高效液相色譜-03

1、2022-5-9第第第第第第七七七七七七章章章章章章液相色譜分析法液相色譜分析法液相色譜分析法液相色譜分析法液相色譜分析法液相色譜分析法一、一、液相色譜固定相液相色譜固定相stationary phase of HPLC二、液相色譜流動相二、液相色譜流動相 mobile phase of HPLC第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)第三節(jié)液相色譜的固定相與液相色譜的固定相與液相色譜的固定相與液相色譜的固定相與液相色譜的固定相與液相色譜的固定相與流動相流動相流動相流動相流動相流動相high performance liquid chromatographstationary phase and mob

2、ile phase of HPLC2022-5-9一、液相色譜固定相一、液相色譜固定相一、液相色譜固定相一、液相色譜固定相一、液相色譜固定相一、液相色譜固定相 stationary phases of LCstationary phases of LCstationary phases of LC （一）. . 液液- -液分配及離子對分離固定相液分配及離子對分離固定相 （1）全多孔型擔體）全多孔型擔體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見； 現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料； （2）表面多孔型擔體）表面多孔型擔體 （

3、薄殼型微珠擔體） 3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；2022-5-9（3 3 3）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型：硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型：硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型：硅氮鍵型： SiN2022-5-9 用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液的官能團鍵合在載體用化學(xué)反應(yīng)的方法將固

4、定液的官能團鍵合在載體( (硅硅膠膠) )表面上，所形成的固定相，稱為化學(xué)鍵合相。表面上，所形成的固定相，稱為化學(xué)鍵合相。具具有分配和吸附作用有分配和吸附作用。優(yōu)點：。優(yōu)點：使用過程不易流失；使用過程不易流失；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在pH28的溶液不變質(zhì)；的溶液不變質(zhì)；熱穩(wěn)定性好，一般在熱穩(wěn)定性好，一般在70以下穩(wěn)定；以下穩(wěn)定；載樣量大，比硅膠高約一個數(shù)量級；載樣量大，比硅膠高約一個數(shù)量級；適于作梯度洗脫。適于作梯度洗脫。化學(xué)鍵合相2022-5-9 化學(xué)鍵合相一般用硅膠作載體，具有分配作用和一化學(xué)鍵合相一般用硅膠作載體，具有分配作用和一定的吸附作用。吸附作用的大小視鍵合覆蓋率而定。定的

5、吸附作用。吸附作用的大小視鍵合覆蓋率而定。用化學(xué)反應(yīng)方法將載體表面上殘存的硅醇基除去，用化學(xué)反應(yīng)方法將載體表面上殘存的硅醇基除去，稱為封尾稱為封尾( (封頂或遮蓋封頂或遮蓋) )，所形成的鍵合相稱為封尾，所形成的鍵合相稱為封尾鍵合相，完全封尾的鍵合相無吸附作用，缺點是疏鍵合相，完全封尾的鍵合相無吸附作用，缺點是疏水強。水強。 按極性分類：非極性、中等極性、極性鍵合相按極性分類：非極性、中等極性、極性鍵合相3類類化學(xué)鍵合相2022-5-9化學(xué)鍵合相1. 非極性鍵合相：十八烷基硅烷鍵合相(ODS)是最常用的非極性鍵合相。2. 中等極性鍵合相：常見的有醚基鍵合相。3. 極性鍵合相：強極性氨基鍵合相(

6、分析糖類)；中強極性氰基鍵合相。SiOOOHSiSiOOOHOH+SiClClClC18H37SiOOOSiSiOOOOSiC18H372022-5-9 （二）（二）（二）（二）（二）（二）. . . . . .液液液液液液- - - - - -固吸附分離固定相固吸附分離固定相固吸附分離固定相固吸附分離固定相固吸附分離固定相固吸附分離固定相 種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：粒度：510 m； 2022-5-91.硅膠 無定形多孔硅膠，國產(chǎn)代號YWG，dp510m 球形全多孔硅膠，國產(chǎn)代

7、號YQG ，dp310m 堆積硅珠，國產(chǎn)代號YQG ，dp35m2.氧化鋁球形(510m)；無定形(510m)。3.高分子微孔多球(有機膠) 國產(chǎn)YSG系列；日立3010膠等。4.其它分子篩；聚酰胺等。液固色譜固定相2022-5-9（三）（三）（三）（三）（三）（三）. . . . . .離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相離子交換色譜分離固定相 結(jié)構(gòu)類別：結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅

