miRNA技術(shù)詳述復(fù)習(xí)進程

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。miRNA技術(shù)詳述miRNA技術(shù)詳述日期：2012-04-26來源：未知作者：網(wǎng)友點擊：730次摘要：miRNAs是一類重要的內(nèi)源性小的非編碼RNA分子，大約由21-25個核苷酸組成。miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達。人類基因組中大約存在超過1000條miRNA，其在多種人體細(xì)胞類型中大量表達，估計其調(diào)節(jié)超過60%的哺乳動物基因。HYPERLINK/extend/redirect-htm-aid-24.htmlot_blank找產(chǎn)品，上生物幫相關(guān)專

2、題HYPERLINK/zt/experiment/rna/221892.html解讀miRNA（MicroRNA）引述精準(zhǔn)的HYPERLINK/zt/gene/jiyin.htmlt_blank基因表達調(diào)控對生物體的生長發(fā)育和功能至關(guān)重要。過去對HYPERLINK/zt/gene/jiyin.htmlt_blank基因表達調(diào)控的研究主要集中在HYPERLINK/zt/experiment/t_blank轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的基因HYPERLINK/zt/experiment/t_blank轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面(激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄)。而RNA一度被認(rèn)為是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過渡”，但越來越多的證據(jù)清楚的表明R

3、NA在生命的進程中扮演的角色遠(yuǎn)比早前的設(shè)想重要，晚近發(fā)現(xiàn)一系列HYPERLINK/zt/experiment/molecular/t_blank小HYPERLINK/zt/experiment/molecular/t_blank分子非編碼RNA(smallnoncodingRNA)，包括HYPERLINK/zt/experiment/222145.htmlt_blankmiRNA(microRNA)，HYPERLINK/zt/rna/rna.htmlt_blanksiRNA(smallinterferingRNA)，piRNA(piwi-interactingRNA)和eHYPERLINK/z

4、t/rna/rna.htmlt_blanksiRNA(endogenoussiRNA)等，這些小RNA組成了RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳等水平控制基因的表達，參與調(diào)控包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡等進程，影響著生物體的生長發(fā)育和多種病理過程。小RNA的發(fā)現(xiàn)也揭示了真核生物全新的基因表達調(diào)控方式。miRNAs是一類重要的內(nèi)源性小的非編碼RNA分子，大約由21-25個HYPERLINK/zt/experiment/hesuan.htmlt_blank核苷酸組成。miRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過抑制翻譯或降解靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達。人類HYPERLINK/reseach

5、/gene/t_blank基因組中大約存在超過1000條miRNA，其在多種人體細(xì)胞類型中大量表達，估計其調(diào)節(jié)超過60%的HYPERLINK/news/t_blank哺乳動物基因。miRNA在HYPERLINK/news/botany/t_blank植物界和后生動物界間表現(xiàn)不同的特性。在HYPERLINK/news/botany/t_blank植物中，miRNA與其靶基因通過近乎完美互補的方式相結(jié)合;而在后生動物中，經(jīng)常是一條miRNA可以和靶基因的多個位點相結(jié)合，或是一條miRNA調(diào)節(jié)多種靶基因。另外,在后生生物中，miRNA靶位點位于mRNA的3UTR，而在植物中，miRNA靶位點可以位于

6、3UTR，更多情況下是位于mRNA的編碼區(qū)內(nèi)。第一個miRNA在上世紀(jì)九十年代被發(fā)現(xiàn)，直到本世紀(jì)初才認(rèn)識到這是一類在功能上保守的生物調(diào)節(jié)因子。在此時起，miRNA研究揭示其存在不同基因表達負(fù)調(diào)控形式，包括轉(zhuǎn)錄本降解和扣留(sequestering)，翻譯抑制等，并可能參與了對基因表達的正調(diào)控(轉(zhuǎn)錄和翻譯活化作用)。總之，在不同形式的細(xì)胞和組織類型中發(fā)現(xiàn)了不同的miRNA表達形式，miRNA可能參與了多數(shù)生理過程;并且在多種病理狀態(tài)下，miRNA呈現(xiàn)異常表達，這些異常表達miRNA在疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了重要作用，當(dāng)前，基于miRNA的治療方式研究當(dāng)前正在進行中。miRNA的發(fā)現(xiàn)歷史miR

7、NA是由VictorAmbros,RosalindLee和RhondaFeinbaum等人在研究lin-14基因在調(diào)節(jié)線蟲發(fā)育中作用時發(fā)現(xiàn)的。他們發(fā)現(xiàn)LIN-14蛋白豐度受到一個由lin-4編碼的短RNA產(chǎn)物的調(diào)節(jié)，來自lin-4基因的61個核苷酸前體生成一個22個核苷酸的RNA，該RNA含有與lin-14mRNA3UTR部分互補的序列。這種互補特性為抑制lin-14翻譯生成LIN-14蛋白的充分必要元件。然而在當(dāng)時，lin-4卻被認(rèn)為是線蟲中特有的現(xiàn)象而被忽視。直到2000年，第二個小RNAlet-7被發(fā)現(xiàn)，let-7可以抑制lin-41,lin-14,lin-28,lin-42和daf-1

8、2等在發(fā)育轉(zhuǎn)型中發(fā)揮重要作用基因的翻譯。很快又發(fā)現(xiàn)let-7在多個HYPERLINK/reseach/gene/t_blank物種間保守存在，表明在更廣泛的生物HYPERLINK/reseach/gene/t_blank物種中存在這種調(diào)節(jié)。miRNA的命名術(shù)語當(dāng)前，發(fā)展了一套標(biāo)準(zhǔn)的miRNA命名系統(tǒng)，前綴mir后緊跟“-”和相應(yīng)數(shù)字，數(shù)字通常顯示名字的先后次序。而小寫的mir-指pre-miRNA，如果使用大寫的miR-則指成熟的miRNA。對于差別只有一到兩個核苷酸的近似相同的miRNA，在命名時通常另外添加一個小寫字母，例如miR-200a和miR-200b。為了區(qū)分物種來源，通常在miR

