的表達(dá)。 Victor Ambros 在1993年研究線蟲發(fā)育時序時發(fā)現(xiàn)來Lin-4 miRNA,它控制著線蟲從L1期到L2期的轉(zhuǎn)化。miRNA Processing and Activity RISC: RNA-induced silencing complex siRNA (small interfering RNA)Andrew FireCraig C Me

4、llocontrolprogeny of injected wormunc-22 dsRNAGene silencing by dsRNA less mRNA, less protein = gene silencingSiRNA mechanism in C.elegans: basic schememiRNA和siRNA的差異miRNA來自長的單鏈RNA，而siRNA來自長的雙鏈RNA；miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)，但是siRNA完全互補(bǔ)；miRNA與靶mRNA結(jié)合，抑制其翻譯；siRNA與靶mRNA結(jié)合造成其降解；miRNA往往可以抑制許多序列相似的mRNA的翻譯，但是siRNA只造

5、成特定基因的降解。RNAi的應(yīng)用基礎(chǔ)研究：降低基因表達(dá)(Gene knockdown)臨床應(yīng)用 抗腫瘤、抗病毒.III：蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)是生物活動的主要執(zhí)行者結(jié)構(gòu)蛋白酶激素神經(jīng)遞質(zhì)受體抗體轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)研究手段 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE)； 雙向電泳（等電聚焦+SDS-PAGE)； 質(zhì)譜； Western印跡； 免疫組化； SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳可以根據(jù)電荷和分子質(zhì)量的差異來分離蛋白質(zhì)。當(dāng)陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,簡稱SDS)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)分子即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然

6、蛋白質(zhì)分子間的電荷差別降低乃至消除。同時，蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨向一致，所以各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳時的泳動率差異，就反映了分子質(zhì)量的不同。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳，利用等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)。(水平，X-軸）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：利用分子量大小不同分離蛋白質(zhì)。（垂直，Y-軸）二維 (Two dimensional) 凝膠電泳二維 凝膠電泳等電點(diǎn)由低到高分子量由高到低 質(zhì)譜，顧名思義就是可以測量物質(zhì)質(zhì)量的儀器。蛋白質(zhì)或者蛋白酶降解的多肽片段可以通過質(zhì)譜儀繪制出各組分的分子量圖譜，然后對比數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)或其降解肽段的質(zhì)量，從而推算被測定蛋白質(zhì)的身份(iden

7、tity)。質(zhì)譜技術(shù)二維電泳和質(zhì)譜結(jié)合分析蛋白質(zhì)功能示意圖Western 印跡目的蛋白一抗酶標(biāo)的二抗免疫組化Immnuohistochemistry免疫組化IV：蛋白質(zhì)相互作用研究一個蛋白質(zhì)與一些已知蛋白質(zhì)之間的相互作用，可以推斷該蛋白質(zhì)的生理生化功能。研究蛋白質(zhì)相互作用的方法主要有： 親和層析 Co-Immunoprecipitation Yeast Two-hybrid Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Surface Plasmon Resonance (SPR)親和層析將目標(biāo)蛋白固定在親和層析介質(zhì)上(如Sepharose 4B)

8、，讓細(xì)胞蛋白通過層析柱，與目標(biāo)蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)被留在層析柱上，然后洗脫下來，用質(zhì)譜分析等方法進(jìn)行鑒定。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)利用抗原和抗體間的反應(yīng)特異性，用抗體將目標(biāo)蛋白以及與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì)共同沉淀下來的方法。免疫共沉淀 酵母雙雜交系統(tǒng)是在1989年由紐約州立大學(xué)的Stanley Fields等初步提出并建立的，是在釀酒酵母中研究蛋白質(zhì)之間相互作用的一種非常有效的分子生物學(xué)方法。將相互作用的兩個蛋白質(zhì)分別與轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域 (DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活域(Activation domain)融合，在酵母細(xì)胞中

9、通過報告基因的表達(dá)情況反映兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交原理酵母雙雜交篩選Surface Plasmon Resonance (SPR，表面等離子體共振)One interaction partner (Y) is bound to the metal film while the other (red balls) partner Is injected over the surface.Amount of bound protein is quantified based upon angle of reflected light.Real time association and dissociation of a protein-protein interaction can be quantified.Surface Plasmon Resonance (SPR)Frster/Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET) A non-radiative, dipole-dipole coupling process, transfer energy from an excited donor fluorophore to an acceptor fluorophore in very close p