8、膠鍵合型（鍵合離子交換基團） 樹脂類別：樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強酸陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強堿陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）性、弱堿性）2022-5-9 （四）（四）（四）（四）（四）（四）. . . . . . 空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑

9、（3）硬質(zhì)凝膠）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2022-5-9( ( (五五五) ) )色譜柱色譜柱色譜柱- - -結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 色譜柱是實現(xiàn)分離的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。 色譜填料： 經(jīng)過制備處理后，用于填充色譜柱的物質(zhì)顆粒，通常是5-10粒徑的球形顆粒。 色譜柱管： 內(nèi)部拋光的不銹鋼管。典型的液相色譜分析柱尺寸是內(nèi)徑4.6mm，長250mm。 色譜柱： 也稱固定相，是將色譜填料填充到色譜柱管中所構(gòu)成的

10、,其結(jié)構(gòu)如圖所示。2022-5-9( ( (五五五) ) )色譜柱色譜柱色譜柱- - -色譜柱裝填色譜柱裝填色譜柱裝填 干法填充： 在硬臺面上鋪上軟墊，將空柱管上端打開垂直放在軟墊上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直臺面墩10-20次。 濕法填充： 又稱淤漿填充法，使用專門的填充裝置（圖8-9）。2022-5-9( ( (五五五) ) )色譜柱色譜柱色譜柱- - -使用和維護使用和維護使用和維護色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。 一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在

11、柱頭的雜質(zhì)。否則 反沖會迅速降低柱效。選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對樣品進行預(yù)處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。 保存色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M行清洗；另一種可能是大分子進入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。2022-5-9( ( (五五五) ) )色譜柱色譜柱色譜柱- - -填料的結(jié)構(gòu)填料的結(jié)構(gòu)填

12、料的結(jié)構(gòu)色譜填料是由基質(zhì)和功能層兩部分構(gòu)成?；|(zhì)： 又常稱作載體或擔體，通常制備成數(shù)微米至數(shù)十微米粒徑的球形顆粒，它具有一定的剛性，能承受一定的壓力，對分離不起明顯的作用，只是作為功能基團的載體。常用來作基質(zhì)的有硅膠和有機高分子聚合物微球。功能層： 是通過化學(xué)或物理的方法固定在基質(zhì)表面的、對樣品分子的保留起實質(zhì)作用的有機分子或功能團。如圖8-10是硅膠基質(zhì)的冠醚大分子固定相的結(jié)構(gòu)示意圖，功能層冠醚分子吸附或鍵合在硅膠基質(zhì)的表面。2022-5-9( ( (五五五) ) )色譜柱色譜柱色譜柱- - -填料的結(jié)構(gòu)填料的結(jié)構(gòu)填料的結(jié)構(gòu)4.264.264.26 填料的物理結(jié)構(gòu)： 分為微孔型（或凝膠型）、

13、大孔型（全多孔型）、薄殼型和表面多孔型四種類型，如圖8-11所示。2022-5-9二、液相色譜的流動相二、液相色譜的流動相二、液相色譜的流動相二、液相色譜的流動相二、液相色譜的流動相二、液相色譜的流動相 mobile phases of LCmobile phases of LCmobile phases of LC 1. 1. 流動相特性流動相特性 （1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，

14、則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 2022-5-92. 2. 2. 2. 2. 2. 流動相類別流動相類別流動相類別流動相類別流動相類別流動相類別 按流動相組成分按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。2022-5-93. 3. 3.流動相的選擇流動相的選擇流動相的選擇 樣品易溶，且溶解度盡可能大

15、。 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不損壞柱子。 不妨礙檢測器檢測，紫外波長處無吸收。 粘度低，流動性好。 易于從其中回收樣品。 無毒或低毒，易于操作。 易于制成高純度，即色譜純。 廢液易處理，不污染環(huán)境。2022-5-93. 3. 3. 3. 3. 3. 流動相選擇流動相選擇流動相選擇流動相選擇流動相選擇流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲

16、酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)2022-5-94. 4. 4. 4. 4. 4. 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，

