基因載體的選擇與構(gòu)建

1、一、載體的功能、特征及質(zhì)粒載體一、載體的功能、特征及質(zhì)粒載體 克隆載體（克隆載體（clony vector）：具有在細胞內(nèi)進行：具有在細胞內(nèi)進行自我復(fù)制的自我復(fù)制的DNA分子，起運送目的基因到受體分子，起運送目的基因到受體細胞的作用。細胞的作用。目前基因工程中常用的載體有：目前基因工程中常用的載體有： 細菌質(zhì)粒、噬菌體載體、黏粒載體、細菌質(zhì)粒、噬菌體載體、黏粒載體、病毒載體、人工染色體等。病毒載體、人工染色體等。一）載體的功能一）載體的功能 1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴增或表達提供條件 二）載體應(yīng)具備的特征條件二）載體應(yīng)具備的特征條件1

2、.能在宿主細胞內(nèi)能在宿主細胞內(nèi)獨立和穩(wěn)定的自我復(fù)制獨立和穩(wěn)定的自我復(fù)制2.具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或具有與特定受體細胞相適應(yīng)的復(fù)制位點或整合位點整合位點3.長度盡可能小，以提高其載裝能力長度盡可能小，以提高其載裝能力4.具有具有多種單一的酶切位點多種單一的酶切位點5.具有合適的具有合適的選擇性標(biāo)記選擇性標(biāo)記 polylinker 質(zhì)粒質(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復(fù)制的而自主復(fù)制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子分子（Covalently closed Circular DNA, ccc DNA）。 不是細菌生長所必需的

3、可賦予細菌抵御外界因素不利影響的能力 分子量在1-200kb之間 1、質(zhì)粒的基本特性、質(zhì)粒的基本特性 （1）自主復(fù)制性）自主復(fù)制性 攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（攜帶有自己的復(fù)制起始區(qū)（ori） 控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因控制質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因 能獨立于宿主細胞的染色體能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復(fù)制而自主復(fù)制 （2）不相容性）不相容性 同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒在同一細菌中同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒在同一細菌中不能相容不能相容不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在同一細菌中可共存不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒在同一細菌中可共存 （3）可擴增性）可擴增性 質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類質(zhì)粒就其復(fù)制方式而言分為兩類 松弛型復(fù)制松弛型復(fù)制 嚴(yán)

4、謹(jǐn)型復(fù)制嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)制（4）可轉(zhuǎn)移性）可轉(zhuǎn)移性 在天然條件下，大多質(zhì)?？赏ㄟ^在天然條件下，大多質(zhì)粒可通過細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)。到另外一種宿主內(nèi)。 2、質(zhì)粒的構(gòu)建、質(zhì)粒的構(gòu)建 （1） 天然存在的兩種質(zhì)粒天然存在的兩種質(zhì)粒 A、colE1宿主細菌大腸桿菌宿主細菌大腸桿菌6.5kb松弛型松弛型復(fù)制復(fù)制20-30/cellB、pSC101宿主細菌沙門氏菌宿主細菌沙門氏菌8.8kb嚴(yán)謹(jǐn)型嚴(yán)謹(jǐn)型復(fù)復(fù)制制5copy/cell（2） 質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的質(zhì)粒人工構(gòu)建的目的 天然質(zhì)粒存在缺陷天然質(zhì)粒存在缺陷 不適合用作基因工程的載體不適合用作基因工程的載體

5、必須對之進行改造構(gòu)建必須對之進行改造構(gòu)建 方法方法:重組重組，“拼拼接接，挖肉補瘡拼拼接接，挖肉補瘡” （a）加入合適的選擇標(biāo)記基因加入合適的選擇標(biāo)記基因（b）增加或減少合適的酶切位點增加或減少合適的酶切位點（c）縮短長度縮短長度，增加裝載量增加裝載量（d）改變復(fù)制子改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝貝為多拷貝（e）根據(jù)基因工程的特殊要求）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基加裝特殊的基因元件因元件 pBR322pBR322BamBam HIHISalSal I IHinHin dIIIdIIIPstPst I IScaSca I IAmpAmpr roriori(