9、NA的前面加上三個字母組成的前綴，如人源性的使用has，而綿羊(Ovisaries)來源的使用oar，其他如v表示來自病毒基因組，D表示HYPERLINK/zt/inventory/guoying.htmlt_blank果蠅源性的等。如果定位于不同基因組位置的前體miRNA可以生成完全一致的成熟miRNA，則通常使用外加的“-”加數(shù)字后綴來區(qū)別這種情況，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2位于基因組的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。當(dāng)兩個成熟的miRNA來自于相同的前體miRNA的相反的兩個臂，則使用“-3p”和“-5p”后綴(過去曾使

10、用s和as表示，分別來自sense和antisense)。當(dāng)相對表達水平已知時，通常使用星號表示該miRNA在表達水平上較其對應(yīng)的反向臂miRNA低。例如miR-31和miR-31*分別來自于同一前體miRNA的兩對應(yīng)臂，且miR-31為主要存在形式。miRNA的生物起源約40%的miRNA基因位于蛋白的內(nèi)含子中或是不編碼蛋白的基因序列中，甚至位于外顯子中。雖有例外，它們通常呈正向分布。因此，它們多數(shù)與其宿主基因一起受到調(diào)節(jié)。另有42-48%miRNA基因呈多順反子形式排布，雖然這并不表示這成簇分布的miRNA在結(jié)構(gòu)和功能上存在相似性，但它們共用一個啟動子區(qū)域，由2-7個不同的環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)剪切加工

11、而來。其啟動子在模序結(jié)構(gòu)上與由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的其它啟動子，如編碼功能蛋白基因的啟動子相似。DNA模版并不是成熟miRNA的最終形式，部分人類miRNA存在RNA剪輯，位點特異的RNA序列修飾導(dǎo)致其產(chǎn)物和DNA模版不一致，從而增加了miRNA的多樣性，超出了基因組模版的數(shù)量范圍。miRNA的轉(zhuǎn)錄miRNA通常由RNA聚合酶II(PolII)轉(zhuǎn)錄生成。PolII結(jié)合在以后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸環(huán)DNA序列附近。生成的轉(zhuǎn)錄本經(jīng)修飾添加5帽子結(jié)構(gòu)和3末端多腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)，并剪切，生成的產(chǎn)物稱為初級miRNA(pri-miRNA)，該產(chǎn)物可能長達數(shù)千或數(shù)百核苷酸，可能包含多個miRNA環(huán)結(jié)構(gòu)。RNA聚合

12、酶III(PolIII)轉(zhuǎn)錄生成部分miRNA，尤其是上游為Alu序列，tRNAs和哺乳動物廣泛散步重復(fù)(mammalianwideinterspersedrepeat(MWIR)啟動子單元的miRNA。miRNA的核內(nèi)處理過程單個pri-miRNA可能含一到六個miRNA前體。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)每個由約70nt左右的核苷酸組成。每個發(fā)卡結(jié)構(gòu)附以部分序列以利于有效剪切處理。pri-miRNA中的雙鏈發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)被叫做DGCR8的核蛋白(DiGeorgeSyndromeCriticalRegion8，該蛋白與DiGeorge綜合癥關(guān)系密切，在非脊椎動物中稱為Pasha)辨認(rèn)，DGCR8同Drosha

13、酶一起形成微處理(microprocessor)復(fù)合體。在該復(fù)合體中，DGCR8組織Drosha蛋白的RNaseIII結(jié)構(gòu)域使其在距離發(fā)卡結(jié)構(gòu)約11個核苷酸處切割pri-miRNA，使其釋放發(fā)卡結(jié)構(gòu)。釋放的發(fā)卡結(jié)構(gòu)即為前miRNA(pre-miRNA),pre-miRNA在3存在兩個懸空的核苷酸，pre-miRNA5為磷酸集團，3為羥基集團。在果蠅和線蟲中存在由內(nèi)含子直接剪切產(chǎn)生的pre-miRNA，并不經(jīng)過微處理復(fù)合體過程，這種miRNA稱為mirtrons。部分pre-miRNA可發(fā)生核RNA剪輯。多數(shù)情況下，作用于RNA的腺苷酸脫胺酶(adenosinedeaminasesactingo

14、nRNA,ADAR)催化腺苷酸生成次黃嘌呤核苷(inosine)，RNA剪輯能夠阻礙核內(nèi)處理過程(例如導(dǎo)致pri-miR-142被HYPERLINK/zt/experiment/cell/4625.htmlt_blank核糖體酶Tudor-SN降解)，并改變下游處理過程，包括在胞漿的miRNA處理和靶向特異性(如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中改變miR-376種子區(qū)序列)。miRNA的HYPERLINK/zt/experiment/cell/4625.htmlt_blank細(xì)胞核輸出Pre-miRNA發(fā)卡通過Exportin-5蛋白的核胞漿穿梭完成從核輸出到胞漿過程。Exportin-5蛋白為karyoph

15、erin家族蛋白成員，該蛋白通過辨認(rèn)DroshaRNaseIII酶切割留下來的3兩個懸空的核苷酸，介導(dǎo)pre-miRNA的輸出，該過程由GTP提供能量完成。miRNA的胞漿處理過程在胞漿中，pre-miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)經(jīng)RNaseIIIDicer切割處理。這種內(nèi)源性HYPERLINK/zt/gene/225751.htmlt_blank核糖核酸酶(endoribonuclease)與發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3相互作用并在環(huán)的3和5臂上完成切割，產(chǎn)生長約22nt并不完美匹配的miRNA:miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)。不但發(fā)夾結(jié)構(gòu)和頸環(huán)的大小影響了Dicer酶切割效率，miRNA:miRNA*雙鏈結(jié)構(gòu)的不完全匹配特性也影

16、響了Dicer酶的切割效率。雖然雙鏈結(jié)構(gòu)中的任何一條都可能成為功能miRNA，但是通常只一鏈可能進入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，在RISC中與其相應(yīng)靶基因mRNA發(fā)生相互作用。miRNA在植物中的生成情況(Biogenesis)miRNA在植物中的生成過程與在后生動物中不同，區(qū)別主要在核處理和輸出過程上。與后生動物在核和胞漿中由兩種不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer樣酶1(Dicer-like1,DL1)完成切割處理過程。DL1只在植物細(xì)胞核中表達，表明兩種反應(yīng)都發(fā)生在核內(nèi)。植物miRNA:miRNA*

