醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱(共6頁(yè))

1、醫(yī)學(xué)(yxu)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的操作(cozu)與使用3學(xué)時(shí)(xush)實(shí)驗(yàn)二 有絲分裂3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)三 雞血細(xì)胞融合3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)二 有絲分裂【目的要求】掌握動(dòng)、植物細(xì)胞有絲分裂過(guò)程各期的特點(diǎn)及主要區(qū)別。掌握有絲分裂標(biāo)本臨時(shí)壓片技術(shù)?！緦?shí)驗(yàn)原理】細(xì)胞經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)和分裂而完成增殖的全過(guò)程稱(chēng)細(xì)胞增殖周期。不同分裂方式的細(xì)胞其增殖周期表現(xiàn)形式不同。無(wú)絲分裂是低等生物增殖的主要方式，由于其過(guò)程簡(jiǎn)單而迅速，沒(méi)有染色體組裝、紡錘體形成等一系列變化，故又稱(chēng)直接分裂。在高等動(dòng)物體內(nèi)可發(fā)生在某些迅速增殖的組織f如口腔上皮)、體外培養(yǎng)細(xì)胞，創(chuàng)傷修復(fù)、病理性代償組織(傷口附近、炎癥)中。有絲分裂是高等生物

2、體細(xì)胞增殖的主要方式，由于其過(guò)程較為復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列復(fù)雜的絲狀結(jié)構(gòu)(jigu)變化(染色體組裝、有絲分裂器的形成)后，細(xì)胞才進(jìn)行分裂，故又稱(chēng)為間接分裂。【實(shí)驗(yàn)(shyn)用品】器材(qci)：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、眼科鑷、培養(yǎng)皿、刀片。試劑：Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3：1)，70乙醇溶液，1molL HCl苯酚品紅染液。標(biāo)本：馬蛔蟲(chóng)子宮切片、洋蔥根尖縱切片。材料：洋蔥根尖或水仙根尖?！緝?nèi)容與方法】動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂觀察標(biāo)本制備：馬蛔蟲(chóng)子宮石蠟切片，鐵蘇木精染色。觀察：先在低倍鏡下觀察。在馬蛔蟲(chóng)子宮切面上可見(jiàn)子宮腔內(nèi)有許多近圓形的受精卵細(xì)胞，大多處于不同的分裂時(shí)期。每個(gè)受精卵細(xì)胞

3、外均圍有一層厚的受精卵膜，它與受精卵細(xì)胞間的空隙為圍卵腔。在有些受精卵細(xì)胞外表面或受精卵膜內(nèi)可見(jiàn)有極體附著。注意在切片標(biāo)本的幾個(gè)子宮切片中尋找和觀察處于間期和有絲分裂不同時(shí)期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察它們的形態(tài)變化(圖6-2)。間期(interphase)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有兩個(gè)近圓形的細(xì)胞核，二為雌原核，一為雄原核。兩個(gè)原核形態(tài)相似，不易分辨。細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜完整，細(xì)胞核附近胞質(zhì)中有中心體(central body)存在。前期(prophase)：雌雄原核相互靠近，核仁(nucleolus)消失，染色質(zhì)逐漸濃縮成扭曲細(xì)絲狀染色絲(chromatin fiber)，進(jìn)一步縮短變粗，形成

4、短棒狀染色體(chromosomc)。前期核膜消失，兩對(duì)中心粒(centri0le)分離，周?chē)霈F(xiàn)星射線(xiàn)并分別向細(xì)胞的兩極移動(dòng)。中期(metaphase)：染色體排列在細(xì)胞中央，形成赤道板(equatorialplate)。由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀兩種不同圖像。側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個(gè)中心體，其周?chē)行巧渚€(xiàn)。中心體之間紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)相連，這些結(jié)構(gòu)總稱(chēng)為有絲分裂器。極面觀可見(jiàn)六條染色體平排于赤道面上，此時(shí)染色體已縱裂為二，但尚未分離。后期(anaphase)：縱裂后形成的子染色體在紡錘絲的牽引下分別向兩極(lingj)移動(dòng)，成為相等的兩群。細(xì)胞拉長(zhǎng)，中部的細(xì)胞