6、4.36 kb)(4.36 kb)利用抗性基因進行重組子的篩選 重組 DNAAmprTcs提 取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn) 化 無 菌落陽 性菌 落篩 選重 組 子2)DNA重組無 DNA插入有 DNA插入外 源DNA1)限制 酶 切3、質(zhì)粒的制備、質(zhì)粒的制備 實驗室一般使用兩種方法制備質(zhì)粒實驗室一般使用兩種方法制備質(zhì)粒（1） 堿裂解法堿裂解法（2） 沸水浴法沸水浴法 （1）堿裂解法）堿裂解法 原理：利用溶菌酶在原理：利用溶菌酶在NaOH與與SDS的混合溶液中破壞的混合溶液中破壞細菌外壁，去除染色體細菌外壁，去除染色體DNA及變性蛋白質(zhì)，

7、及變性蛋白質(zhì)，離心，苯離心，苯酚氯仿溶液處理，乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒。酚氯仿溶液處理，乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒。特點：質(zhì)粒較純，收得率高，繁瑣，且質(zhì)粒較純，收得率高，繁瑣，且有開環(huán)現(xiàn)象有開環(huán)現(xiàn)象 （2） 沸水浴法沸水浴法 特點：質(zhì)粒不純，收得率低，且制備規(guī)模小，質(zhì)粒不純，收得率低，且制備規(guī)模小，但快速，特別適用于重組質(zhì)粒的鑒定但快速，特別適用于重組質(zhì)粒的鑒定。 1) 用限制性內(nèi)切酶消化用限制性內(nèi)切酶消化 DNA DNA 樣品樣品 2)用限制性內(nèi)切酶消化用限制性內(nèi)切酶消化 質(zhì)粒DNA DNA 3) 連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物 4) 用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞 5) 涂布在瓊脂平

8、板上進行耐抗菌素篩選4 4、典型的質(zhì)?？寺〖夹g(shù)、典型的質(zhì)粒克隆技術(shù)1）用限制性酶消化限制性酶消化 DNA 樣品樣品粘性末端2）用限制性內(nèi)切酶消化）用限制性內(nèi)切酶消化 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA3）連接樣品DNA和質(zhì)粒DNA的消化產(chǎn)物冷循環(huán)器4）用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化細菌有兩個基本方法。轉(zhuǎn)化細菌有兩個基本方法。一一是是 化學(xué)法，即用化學(xué)法，即用CaCl2 處理并加熱激以處理并加熱激以促進促進DNA進入菌體；進入菌體；二是電激法，即二是電激法，即 施加短脈沖的電荷以促進施加短脈沖的電荷以促進DNA 吸收。吸收。5）細菌細菌在加有在加有Amp+X-Gal的培養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長以進行篩選基上生長以進行

9、篩選篩選會有三種結(jié)果：篩選會有三種結(jié)果： 一是要一是要插入的序列自連插入的序列自連，結(jié)果，結(jié)果沒有沒有菌落形成菌落形成； 二是二是切開的質(zhì)粒重連切開的質(zhì)粒重連，結(jié)果表現(xiàn)為，結(jié)果表現(xiàn)為藍色菌落藍色菌落； 三是要三是要插入的序列與質(zhì)粒相連插入的序列與質(zhì)粒相連，產(chǎn)，產(chǎn)生生白色的抗氨芐青霉素菌落白色的抗氨芐青霉素菌落。 倒平板Amp+X-Gal+IPTG培養(yǎng)基的篩選菌落法培養(yǎng)基的篩選菌落法加IPTG和X-GAL乳糖和誘導(dǎo)物IPTG的化學(xué)結(jié)構(gòu) X-galX-gal水解篩選結(jié)果藍菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表藍菌落代表含有質(zhì)粒的耐藥菌，表達出由完好的達出由完好的 LacZ序列編碼的功能功能性的性的 片段片段