17、雙鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運出核前，其3突出序列經(jīng)RNA甲基化轉(zhuǎn)移蛋白Hua-Enhancer1(HEN1)甲基化修飾。而后此雙鏈結(jié)構(gòu)被Hasty(HST)由核輸出至胞漿，在胞漿中解離生成成熟的miRNA，進入RISC。Hasty蛋白即為后生動物中Exportin5蛋白的同源蛋白。RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)除了包括成熟的miRNA外，還包含Dicer蛋白和多種其它相關(guān)蛋白。RISC也被稱為microRNA核酸蛋白復(fù)合體(microRNAribonucleoproteincomplex,miRNP)，摻入RISC的miRNA也被稱為miRISC?，F(xiàn)在認(rèn)為Dicer對pre-miRN

18、A的處理與雙鏈螺旋的解旋是偶聯(lián)在一起的。通常情況下只有一條鏈進入miRISC，對雙鏈中某一條鏈的偏好選擇基于相對另一條鏈的熱動力學(xué)不穩(wěn)定性和更差的堿基配對能力。頸環(huán)的位置可能也影響了摻入鏈的選擇性。不進入RISC的鏈被稱為passenger鏈，其miRNA被冠以星號(*)，具有更低的穩(wěn)定性，通常情況下被降解掉。在某些情況下，兩條鏈都具有活性，成為針對不同靶基因mRNA的功能miRNA。Argonaute(Ago)蛋白成員在RISC功能中處于中心地位，該類蛋白為miRNA誘導(dǎo)的基因沉默的必需組分，其含有兩個保守的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PAZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合成熟miRNA的3序列，PIWI結(jié)構(gòu)域組裝核酶H(

19、ribonuclease-H)，并與導(dǎo)引鏈(miRNA)5端結(jié)合。Ago蛋白與成熟miRNA結(jié)合使其正確朝向，以便對靶基因mRNA完成切割。一些Ago蛋白，例如人Ago2，直接切割靶轉(zhuǎn)錄本;另外，Ago蛋白也可能招募其它蛋白行使翻譯抑制功能。在人類基因組中含有8個Argonaute蛋白，根據(jù)序列相似性分為兩個家族：AGO和PIWI。AGO蛋白有4個成員，存在于所有哺乳動物細(xì)胞中，在人類這類蛋白稱為E1F2C/hAgo;PIWI存在于精細(xì)胞和造血HYPERLINK/zt/experiment/cell/ips.htmlt_blank干細(xì)胞中。RISC的其它組成成分還包括TRBPhumanimmu

20、nodeficiencyvirus(HIV)transactivatingresponseRNA(TAR)bindingprotein，PACT(proteinactivatoroftheinterferoninducedproteinkinase(PACT),SMN復(fù)合體，脆性X智障蛋白(fragileXmentalretardationprotein，F(xiàn)MRP)和Tudor-SN(Tudorstaphylococcalnuclease-domain-containingprotein)等。miRNA介導(dǎo)的基因沉默模式miRNA與靶mRNA的典型作用方式主要有兩種。在大多數(shù)情況下，復(fù)合物中的

21、單鏈miRNA與靶mRNA的3UTR不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達。這種方式主要影響HYPERLINK/zt/protein/danbaibiaoda.htmlt_blank蛋白表達水平，并不影響mRNA的穩(wěn)定性。近來，有研究對翻譯抑制理論提出質(zhì)疑，發(fā)現(xiàn)被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞漿中被稱為P小體(processingbodies，P-bodies)的區(qū)域，這個區(qū)域還濃縮了許多參與mRNA降解的酶類。P小體可能是作為未翻譯mRNA進行暫時的可逆儲存的容器，減少一些特定P小體組成蛋白的表達能夠緩和miRNA介導(dǎo)的基因表達抑制作用。P小體是胞漿中的一定區(qū)域，它

22、包含參與多種轉(zhuǎn)錄后過程的蛋白質(zhì)，例如：mRNA降解(mRNAdegradation)、無義介導(dǎo)mRNA衰退(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)，轉(zhuǎn)錄抑制及RNA介導(dǎo)的基因沉默(RNA-mediatedgenesilencing)。另一種作用方式與siRNA類似，當(dāng)miRNA與mRNA完全互補配對時，Ago2蛋白通過切割mRNA直接導(dǎo)致其降解，實現(xiàn)基因沉默。以siRNA參與的HYPERLINK/zt/rna/rna.htmlt_blankRNAi為例：siRNA可與RISC結(jié)合，作為模板識別mRNA靶子，通過堿基互補配對原則，mRNA與siRNA中的反義鏈結(jié)合，置換出

23、正義鏈。雙鏈mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下產(chǎn)生22nt左右的siRNA，siRNA繼續(xù)同RISC形成復(fù)合體，與siRNA互補的mRNA結(jié)合，使mRNA被RNA酶裂解。這個過程也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)?？傊?dāng)前認(rèn)為miRNA以何種方式與目的基因作用和miRNA與目的基因的配對程度有關(guān)。miRNA與目的基因配對不完全時，miRNA就以抑制目的基因的表達發(fā)揮作用;miRNA與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區(qū)斷裂而導(dǎo)致基因沉默。另外，miRNAs有時候也導(dǎo)致組氨酸修飾和啟動子區(qū)的DNA甲基化，從而影響靶基因的表達。除此外，近來發(fā)現(xiàn)快速脫腺苷酸化(acc

24、elerateddeadenylation)是miRNA抑制基因表達的新機制。在哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-125b和let-7能夠促進mRNA聚腺苷酸尾巴(polyAtail)的去除。用3組蛋白莖-環(huán)結(jié)構(gòu)取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b對mRNA含量的影響，還可以降低對HYPERLINK/zt/protein/100606.htmlt_blank蛋白質(zhì)合成的作用，可見miRNA能通過降低翻譯效率和聚腺苷酸化mRNA的濃度來抑制基因表達。miRNA介導(dǎo)的基因沉默模式機制miRNA的翻譯起始抑制目前對miRNA翻譯起始抑制機制主要有如下幾種觀點：認(rèn)為miRNA可能通過抑制全能性核糖體

