實驗二(研究生分生)

1、實驗二 總RNA提取、RT-PCR制備cDNA及DNA克隆Total RNA Preparation,cDNA preparation by RT-PCR,and DNA cloning1實驗二和實驗三是以獲取純化的表達蛋白質(zhì)為目的，從RNA提取開始，經(jīng)過RT-PCR獲取特定基因的cDNA片斷，再進行重組、篩選獲取克隆，最后進行基因編碼蛋白質(zhì)的表達、純化、和檢測。2第一天1.小鼠腦總RNA的提??；2. RNA含量測定；3. RT-PCR4.載體酶切3第二天1.瓊脂糖凝膠電泳檢測檢查RNA及PCR產(chǎn)物；2. RT-PCR產(chǎn)物的純化；3. PCR產(chǎn)物的快速酶切；4.載體及PCR酶切產(chǎn)物的乙醇沉淀純

2、化；5.瓊脂糖凝膠電泳檢測檢查載體及PCR酶切狀況，DNA濃度的微量測定；6.連接反應4第三天1.感受態(tài)細菌的制備；2.細菌轉化5從組織中一步法分離總RNATotal RNA isolation from tissues by One-Step RNA Purification Method 1、取小鼠，斷頸處死，用剪刀沿小鼠枕骨斷開小鼠頸椎，露出枕骨大孔，然后從枕骨大孔分別向兩側剪開小鼠顱骨，用鑷子小心向上掰開頂骨，取出暴露的大腦。 （取出肝臟-20 凍存）實驗步驟：第一天6 2、玻璃勻漿器中加入4ml的RNAiso試劑置冰上待用。 3、立即取出腦組織，移入玻璃勻漿器中，立即在冰浴中上下研磨

3、十次左右進行勻漿。 4、然后將勻漿液平均轉移入4只2ml離心管中，室溫靜置5分鐘。第一天7 5、加入0.4ml氯仿，蓋緊管口，用力顛倒離心管3-5次進行混合，室溫再靜置5min后。 6、12000rpm 4離心10min；用移液器將上層水相分別轉移入1.5ml離心管，每只600L。 7、加入600L異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置5-10min，15000rpm 離心5min。第一天8 8.用移液器將上清去凈后，加入1mL DEPC處理過的75%乙醇，振蕩片刻，再于15000rpm離心5min；再次去凈上清，敞口室溫靜置5-15min，待RNA沉淀略干。 9.每管中加入DEPC處理過的蒸餾水100L

4、溶解RNA， 4保存?zhèn)溆谩?第一天9RNA含量的紫外分光光度計測定Determination of RNA contents by UV-Spectrometer 操作：取兩只比色杯，一只加入1470L DEPC處理過的蒸餾水，再加入30L RNA液；一只加入1.5mL DEPC處理過的蒸餾水混勻后置紫外分光光度計中，分別測定其在260nm和280nm的光吸收值，計算出二者的比值與RNA溶液濃度。 第一天10一步法RT-PCR制備cDNAcDNA Preparation by One-Step RT-PCRRT-PCR采用一步RT-PCR試劑盒（TransGen Biotech)每組取一薄壁反

5、應管（200 uL）ComponentsVolumeRNA TemplateX uL（5ug）Forward Primer1 uLReverse Primer1 uL2HiFi PCR SuperMix 25 uLOne-step Enzyme Mix1 uLRNase-free Waterto 50uL反應體系：第一天11反應條件45 30min 水浴箱PCR儀94 2min94 30sec55 30sec 進行30次循環(huán)72 180sec72 5min第一天12載體DNA的酶切取1.5ml離心管，按下列表中所列加入組分： 1 載體DNADNA溶液（l ） 20 10 X 緩沖液 5 dH2

6、O 23 混勻后分別加入相應的酶Bam HI (GGATCC) 1 CIAP 1 混勻，37溫浴 過夜 第一天13第二天用移液器將PCR反應液40 L轉移入一只1.5mL離心管中，用于純化。在PCR反應管中加入適量10 X 上樣液（約1 L），用于電泳檢測。14瓊脂糖凝膠電泳Agarose Gel Electrophoresis 1、瓊脂糖膠模的準備： 2、樣品準備：向每一只樣品管中加入9 uL樣品、1 uL 10 X 上樣液，混勻備用。第二天MRNAPCR第一組第二組第三組第四組15PCR產(chǎn)物（DNA）的純化Purification of PCR product1.向裝有PCR反應液的1.5

7、mL離心管中加入5倍體積（200 L）Binding Solution B, 上下顛倒混勻。2.將混合液轉移到套放收集管的GenClean柱中，室溫放置2min,于8000rmp離心1min。第二天163.取下GenClean柱，倒掉收集管中的廢液。4.將GenClean柱重新放回收集管中，加入500 L Wash Solution，于12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。5.重復步驟4一次。第二天17 6.將GenClean柱重新放回收集管中，于12000rpm離心1min，以徹底去除Wash Solution。（開蓋室溫放置10min，將有助于Wash Solution中的乙醇

8、揮發(fā)干凈）18 7.將GenClean柱放入干凈的1.5mL離心管中，在GenClean柱吸附膜中央小心加入60 L Elution Buffer，37放置2min備用。（將Elution Buffer加熱至65 將提高洗脫效率）19PCR產(chǎn)物的限制酶切 Restriction Digestion of DNA取1.5ml離心管，按下列表中所列加入組分： 2 PCR產(chǎn)物DNA溶液（l ） 43 10 X 緩沖液 5 dH2O - 混勻后分別加入相應的酶Bam HI (GGATCC) 2 混勻，37溫浴 10min 第二天20DNA的乙醇沉淀純化Purification of DNA by ac