10、白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉白菌落代表含有質(zhì)粒的耐氨芐青霉素菌，質(zhì)粒上素菌，質(zhì)粒上 LacZ序列上有上有插入片插入片段段篩選結(jié)果模式圖藍菌落藍白菌落篩選白色菌落篩選白色菌落二、噬菌體載體與黏粒載體二、噬菌體載體與黏粒載體一）噬菌體載體一）噬菌體載體 噬菌體是大噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和它由外殼蛋白和-DNA組成組成 噬菌體噬菌體 (電鏡圖）電鏡圖）1、-DNA的物理圖譜的物理圖譜 -DNA為為線狀雙鏈線狀雙鏈DNA分子分子，兩端各有一個，兩端各有一個12核苷核苷酸的互補單鏈（粘性末端）酸的互補單鏈（粘性末端）GGGCGGCGAC CT, CCCGCCGCTGGA

11、，稱為，稱為cos區(qū)區(qū)，全長，全長48.5kb。特點是功能相近的基因在基特點是功能相近的基因在基因組中聚集在一起。因組中聚集在一起。cos位點的作用 2、感染周期、感染周期 噬菌體通過特殊的生物學(xué)方式感染宿主細噬菌體通過特殊的生物學(xué)方式感染宿主細胞，將其胞，將其DNA導(dǎo)入導(dǎo)入 ：（1）吸附吸附 （2）DNA注入注入 （3）DNA復(fù)制復(fù)制（4）包裝包裝: 只能包裝只能包裝-DNA分子的分子的75%-105% 即包裝范圍為即包裝范圍為36.4kb-50.9kb的的DNA（5）裂解裂解 吸附吸附穿入穿入生物合成生物合成成熟、釋放成熟、釋放毒性噬菌體的溶菌性周期毒性噬菌體的溶菌性周期 溫和噬菌體的溶菌

12、性周期溫和噬菌體的溶菌性周期 溫和噬菌體的溶源性周期溫和噬菌體的溶源性周期 前噬菌體前噬菌體二）二） DNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建 建立建立克隆載體前需要解決兩個問題：克隆載體前需要解決兩個問題：1） DNA分子只能增加分子只能增加5%的大小，即只能插的大小，即只能插入入3kb的的DNA分子。分子。2） 基因組非常大，對于每一種酶來講都含基因組非常大，對于每一種酶來講都含有超過有超過1個的識別序列，酶切后產(chǎn)生多個片段，個的識別序列，酶切后產(chǎn)生多個片段，連接不能形成連接不能形成基因組?；蚪M。. 縮短長度縮短長度 縮短多余片段提高裝載量?？s短多余片段提高裝載量。（a）插入型載體插入型載體 （b）取

13、代型載體取代型載體 .修飾酶切識別位點修飾酶切識別位點 多余的酶切位點必須被修飾多余的酶切位點必須被修飾 自然選擇法自然選擇法通過自然選擇法篩選無通過自然選擇法篩選無EcorI識別位點的識別位點的-噬菌體噬菌體 三）三）-DNA的抽提的抽提 1)大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期2) 加入加入-噬菌體或重組噬菌體或重組-噬菌體懸浮液，噬菌體懸浮液，37培養(yǎng)培養(yǎng)1hr3) 用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12hr4) 高速離心，沉淀噬菌體高速離心，沉淀噬菌體5) 苯酚抽提，釋放苯酚抽提，釋放-DNA6) 乙醇或異丙醇沉淀乙醇或異丙醇沉淀DNA四）四）-DNA作為載體的優(yōu)點作為載體的優(yōu)點 1)體外包裝病毒顆粒，高效感染體外包裝病毒顆粒，高效感染E.coli2) 裝載外源能力為裝載外源能力為25kb，大于質(zhì)粒，大于質(zhì)粒3) 篩選方便篩選方便4) 重組重組-DNA分子提取容易分子提取容易 五）五）cos質(zhì)粒質(zhì)粒 （cosmid）1、cos質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建 cos質(zhì)粒質(zhì)粒 含有含有-DNA-DNA兩端兩端coscos區(qū)的質(zhì)粒區(qū)的質(zhì)粒 能容納大片段（能容納大片段（45kb45kb）的小分子（）的小分子（4kb4kb 6kb6kb）載體）載體 組成：質(zhì)粒復(fù)制