25、的組裝而阻斷翻譯起始。EIF6是一種可以抑制核糖體40S和60S亞基結(jié)合、阻斷80S全能性核糖體形成的蛋白，EIF6與Ago/RISC直接相互作用，并且在哺乳動物和線蟲中，缺失EIF6影響miRNA介導(dǎo)基因沉默。然而，RISC是否通過與EIF6相互作用誘導(dǎo)40S和60S核糖體解聚還有待于進一步的研究。第二種觀點根據(jù)miRNA抑制要求靶mRNAm7G帽子的存在，認(rèn)為miRISC可能抑制翻譯起始復(fù)合物的形成。研究發(fā)現(xiàn)，增加體外系統(tǒng)中eIF4F復(fù)合物(含有m7G帽子結(jié)合蛋白、翻譯起始因子eIF4E)水平可回復(fù)miRNA翻譯抑制;另一個研究發(fā)現(xiàn)，Ago2中間結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合m7G帽子的活性，Ago2經(jīng)m

26、iRNA招募到靶mRNA3UTR，與起始復(fù)合物eIF4E/G競爭性結(jié)合m7G帽子，抑制翻譯起始復(fù)合物的形成。第三種觀點認(rèn)為miRNA可能通過阻止polyA結(jié)合蛋白polyAbindingprotein(PABP)與mRNA結(jié)合影響翻譯起始。miRNA引起靶mRNA脫腺嘌呤反應(yīng)，導(dǎo)致RNA的polyA尾巴縮短，使PABP結(jié)合mRNA受阻，從而影響翻譯起始。miRNA翻譯起始后抑制研究發(fā)現(xiàn)一些被miRNA抑制的mRNA與翻譯活躍的多核糖體偶聯(lián)，說明這些miRNA的抑制作用不是發(fā)生在翻譯起始水平。此外，經(jīng)內(nèi)部核糖體進入位點(InternalRibosomeEntrySite,IRES)起始、不依賴于

27、mRNAm7G帽子的翻譯過程也可以被miRNA抑制，證明miRNA抑制發(fā)生在翻譯起始之后。雖然有如上證據(jù)，但是關(guān)于miRNA究竟如何在翻譯起始后發(fā)揮抑制作用，目前還沒有一致的結(jié)論。有研究者推測miRNA可能引起新生多肽鏈的翻譯同步降解，或者是在翻譯延伸過程中，miRNA能引發(fā)翻譯提前終止。miRNA介導(dǎo)mRNA衰減miRNA可以誘導(dǎo)與之不完全配對靶mRNA衰減，下調(diào)靶mRNA的水平。發(fā)現(xiàn)Ago蛋白定位于降解mRNA的RNA顆粒(RNAgranules)，如P小體中，這些RNA顆粒中包含mRNA降解酶，提示這些mRNA降解酶可能參與miRNA介導(dǎo)的mRNA衰減。此外，miRISC的核心成分Ago

28、家族蛋白有多種異構(gòu)體，其中一些成員的內(nèi)切酶活性也可能協(xié)助miRNA介導(dǎo)的mRNA切割或衰減。這些證據(jù)支持miRNA可以直接或間接介導(dǎo)靶mRNA的降解。RNA顆粒扣押、降解或儲存靶mRNA胞漿的RNA顆粒，如P小體和SG(StressGranules)顆粒，是細(xì)胞儲存處于翻譯抑制狀態(tài)mRNA的場所，在此，mRNA被降解或/和釋放重新進入翻譯機器，在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達調(diào)控中具有重要的作用。P小體被認(rèn)為是細(xì)胞mRNA代謝場所;SG顆粒因特異性地在受脅迫條件下形成而得名，P小體和SG顆?？赡苁莔iRNA胞內(nèi)發(fā)揮作用的重要場所：在miRNA存在下，miRISC中的核心組分及與miRISC結(jié)合的mRNA

29、定位于P小體和SG顆粒中;抑制P小體的形成可抑制miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制，抑制RISC也同樣抑制P小體的形成。推測被miRISC結(jié)合的mRNA進入P小體和SG顆粒中，RNA顆粒的翻譯抑制子使mRNA處于翻譯抑制狀態(tài)，從而實現(xiàn)基因沉默，靶mRNA被扣押后隨即進行一個mRNA衰減或儲存的分揀步驟，P小體和SG顆?？赡芊止?zhí)行mRNA降解和暫時儲存功能。miRNA正調(diào)控和去抑制最近的研究發(fā)現(xiàn)了一些新型的miRNA作用方式，如miRNA正調(diào)控和去抑制作用等。miRNA不總是基因表達的負(fù)調(diào)控因子，在一些條件下，miRNA上調(diào)基因表達。在HYPERLINK/zt/cell/221848.htmlt_bla

30、nk細(xì)胞周期過程中，miRNA效應(yīng)在抑制和活化作用間擺動，在G0期細(xì)胞中，miRNA活化翻譯上調(diào)基因表達，而在其它時期發(fā)揮抑制作用。另外還發(fā)現(xiàn)一些增殖細(xì)胞中表達的mRNA3UTR保守性地縮短，導(dǎo)致miRNA的靶位點減少，從而避免miRNA負(fù)調(diào)控作用。miRNA的周期(turnover)miRNA需要快速實現(xiàn)周期輪轉(zhuǎn)以滿足miRNA表達譜快速改變的需求。當(dāng)miRNA在胞漿中成熟時，Argonaute蛋白結(jié)合miRNA過程普遍被認(rèn)為具有穩(wěn)定引導(dǎo)鏈的作用，而同時互補的passenger鏈被降解消除。argonaute蛋白傾向于保留下可以調(diào)控大量靶基因的miRNAs，而清除靶向基因較少和沒有任何靶基因