5、膜開(kāi)始凹陷。末期(telophase)：兩極的子染色體逐漸解體、模糊，變成染色質(zhì)態(tài)。核膜、核仁也相繼重新出現(xiàn)，紡錘絲星射線(xiàn)消失，細(xì)胞膜的凹陷加深，最后(zuhu)橫縊成兩個(gè)子細(xì)胞。植物(zhw)細(xì)胞有絲分裂觀察洋蔥根尖縱切片的觀察標(biāo)本制備：洋蔥根尖石蠟縱切片，鐵蘇木精染色。觀察：取洋蔥根尖縱切片標(biāo)本在低倍鏡下觀察，洋蔥根尖由尖端向上可分為三個(gè)區(qū)域。根冠區(qū)：位于尖端，細(xì)胞排列較疏松的區(qū)域。生長(zhǎng)區(qū)：位于根冠區(qū)上方，細(xì)胞方形或扁方形，排列緊密，細(xì)胞有強(qiáng)烈的分裂增生能力，大都處于分裂期的各個(gè)不同時(shí)期。延長(zhǎng)區(qū)：位于生長(zhǎng)區(qū)上方，細(xì)胞延長(zhǎng)成長(zhǎng)方形，細(xì)胞多處于分裂間期。先在低倍鏡下找到生長(zhǎng)區(qū)，換高倍鏡觀察，辨

6、認(rèn)處于不同分裂時(shí)期的細(xì)胞。間期：細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核形態(tài)明顯，核內(nèi)可見(jiàn)l一2個(gè)染色很深的核仁。前期：核膨大，核膜破裂，核仁逐漸消失，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮成纖細(xì)的染色絲并逐漸縮短變粗，形成染色體。中期：染色體排列在細(xì)胞中央平面上(赤道部)形成赤道板(洋蔥染色體為16條)，染色體己縱裂成兩條染色單體，但依然由一個(gè)著絲粒相連。細(xì)胞兩極出現(xiàn)紡錘絲，部分紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)(kinetochore)后期：著絲?？v裂，染色體分為相等的兩群，在紡錘絲的牽引下移向兩極。末期：移到兩極的染色體解旋、伸長(zhǎng)變細(xì)成為染色絲，最后形成染色質(zhì)。核膜、核仁重新出現(xiàn)，紡錘體消失。細(xì)胞中央赤道部由紡錘體微管等形成成膜體(phr

7、agmoplast)，由它再融合成細(xì)胞板(cell plate)，進(jìn)而形成細(xì)胞壁，形成兩個(gè)子細(xì)胞。洋蔥根尖(或水仙根尖)臨時(shí)壓片觀察(1)標(biāo)本制備：1) 取材：培養(yǎng)洋蔥(或水仙)，取根尖，將其浸入Carnoy固定液2h以上。然后保存在70乙醇溶液中(可長(zhǎng)期保存)。軟化：觀察前取出根尖，浸在lmolL HCl溶液中軟化5一lOmin，水洗3次。3) 染色：將以上處理的根尖放在滴有一滴苯酚品紅染液的載玻片上，用眼科(yn k)鑷搗碎根尖，稍停片刻后，蓋上蓋玻片。壓片：輕壓蓋玻片，把材料(cilio)壓成均勻的薄層。用吸水紙吸干蓋片周?chē)娜疽骸?2)觀察：先用低倍鏡尋找壓片中處于分裂期的細(xì)胞。然后在

8、高倍鏡下觀察不同(b tn)分裂期的細(xì)胞。染色質(zhì)和染色體被染成紫紅色，細(xì)胞質(zhì)不著色。各期細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)同上?！咀鳂I(yè)】書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，簡(jiǎn)述制各根尖臨時(shí)壓片步驟，并繪圖記錄洋蔥根尖有絲分裂各期細(xì)胞。繪制馬蛔蟲(chóng)受精卵有絲分裂各期細(xì)胞?！舅伎碱}】簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞有絲分裂有何異同?！驹噭┡浞健勘椒悠芳t：融化的石炭酸25ml加入50ml 95乙醇溶液中，5g堿性品紅溶解于其中，充分溶解后過(guò)濾，4C保存。使用時(shí)用蒸餾水稀釋至500ml，成熟1周。實(shí)驗(yàn)三 雞血細(xì)胞的融合兩個(gè)以上細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞，稱(chēng)為細(xì)胞融合(cell fusion)。細(xì)胞融合包括質(zhì)膜的連接與融合，胞質(zhì)合并，細(xì)胞核、細(xì)胞器和酶等互