9、hohol precipitation 向酶切反應管（載體及PCR)中加入50L TE，然后加入100L苯酚/氯仿，于振蕩器上振蕩10sec，然后15000rpm離心5min，將上層水相移入一只新離心管。第二天21再加入1/10體積（10L）的 3M NaAc和2倍體積（220L）的無水乙醇，混勻后于15000rpm離心10min；去上清后，加1mL 75%乙醇，再次離心1min，用移液器去凈上清，將離心管敞口于室溫靜置5-15min干燥，然后加入20L TE緩沖液溶解DNA。 第二天22電泳法微量DNA定量分析 電泳方法同前，將膠中樣品DNA區(qū)帶的亮度與同一膠中標準DNA（Marker）的各

10、區(qū)帶的亮度相比較，就可以估算出樣品區(qū)帶中的DNA含量。每一只樣品管中加入5 uL樣品、0.5uL 10 X 上樣液，混勻備用。MVectorPCR第一組第二組第三組第四組第二天23DNA的重組連接 DNA Ligation 取一只1.5mL離心管，加入100ng 酶切PCR產(chǎn)物，100ng 酶切載體DNA和2L10 X 連接反應液，再加水至20L；混勻后，加入1U的T4 DNA連接酶，混勻后16保溫4hr以上，然后4保存。 第二天24感受態(tài)細菌制備 Preparation of Competent Bacteria 1、細菌劃盤培養(yǎng)：取一不含抗菌素的LB培養(yǎng)皿，將接種環(huán)于酒精燈上燒灼滅菌，冷卻

11、后蘸取菌種于培養(yǎng)基上劃線，然后將培養(yǎng)皿倒扣置37溫箱中過夜培養(yǎng)，第二天早上取出置室溫待用。第三天25 2、細菌過夜液態(tài)培養(yǎng)：第二天下午5點左右，取經(jīng)過高壓消毒的MA培養(yǎng)液10mL移入一100mL容積的三角燒瓶，加四環(huán)素至終濃度為10ug/mL；用200ml移液器從培養(yǎng)皿上取一個菌落接種于其中，37230rpm振搖過夜。第三天26 第三天，將100l過夜培養(yǎng)的菌液轉移入10ml SOB培養(yǎng)液中，繼續(xù)于37oC 230rpm振搖培養(yǎng)3-4hr，至菌液的OD600nm=0.4-0.6（細菌的指數(shù)生長期）。第三天27 3、感受態(tài)細菌制備： 取一1.5mL離心管（分別標記為管1、2），各加入1.4mL培

12、養(yǎng)細菌，冰浴中冷卻10min后于415000rpm離心1min，去凈上清，加入0.4ml感受態(tài)制備液A，上下吹吸懸浮細菌，然后置冰浴中15min；第三天284，15000rpm離心1min，去凈上清，加入100L感受態(tài)制備液B，上下吹吸懸浮細菌，加入1L的1.4M巰基乙醇，混勻后置冰浴待用10min待用第三天29細菌轉化 Transformation of Bacteria 1、向感受態(tài)細菌管1中加入5L連接反應液，向感受態(tài)細菌管2中加入1ng 的質(zhì)粒DNA，混勻后置冰浴中靜置30-45min；然后移入42熱休克處理1.5min；再移入冰浴靜置2-5min。 2、向各管中加入900L SOC培

13、養(yǎng)液，顛倒混勻，置37保溫60min，每15min顛倒混勻一次。第三天30 3、鋪盤： 對應于每一轉化反應取兩個含抗生素的MA培養(yǎng)皿，標記上組號和反應號，先將全部培養(yǎng)液轉移入一培養(yǎng)皿，然后使其均勻分布于全平皿，再傾斜吸出多余的菌液移入第二個平皿中，同樣處理使菌液均勻分布于培養(yǎng)皿上。第三天31 4、過夜培養(yǎng)： 將第一個培養(yǎng)皿倒扣，第二個培養(yǎng)皿正置于37溫箱中過夜培養(yǎng)。第二天，取出培養(yǎng)皿，挑選菌落進行培養(yǎng)、提取DNA、和篩選；或者用封口膜封住培養(yǎng)皿，置4可以保存1-2星期。第三天32相關實驗原理 RNA提取RNA酶易復活，不易徹底去除，使RNA極易降解。因此，在提取、保存、使用RNA的過程中，必須

14、時刻注意防止RNA酶污染問題。33一般采取預防為主的措施，所有與RNA接觸的試劑、器材都需要去RNA酶處理。一般金屬、玻璃制品可以于160oC加熱2-6小時；塑料制品可以用氯仿、過氧化氫、DEPC處理；試劑和水可以用DEPC處理，然后再高壓消毒除去殘留的DEPC。此外，在操作方面需要注意快捷，尤其要縮短從處死動物到RNA提取開始這段時 34Total RNA 電泳照片35RT-PCR36DNA瓊脂糖凝膠電泳實驗原理 DNA電泳是基因工程中最基本的技術，DNA制備及濃度測定、目的DNA片段的分離，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。根據(jù)分離的DNA大小及類型的不同，DNA電泳主要分兩類： （1）聚

15、丙烯酰胺凝膠電泳適合分離1kb以下的片段，最高分辨率可達1bp，也用于分離寡核苷酸，在引物的純化中也常用此中凝膠進行純化，也稱PAGE純化。 37（2）瓊脂糖凝膠電泳可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠濃度為0.50.6%的凝膠可以分離的DNA片段范圍為20bp50kb。電泳結果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外下觀察，并且可觀察的DNA條帶濃度為納克級，而且整個過程一般1小時即可完成。由于該方法操作的簡便和快速，在基因工程中較常用。38瓊脂糖凝膠 瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1，3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4連接的3，6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對分子量為104105的長鏈。瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機線