31、的miRNA。在動物中，成熟miRNA的衰減由5-3外切核酸酶XRB2(又稱為Rat1p)負(fù)責(zé)，在植物體內(nèi)由SDN(smallRNAdegradingnuclease)家族成員來執(zhí)行此功能，但方向相反(3-5)，在動物基因組內(nèi)也編碼與植物SDN酶相似的酶，但其作用還不清楚。在多種HYPERLINK/zt/inventory/guoying.htmlt_blank模式生物(包括擬南芥)的研究均表明miRNA的多種個修飾影響miRNA的穩(wěn)定性，植物成熟的miRNA可通過3的甲基化增強miRNA的穩(wěn)定性。而2-O甲基化阻止尿苷酰轉(zhuǎn)移酶在此位添加尿嘧啶(該位點的尿嘧啶化和miRNA的降解有關(guān))，同時，

32、有觀點認(rèn)為尿嘧啶化具有保護miRNA的作用，因此，當(dāng)前對該種修飾的確切作用還沒有定論。尿嘧啶修飾不止在植物，在動物中也存在。植物和動物miRNA都可以在3發(fā)生腺苷酸修飾，例如肝臟高豐量表達miRNAmiR-122，miR-122在丙型肝炎中具有重要作用，miR-122的腺苷酸修飾具有穩(wěn)定miRNA的作用，在植物中的研究也發(fā)現(xiàn)腺苷酸修飾可以延緩miRNA的降解速率。miRNA的演化歷程(HYPERLINK/reseach/environment/t_blank進化)miRNA因其低的進化率成為重要的分類學(xué)標(biāo)志物。miRNA的起源與形態(tài)進化有關(guān)，使基因表達調(diào)節(jié)更精細(xì)，更具有特異性，更有利于復(fù)雜器官

33、的生成，并可能最終導(dǎo)致復(fù)雜生命的出現(xiàn)。事實上，形態(tài)學(xué)進化上的大爆發(fā)通常伴隨了miRNA的激增。miRNA通常起源于位于DNA非編碼區(qū)域隨機生成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(常位于內(nèi)含子和基因間)，部分miRNA源于已存在miRNA的復(fù)制和修飾。最近起源的miRNA進化的速度(如核酸置換)與其它非編碼DNA相當(dāng)，暗示其通過中性漂變進化;起源古老miRNA均有很低的進化速度，通常每百萬年一個堿基置換的速率都不到，表明miRNA取得一項功能經(jīng)歷了極其精準(zhǔn)的選擇過程。在這種情景下，miRNA很難在基因組中丟失。而最近起源的miRNA，通?？赡軟]有重要的功能，也更容易在進化中丟失。這種特性使miRNA在進化學(xué)上成為杰出的

34、分子標(biāo)志物，可能有利于解決在分類學(xué)上存在爭議的類群(如節(jié)肢動物)。miRNA是在多數(shù)真核生物中普遍存在的特性，從褐藻到后生動物都存在。到2011年3月止，已經(jīng)在各個物種界共發(fā)現(xiàn)了15170多miRNA。雖然在HYPERLINK/reseach/microbiology/t_blank細(xì)菌中沒有發(fā)現(xiàn)miRNA，但是在HYPERLINK/reseach/microbiology/t_blank細(xì)菌中同樣存在短的RNA序列(通常50到數(shù)百個核苷酸長)，發(fā)揮了與miRNA相類似的功能。miRNA的識別和預(yù)測miRNA具有獨特的結(jié)構(gòu)和生物特性：包括miRNA前體具有發(fā)夾或折疊的二級結(jié)構(gòu)，不含有大的內(nèi)部環(huán)

35、狀結(jié)構(gòu)和突起，成熟的miRNA位于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸部，由Dicer加工而成，成熟miRNA長約22nt左右，其序列在不同物種間保守等?，F(xiàn)今有多種發(fā)現(xiàn)miRNA的技術(shù)，可分為計算機HYPERLINK/t_blank軟件預(yù)測和分子生物學(xué)實驗方法兩類。計算機分析法利用miRNA結(jié)構(gòu)和構(gòu)相特征預(yù)測基因組中可能存在的miRNA，然后在此基礎(chǔ)上通過實驗方法證實。隨著不同生物基因組HYPERLINK/zt/show-1.htmlt_blank測序的完成和對miRNA結(jié)構(gòu)和生化特征的深入認(rèn)識，利用計算機程序?qū)蛐蛄羞M行搜索大大提高了miRNA的鑒定效率。人們設(shè)計了多種miRNA預(yù)測軟件，包括miRseeker，

36、snarloop，MirScan等。計算機預(yù)測法的主要依據(jù)包括以下三個方面：首先，發(fā)夾結(jié)構(gòu)是miRNA二級結(jié)構(gòu)的基本特性，幾乎所有的預(yù)測程序均將這一特征作為預(yù)測的首要標(biāo)準(zhǔn);其次，miRNA序列和結(jié)構(gòu)的保守性，這是區(qū)分miRNA候選基因和其它不相關(guān)發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列關(guān)鍵因素;最后，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的動力學(xué)穩(wěn)定性和序列、結(jié)構(gòu)的相似性等。各種預(yù)測軟件在預(yù)測依據(jù)上各有側(cè)重。MiRscan軟件就是利用預(yù)HYPERLINK/zt/show-1.htmlt_blank測序列與已知miRNA的相似性來鑒定潛在miRNA，并對保守發(fā)夾結(jié)構(gòu)進行分類，預(yù)測了多個C.elegans和人的新候選miRNAs，且通過實驗得到確認(rèn)。其次

37、是根據(jù)靶標(biāo)序列的保守性進行預(yù)測，靶標(biāo)的3UTRs都存在保守序列，而且這些保守序列能與miRNAsseed序列互補配對。最后，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性進行預(yù)測，利用這一特性能區(qū)別miRNAs和其它具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列。miRNAs折疊的自由能比tRNAS和rRNAs低。RNAz軟件為一款結(jié)合二級結(jié)構(gòu)的熱力學(xué)穩(wěn)定性和序列保守性開發(fā)的miRNA預(yù)測軟件。很多miRNAs以多拷貝或基因簇等形式存在于基因組中，因此利用已知miRNAs基因附近的序列來尋找潛在的miRNAs基因也是一個很有效的方法。但是，軟件分析法存在一個明顯的缺陷：目前對miRNAs的認(rèn)識還不足以到使用計算機可以精確鑒定miRNA的程度