9、成混合體系。20世紀(jì)60年代初期，病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)的出現(xiàn)，開(kāi)創(chuàng)了人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新領(lǐng)域。70年代后，逐漸使用化學(xué)融合劑，它使用方便，活性穩(wěn)定，容易制備和控制，目前已成為人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要手段。80年代初,出現(xiàn)了電融合技術(shù)，它具有可控、高效、無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)，并逐漸應(yīng)用于科學(xué)研究。細(xì)胞融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)的研究。例如，細(xì)胞周期調(diào)控的研究，基因互補(bǔ)分析、檢測(cè)病毒，細(xì)胞對(duì)病毒敏感因素的分析、腫瘤細(xì)胞惡性分析等等。單克隆抗體技術(shù)就是通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的，對(duì)生命科學(xué)的研究及醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用產(chǎn)生了重大影響。本實(shí)驗(yàn)主要介紹化學(xué)融合劑聚乙二醇(polyethylene

10、glycol，PEG)介導(dǎo)的細(xì)胞融合。目的要求了解(lioji)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的基本原理。通過(guò)PEG誘導(dǎo)的雞紅細(xì)胞之間的融合實(shí)驗(yàn)，初步掌握(zhngw)細(xì)胞融合技術(shù)。實(shí)驗(yàn)(shyn)原理PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結(jié)合,在高濃度(50)的PEG溶液中自由水消失，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，引起細(xì)胞融合。為了發(fā)揮PEG促進(jìn)細(xì)胞融合的效力，必須采用較高濃度的PEG溶液，但在高濃度PEG溶液下，細(xì)胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時(shí)間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)材料為雞紅細(xì)胞，其核結(jié)構(gòu)緊密，易于觀察。實(shí)驗(yàn)用

11、品 (1)器材：離心機(jī)、顯微鏡、天平、水浴鍋、計(jì)數(shù)板、滴管、離心管、容量瓶、廣口瓶、細(xì)口瓶、燒杯、注射器、蓋玻片、載玻片。(2)試劑：Alsever溶液、GKN溶液、0.85%鹽水、雙蒸水、Jenus green染液、50PEG。 試劑配制： 1)Alsever溶液：葡萄糖2.05g,，檸檬酸鈉0.80g, NaCl 0.42g，溶于100ml雙蒸水中。 2)0.85生理鹽水。3)GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.40g，Na2HPO42H2O 1.77g，NaH2PO4H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅(phenol red) 0.01g，溶于1000ml雙蒸水中。4)Janus g

12、reen染液。5)50PEG溶液：稱(chēng)取一定量PEG(WM4000)放入燒杯，沸水浴加熱，使之熔化，待冷卻至50時(shí)，加入等體積預(yù)熱至50的GKN溶液，混勻，置37備用。（3）材料：成年雞。方法與步驟(1) 注射器內(nèi)先吸入2m1 A1sever溶液，從雞翼下靜脈取2m1雞血，注入離心管，再加入6ml Alsever溶液，使之成為14懸液。(2) 取l ml雞血懸液，加入4 m1 0.85生理鹽水，混勻平衡后，800 r/min離心3min，棄去上清液，再按上述條件離心2次。最后，棄去上清液，加GKN液4m1，離心1次。(3) 棄去上清液，加GKN液（體積比19），制成10細(xì)胞懸液。 (4) 取以上

13、懸液以血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，若細(xì)胞密度過(guò)大，用GKN溶液稀釋至(34)10個(gè)/m1。(5) 取以上細(xì)胞懸液1ml于離心管，放入37(39左右更佳)水浴鍋中預(yù)熱。同時(shí)將 50 PEG液放入水浴鍋中預(yù)熱。(6) 待溫度恒定后，在1ml細(xì)胞懸液中慢慢逐滴加入0.5m1 50PEG溶液(rngy)(慢慢沿離心管壁流下融合劑)，且邊加邊搖勻，然后放入水浴鍋中。(7) 細(xì)胞融合一段時(shí)間(2030min)后，加入GKN溶液(rngy)至8m1，靜止于水浴鍋中20min左右。(8)取出離心管，800r/min離心3min，使細(xì)胞完全沉降(chnjing)。棄去上清液，加GKN溶液，再離心1次。(9)棄去上清液，加入少量GKN溶液，混勻，取少量懸液于載玻片上，加入Janus green染液，用牙簽攪勻，3min后蓋上蓋玻片，觀察細(xì)胞融合情況。觀察與結(jié)果(1)在顯微鏡下，觀察細(xì)胞融合情況，計(jì)算融合率。(2)融合率視野內(nèi)發(fā)生融合的細(xì)胞核總數(shù)視野內(nèi)所有細(xì)胞核總數(shù)100作業(yè)1書(shū)寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，并計(jì)算融合率。 2繪