17、防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2022-5-95 分離方程式 依據(jù)分離方程式討論溶劑系統(tǒng)對分離度的影響 分離度受三項因素左右：a項由色譜柱的質(zhì)量決定；b、c兩項由流動相決定。相對保留值r與容量因子k雖然相互關(guān)聯(lián)，但溶劑的種類主要改變r。這是因為溶劑的種類不同，分子間的作用力的性質(zhì)、強度不同，選擇性不同。在溶劑種類確定以后，配比的調(diào)整只是改變極性，改變洗脫能力，改變保留時間，而分子間作用力的性質(zhì)不變 ，因此主要是改變?nèi)萘恳蜃觡。概括為：溶劑種類主要影響相對保留值r(主要改變峰間距)，溶劑配比主要影響容量因子k(主要改變保

18、留時間)。c b a 11422kkrrnR2022-5-9 組分的分配系數(shù)，由樣品組分、溶劑、固定相三者間的作用力(分子間作用力)綜合作用所決定(表7-2) Snyder選用了乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲苯3個參考物，用于檢驗3種分子間作用力，分別用Xe、Xd、Xn表述。測定、計算出溶劑的極性參數(shù)P值列于表73。P值大者，極性大，洗脫能力大。表7-2 參考物與被檢溶劑的作用力關(guān)系參考物乙醇(質(zhì)子給予體)二氧六環(huán)(質(zhì)子受體)硝基甲烷(強偶極)被檢溶劑的作用力類型質(zhì)子受體作用力(Xe)質(zhì)子給予作用力(Xd)強偶極作用力(Xn)6 Snyder溶劑分類2022-5-9表7-3 常用溶劑的極性參數(shù)與分子間

19、作用力溶劑 PXeXdXn苯2.70.230.320.45乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53正丙烷4.00.530.210.26四氫呋喃4.00.380.200.42氯仿4.10.250.410.33乙醇4.30.520.190.29乙酸乙酯4.40.340.230.43丙酮5.10.350.230.42甲醇5.10.480.220.31乙腈5.80.310.270.42乙酸6.00.390.310.30水10.20.370.370.25。，正己烷注：正戊烷1 . 00 . 0PPP2022-5-91. 正相洗脫 用極性小于固定相的流動相的洗脫方式，稱為正

20、相洗脫、正相展開。適用于正相色譜法。例如，水、正己烷、正戊烷的值分別為10.2、0.1、0.0，作正相洗脫時，水洗脫能力最強，正己烷和正戊烷的洗脫能力最弱。2.反相洗脫 與正相洗脫相反6 正相洗脫與反相洗脫2022-5-91. 等度洗脫(isocratic elution) 用恒定配比的溶劑系統(tǒng)的洗脫方式，稱為等度洗脫 優(yōu)點：簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生。 缺點：對于成分復(fù)雜的樣品，效果欠佳。2. 梯度洗脫(gradient elution) 梯度洗脫就是在分離過程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH值、離子強度相應(yīng)地變化，達到提高分

21、離效果、縮短分析時間的目的。7 洗脫方式2022-5-97 洗脫方式o 梯度洗脫的實質(zhì)：是通過不斷地變化流動相的濃度配比，來調(diào)整混合樣品中各組分的K值，使所有譜帶都以最佳平均K值通過色譜柱。o 比較梯度洗脫與程序升溫：在梯度洗脫中溶質(zhì)K值的變化是通過溶劑的極性、pH值和離子強度來實現(xiàn)的，用于分離組分性質(zhì)差別較大的復(fù)雜樣品用于分離組分性質(zhì)差別較大的復(fù)雜樣品；而程序升溫是借改變溫度來影響溶質(zhì)的K值，用于分用于分離寬沸程的混合樣品離寬沸程的混合樣品。p 優(yōu)點：縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形，很少拖尾；增加檢測靈敏度。2022-5-9 高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對

22、組分的競爭。流動相溶劑的選擇將直接影響組分的分離度.1. 基本要求 溶劑必須具有合適的極性和良好的選擇性(相對于待測樣品)，參閱Snyder溶劑分類； 溶劑要與檢測器匹配，對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測波長比溶劑的紫外截止波長要長；溶劑名稱紫外截止波長/nm正己烷190二硫化碳380四氯化碳265苯210氯仿245二氯甲烷233四氫呋喃212丙酮330乙腈190甲醇205水1878 流動相溶劑的選擇2022-5-98 流動相溶劑的選擇 高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50100nm。 化學(xué)穩(wěn)定性好