38、。設(shè)置嚴(yán)格的檢測標(biāo)準(zhǔn)將降低預(yù)測的敏感性。而較寬松的標(biāo)準(zhǔn)則其準(zhǔn)確度會下降。其預(yù)測僅局限于在表型或序列保守的RNA，不能預(yù)測那些不具有保守性的稀有miRNA。miRNA實驗檢測與基因操控技術(shù)遺傳學(xué)策略(geneticmethod)遺傳學(xué)策略包括正向和反向遺傳學(xué)分析。把HYPERLINK/zt/inventory/351941.htmlt_blank突變的基因從產(chǎn)生非正常表型的生物體或者組織當(dāng)中分離出來進行研究鑒定，這種研究方式為正向遺傳學(xué)分析方法。第一個小非編碼RNA基因lin-4在線蟲中發(fā)現(xiàn)就是使用的這種方法。在研究時序發(fā)育混亂的HYPERLINK/zt/inventory/351941.htm

39、lt_blank突變體時，發(fā)現(xiàn)這種混亂是由于小非編碼RNA基因lin-4發(fā)生突變造成。然而miRNA分子序列短小，對不影響seed序列的突變具有“容忍性”，都給使用正向遺傳學(xué)方法研究miRNA帶來困難。反向遺傳學(xué)分析方法原理是在體外引入特定的突變，然后通過同型基因化或換位將突變基因?qū)胨拗黧w內(nèi)原來的位置，觀察表型的改變。在研究miRNAs的時候，反向遺傳學(xué)分析方法常常與HYPERLINK/reseach/xueke/t_blank生物信息學(xué)分析相結(jié)合，通過預(yù)測miRNA基因，然后引進突變，觀察表型?；蚪M實驗方法鑒定miRNA基因該方法需要制備小RNA的HYPERLINK/list-33.ht

40、mlt_blank文庫?，F(xiàn)今發(fā)展了多種HYPERLINK/list-32.htmlt_blank克隆小RNAs的實驗方法，不同的小RNAHYPERLINK/list-32.htmlt_blank克隆方法設(shè)計基本原理一致。首先將提取的總RNA通過變性PAGE膠電泳分離回收長度20-25nt的小RNA，接著分別將5和3端接頭結(jié)合于小RNA兩端，HYPERLINK/zt/experiment/rtpcr.htmlt_blankRT-HYPERLINK/list-13.htmlt_blankPCR擴增小RNA片段，獲得cDNA片段后克隆入HYPERLINK/zt/experiment/molecula

41、r/435808.htmlt_blank載體表達，構(gòu)建cDNAHYPERLINK/list-33.htmlt_blank文庫，再通過測序分析、同源性比對確定這些小RNA的來源。在合成cDNA的第一條鏈時，先將3端接頭接于小RNA上，為了避免小RNA和接頭的自身連接，連接之前對RNA進行去磷酸化處理，對3端接頭的3進行化學(xué)處理或在3端接頭的5末端加上一個腺苷酸，采用T4連接酶連接，不加入ATP，這樣就可以避免去磷酸化處理小RNA。3接頭連接之后可進行5接頭連接，連接之前最好先對其5磷酸化處理。部分?jǐn)U增測序是一種HYPERLINK/list-13.htmlt_blankPCR擴增技術(shù)，它使用一條部

42、分覆蓋miRNAs序列的引物，另一條引物為cDNA克隆的適配體。根據(jù)預(yù)測的miRNAs設(shè)計一段生物素標(biāo)記的寡聚核苷酸，再用這段核苷酸去捕文庫中同源的miRNAs，對被捕獲的cDNA進行擴增和測序。大量已知生物的高豐度和組成性表達miRNA基因都是通過這種直接克隆而獲得的。然而對于在生物體內(nèi)濃度很低的miRNA，直接克隆法成效較差。miRNA表達水平的定量研究如果某種miRNA在某種特定組織、細(xì)胞或者某個發(fā)育階段中特異性表達，說明此miRNA可能在其中發(fā)揮某種調(diào)控作用;要了解miRNA在機體中時間、空間的表達情況及其在機體生理、病理過程中所發(fā)揮的作用，必須有合適的方法檢測miRNA的表達水平，在

43、此基礎(chǔ)上開展更深入的功能研究。現(xiàn)階段檢測miRNA的表達水平的方法主要包括基于核苷酸雜交和基于PCR的miRNA檢測方法?；贖YPERLINK/zt/dna/tanzhen.htmlt_blank探針雜交技術(shù)的miRNA檢測方法是一種直接檢測法，不需要對樣本RNA進行預(yù)擴增，包括RNA印跡技術(shù)、HYPERLINK/zt/experiment/222145.htmlt_blank原位雜交技術(shù)、微陣列技術(shù)和基于微球的流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)。RNA印跡技術(shù)是檢測RNA的經(jīng)典方法?；驹砣缦拢菏紫仍谳d體(如硅片、微球或膜等)上固定miRNA樣本，再與經(jīng)過標(biāo)記的HYPERLINK/zt/dna/tanzh

44、en.htmlt_blank探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進行信號檢測;也可以在載體上先固定與靶miRNA序列互補的DNA探針，然后與經(jīng)過標(biāo)記的樣本miRNA雜交，再進行信號檢測。信號標(biāo)記的方法包括同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和納米金標(biāo)記等。HYPERLINK/zt/experiment/222145.htmlt_blank原位雜交技術(shù)能夠顯示miRNA表達的位置，尤其適用于石蠟包埋或福爾馬林固定后的標(biāo)本，LNA特異的構(gòu)造使其具有更強的雜交特性和敏感性選擇性，用于原位檢測miRNA是最理想的選擇。微陣列技術(shù)(microarray)也稱生物芯片、特點是HYPERLINK/zt/show-1.htmlt_

