基因工程操作程序2

1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不序列，雖不能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，如啟動(dòng)子、終止子等序列，如啟動(dòng)子、終止子等第1頁/共35頁原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) RNA聚合酶的作用是催化DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。它能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，

2、RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。第2頁/共35頁真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)與原核細(xì)胞比較，真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)是： 編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的。也就是說，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列被不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列分隔開來，成為一種斷裂的形式。 其中，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子，一般不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子。第3頁/共35頁真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞基因編碼區(qū)（間隔、不連續(xù)）外顯子：能編碼蛋白質(zhì)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的的DNA序列序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的質(zhì)的DNA序列序列非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟

3、非編碼區(qū)：與原核生物具有相似功能的啟動(dòng)子、終止子動(dòng)子、終止子第4頁/共35頁原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)不同點(diǎn)編碼區(qū)是編碼區(qū)是連續(xù)的連續(xù)的編碼區(qū)是間隔編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的的、不連續(xù)的相同點(diǎn)相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編都由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非碼區(qū)和具有調(diào)控作用的非編碼區(qū)組成的編碼區(qū)組成的第5頁/共35頁基因的種類基因的種類（1）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和）編碼蛋白質(zhì)的基因：包括結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因。調(diào)節(jié)基因。（2）沒有轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因：如）沒有轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的基因：如rRNA基因基因和和tRNA基因?；?/p>

4、因。（3）不能轉(zhuǎn)錄的）不能轉(zhuǎn)錄的DNA片段：如操縱基因。片段：如操縱基因。第6頁/共35頁啟動(dòng)子與終止子啟動(dòng)子與終止子 啟動(dòng)子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能引導(dǎo)RNA聚合酶與正確的基因部位結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄從起點(diǎn)開始，沿編碼區(qū)進(jìn)行。 終止子是在非編碼區(qū)內(nèi)緊靠轉(zhuǎn)錄終點(diǎn)，調(diào)控遺傳信息表達(dá)的脫氧核苷酸序列，它能阻礙RNA聚合酶的移動(dòng)，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。第7頁/共35頁基因工程的基本操作流程基因工程的基本操作流程第8頁/共35頁基因組文庫和部分基因文庫基因組文庫和部分基因文庫基因組文庫部分基因文庫第9頁/共35頁基因組文庫和部分基因文庫基因組文庫

5、和部分基因文庫第10頁/共35頁cDNA合成過程合成過程 第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。 第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。 第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。 第11頁/共35頁利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因原理:DNA雙鏈復(fù)制前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。第12頁/共35頁獲取目的基因獲取目的基因從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成第13頁/共35頁構(gòu)建表達(dá)載體

6、構(gòu)建表達(dá)載體表達(dá)載體的組成1. 目的基因2. 啟動(dòng)子3. 終止子4. 標(biāo)記基因第14頁/共35頁基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些因素 （1）基因的特點(diǎn)：如果一個(gè)來自動(dòng)物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閯?dòng)物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動(dòng)物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如果是一個(gè)糖蛋白，那么該基因在原核生物細(xì)菌中表達(dá)出來的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細(xì)菌無這些細(xì)胞器。（2）要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有強(qiáng)有弱，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因

7、產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個(gè)組織表達(dá)，如只在植物種子中表達(dá)，就要選擇種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。（3）要有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物。 第15頁/共35頁轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化: :目的基因目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和穩(wěn)定和表達(dá)表達(dá)的過程。的過程。3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞受體細(xì)胞種類受體細(xì)胞種類方法方法植物細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（雙子葉植物、裸子植物）基因槍法（單子葉植物）花粉管通道法顯微注射技術(shù)：目的基因表達(dá)載體提純 取卵（受精卵）顯微注射受精卵發(fā)育新性狀動(dòng)物用CaCa2+2+

8、處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNADNA分子第16頁/共35頁將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（植物細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（植物細(xì)胞）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第17頁/共35頁思考：根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出不能導(dǎo)入單子葉植物的原因嗎?若將一個(gè)抗病基因?qū)胄←溨?理論上講你應(yīng)該怎樣做?要選擇要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；菌菌株都可以侵染單子葉植物；要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷

9、部位靠攏（趨化目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。上。第18頁/共35頁 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆螅ǚ坌纬傻幕ǚ酃苓€未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。第19頁/共35頁將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（動(dòng)物細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（動(dòng)物細(xì)胞） 顯微注射法第20頁/共35頁將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（微生物細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（微生物細(xì)胞） C

10、a2+處理第21頁/共35頁四、目的基因的檢測與鑒定1、檢測與鑒定的目的目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性檢測目的基因是否插入了轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上2、檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)另外：個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定第22頁/共35頁知識(shí)延伸知識(shí)延伸DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈該方法是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，把互補(bǔ)的雙鏈DNA解開，把單股的解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化小片段用同位素、熒光分子或化學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的學(xué)發(fā)光催化劑等進(jìn)行標(biāo)記，之后同被檢測的DNA中

11、的中的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的同源互補(bǔ)序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。或基因。第23頁/共35頁思考：檢測mRNA 是否合成，可以用分子雜交的方法嗎？#檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交#個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定第24頁/共35頁歸納歸納: 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1.1.獲取目的基因u從基因文庫u利用PCRPCRu化學(xué)方法人工合成2.2.構(gòu)建基因表達(dá)載體u目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因3.3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞u農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.4.目的基因的檢測與鑒定u檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯第25頁/共35頁第26頁/共35頁基因操作的基本

12、步驟基因操作的基本步驟第27頁/共35頁基因操作的基本步驟基因操作的基本步驟第28頁/共35頁原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞基因編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)（編碼序列）：能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)合成，即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和非編碼區(qū)（調(diào)控序列）：位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的編碼區(qū)下游的DNA序列，雖不序列，雖不能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但能指導(dǎo)有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，但有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，如啟動(dòng)子、終止子等序列，如啟動(dòng)子、終止子等第29頁/共35頁基因組文庫和部分基因文庫基因組文庫和部分基因文庫第30頁/共35頁獲取目的基因獲取目的基因從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成第31頁/共35頁獲取目的基因獲取目的基因從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成第32頁/共35頁四、目的基因的檢測與鑒定1、檢測