45、blank高通量，現(xiàn)今廣泛應(yīng)用于功能miRNA的初步篩選?；谖⑶虻牧魇郊?xì)胞術(shù)(bead-basedflowcytometry)是一種液相HYPERLINK/zt/dna/chip.htmlt_blank芯片技術(shù)，該方法將流式細(xì)胞檢測與HYPERLINK/zt/dna/chip.htmlt_blank芯片技術(shù)有機地結(jié)合起來，兼有通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點。miRNA僅為22nt左右，相當(dāng)于一個引物的長度，基于PCR基礎(chǔ)上的miRNA檢測方法需通過接頭增加miRNA的長度來使miRNA適于PCR擴增檢測，包括有莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loopRT-PCR)法、RN

46、A加尾和引物延伸RT-PCR法等?；跀U增反應(yīng)的方法還包括滾換擴增法(RCA)，引物浸入法(Invader)，測序法等。(1)HYPERLINK/experiment/blotting/list_91_1.htmlt_blankNorthern雜交為最經(jīng)典的檢測真核生物RNA大小，估計其豐度的實驗方法。待測樣本經(jīng)變性HYPERLINK/zt/experiment/page.htmlt_blank凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、烘干等步驟，使RNA牢固地結(jié)合在膜上。將膜與標(biāo)記好的變性RNA探針雜交、洗膜、顯影后對條帶進行光密度掃描，根據(jù)條帶分子大小以及密度確定miRNA表達量。但Northern技術(shù)過程煩瑣，操

47、作費力，對RNase污染非常敏感，更有難于檢出表達量很低的miRNA的缺點。(2)miRNA表達譜芯片原理同樣是使用標(biāo)記探針檢測固相支持物上的目標(biāo)分子。通過設(shè)計芯片上miRNA基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)miRNA的表達水平。HYPERLINK/zt/dna/3782.htmlt_blank基因芯片具有高通量的優(yōu)點，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達。Luminex公司研制的液相芯片(Liquidchip)又稱多功能懸浮點陣(Multianalytesuspensionarray，MASA)，是出的新一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固

48、定有不同的探針分子，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標(biāo)記探針的球形基質(zhì)都帶有一個獨特的色彩編號，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對同一個微量樣本中的多個不同分子同時進行快速的定性、定量分析，這種檢測技術(shù)被稱為FMAP(Flexiblemultianalyteprofiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進行，檢測速度極快。(3)核酶保護分析技術(shù)(RPA)miRNA的檢測還可以采用核酶保護分析技術(shù)，將標(biāo)記好的探針和待測RNA樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護的RNA分子，最后通過變性HYPERLINK/zt

49、/experiment/page.htmlt_blankPAGE電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。(4)RAKE法RAKE法(RNAprimedarraybasedKlenowemzyme)是在miRNAmicroarray的基礎(chǔ)上利用HYPERLINK/zt/dna/2339.htmlt_blankDNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA與固定的DNA探針雜交的方法。RAKE可以敏感特異地檢測miRNA，適用于大量快速的篩選所有己知的miRNA。能夠在特定的細(xì)胞和腫瘤中檢測miRNA表達譜情況。不僅如此，RAKE法還可以從由

50、福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出miRNA并對其進行分析，為從存檔標(biāo)本中分析miRNA開啟了希望之門。(5)原位雜交(insituhybridization)原位雜交技術(shù)可直觀了解miRNA表達方式，是觀測miRNA時空表達的一種較簡便的方法，常標(biāo)記方式包括地高辛、生物素、熒光標(biāo)記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(LockedNucleicAcid(LNA)basedinsituhybridization(LNA-ISH)是當(dāng)前應(yīng)用較多的探針方式。(6)實時HYPERLINK/zt/experiment/219742.htmlt_blank熒光定量PCR技術(shù)(Real-timePCR，RT-

51、PCR)熒光檢測HYPERLINK/zt/product/pcryi.htmlt_blankPCR儀可對整個PCR過程中擴增序列的累積速率繪制動態(tài)變化曲線。在反應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的PCR循環(huán)數(shù)(一般用特定閾值循環(huán)數(shù)Ct來表達)越少。由于miRNA長度僅為22nt，傳統(tǒng)的qRT-PCR不適合擴增如此短的片段?，F(xiàn)今有幾種用于miRNA的實時定量PCR方法，只簡要介紹一下頸環(huán)法。頸環(huán)法是一種理想的miRNA檢測qRT-PCR方法：首先設(shè)計特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測miRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，該cDNA一端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了c

52、DNA的長度，隨后以合成的cDNA為模板設(shè)計引物進行實時定量PCR擴增。qRT-PCR具有特異性高、靈敏度好、快速簡單等多種優(yōu)點。(7)基于padlock探針和滾環(huán)擴增的miRNA檢測系統(tǒng)Padlock探針是線性的DNA探針，其末端序列分別可以和miRNA的兩端互補雜交。在合適的條件下，當(dāng)其與RNA模板匹配時，當(dāng)padlock探針與靶miRNA雜交時,HYPERLINK/zt/dna/164670.htmlt_blankDNA連接酶將padlock探針的3和5末端連接成環(huán)，其中miRNA模板隨后用作滾環(huán)擴增的引物,從而實現(xiàn)了對目標(biāo)序列的線性擴增。padlock探針技術(shù)不需要特殊的設(shè)備，可以對納

53、克級總RNA中的miRNA進行檢測和量化。(8)克隆測序法大部分已知的miRNA都是通過cDNA克隆測序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建miRNA的cDNA文庫，再進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物隨后克隆到表達載體上測序。Takada開發(fā)了一種改進的擴增克隆法(miRNAamplificationprofiling，mRAP)，mRAP法先在miRNA的3端連上接頭，然后用與接頭互補的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因為特定的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會連接到反轉(zhuǎn)錄出的cDNA鏈的3末端。當(dāng)5端接頭與cDNA鏈的poly(C)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實現(xiàn)對cDNA的

54、PCR擴增。由于mRAP高度靈敏，可以直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中miRNA的表達量。標(biāo)簽序列克隆法是一種在在基因表達系列分析(SAGE)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測效率更高的miRAGE(miRNASAGE)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個測序反應(yīng)可檢測多個miRNA，明顯提高了檢測效率。新一代大規(guī)模測序技術(shù)包括焦磷酸測序技術(shù)、Solexa合成測序技術(shù)和SOLID連接測序技術(shù)等，能在一次測序過程中對幾百萬個樣本進行同時測序，極大提高了測序效率。這類大規(guī)模測序技術(shù)極大的提高了多個物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有miRNA的序列信息，解密miRNAHYPERLINK/gnjz/gene

55、/t_blank圖譜提供了保證。miRNAs靶標(biāo)的預(yù)測和鑒定絕大多數(shù)的miRNAs通過堿基配對的方式結(jié)合到靶mRNA的3UTR，通過抑制靶基因的翻譯達到調(diào)控基因表達的目的，因此miRNA靶標(biāo)的鑒定對研究miRNA的功能至關(guān)重要。新miRNA發(fā)現(xiàn)的速度相對其功能研究要快的多。到目前為止，已經(jīng)有15172條miRNA被收錄，但是其功能研究進展相對緩慢。阻礙miRNA功能研究進展的主要原因是：miRNAs與其靶基因并非完全匹配，這給篩選miRNA靶基因帶來難度;而當(dāng)前缺乏高通量的實驗技術(shù)是阻礙miRNA靶標(biāo)鑒定進程的主要因素。miRNA與其靶基因間存在如下重要特征：靶基因3UTR區(qū)具有與miRNA5

56、端至少7個連續(xù)核苷酸的完全配對區(qū)域(2-8nt)，miRNA的該部分序列稱為“種子”序列;mRNA與miRNA種子序列互補的區(qū)域在物種中經(jīng)常具有保守性。研究人員根據(jù)對miRNA及其靶mRNA特征的認(rèn)識，開發(fā)了相應(yīng)的計算機軟件推斷miRNA的靶基因。但多種因素影響了靶標(biāo)預(yù)測的效率。miRNA靶標(biāo)預(yù)測高效性影響因素最初的幾個miRNAs(如let-7和lin-4)的靶標(biāo)鑒定出來后，研究人員意識到miRNA與靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的3UTRs互補配對，認(rèn)為可以根據(jù)靶標(biāo)和miRNA互補配對這一特點設(shè)計計算機程序進行靶標(biāo)篩選。但是實踐操作過程中，只依據(jù)靶標(biāo)和miRNA互補配對這一原則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，篩選的效率還受以下幾個

57、方面因素的制約：第一，植物的miRNA與靶標(biāo)基因幾乎完全配對結(jié)合，靶標(biāo)基因的鑒定相對容易，但在動物中，miRNA與靶基因mRNA以不完全堿基互補配對結(jié)合于3UTRs，給通過序列相似性來鑒定動物體內(nèi)的miRNA結(jié)合位點帶來了相當(dāng)?shù)睦щy。第二，miRNAs是序列短小的小分子，與3UTRs結(jié)合的方式存在多樣性，結(jié)合位點除了配對區(qū)還存在突環(huán)和錯配區(qū)，一般的分析工具只對配對區(qū)較長，突環(huán)和錯配區(qū)很少的靶標(biāo)鑒定相對效率較高。第三，miRNAs存在2-7nt(seed區(qū))與靶標(biāo)精確的配對，如果忽略GC含量進行大規(guī)模seed區(qū)與已有物種的全基因組序列配對，在基因組中六個堿基隨機出現(xiàn)的幾率相對較高，預(yù)測出的靶標(biāo)假

58、陽性現(xiàn)象嚴(yán)重。第四，盡管現(xiàn)在很多生物的全基因組序列測序工作已經(jīng)完成，但是對3UTRs堿基序列、座位、剪接多態(tài)性認(rèn)識尚淺，這也給miRNA靶基因的預(yù)測帶來困難。第五，在進化過程中物種間的3UTR序列相當(dāng)保守，雖然靶標(biāo)預(yù)測過程中排除那些不具有保守序列的靶標(biāo)能降低假陽性概率，但3UTR序列保守性也不是絕對的，排除所有不保守序列降低了預(yù)測的靈敏度。miRNA預(yù)測原則和軟件介紹通過實驗方法確定miRNAs的作用靶標(biāo)非常耗時，尚無高通量的靶標(biāo)鑒定方法。因此，雖然靶基因鑒定存在上述多種困難，通過理論方法預(yù)測miRNAs的作用靶標(biāo)依舊是當(dāng)前篩選和識別miRNAs靶標(biāo)的較為理想的途徑。一般情況下，用于miRNA

59、靶基因預(yù)測的軟件遵循如下幾個原理：1序列互補性：位于miRNA5端所謂種子序列(第2-7nt)與靶基因3UTR可形成Watson-Crick配對是所有miRNA靶基因預(yù)測的最重要因素。配對包括如下幾種形式：多數(shù)情況下為7nt匹配：第2-7nt與靶基因呈互補配對，外加在靶基因?qū)?yīng)miRNA第一位核苷酸處為A(7mer-1Asite)，或是miRNA第2-8nt與靶基因完全配對(7mer-m8site);而對于miRNA第2-8nt與靶基因完全配對，且外加靶基因?qū)?yīng)miRNA第一位核苷酸處為A(8mersite)這種類型，其特異性更高;對于僅miRNA第2-7核苷酸與靶基因完全配對(6mersit

60、e)這種方式，其用于搜索靶基因的敏感性更高，特異性相應(yīng)下降。另外，還有種子序列外的3supplementarysite和3complementarysite兩種形式。2序列保守性及其它因素：除了序列互補性外，靶基因預(yù)測較關(guān)注的還包括序列保守性、熱動力學(xué)因素、位點的可結(jié)合性(accessibility)和UTR堿基分布等多個因素。序列保守性：miRNA結(jié)合位點在多個物種之間如果具有保守性，則該位點更可能為miRNA的靶位點。熱動力學(xué)因素：miRNA:target對形成的自由能，自由能越低，其可能性越大。位點的可結(jié)合性(accessibility)：mRNA的二級結(jié)構(gòu)影響與miRNA的結(jié)合形成雙鏈