抗原致敏樹突狀細胞誘導(dǎo)CIK對胃癌細胞殺傷作用的研究

1、抗原致敏樹突狀細胞誘導(dǎo)CIK對胃癌細胞殺傷作用的研究胡廷輝應(yīng)敏剛鄭秋紅龔福生謝云青樹突狀細胞dendritiell，D是成效最強的抗原呈遞細胞，是機體T淋巴細胞特異免疫應(yīng)答的直接啟動和調(diào)控者，在機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著緊張作用。在體外造就D并用腫瘤抗原致敏后，攜帶腫瘤抗原信息的D，在體表里激活針對該腫瘤細胞的特異性殺傷細胞。本試驗在體外用人胃癌細胞SG提取腫瘤抗原致敏D后誘導(dǎo)IK，通過其對SG的殺傷作用的研究為D治療胃癌的研究提供理論及試驗根據(jù)。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑SG由福建省腫瘤病院分子生物學(xué)研究室提供；rhIL?鄄2、rhIL?鄄4、D3Ab購自Peprteh公司；rhG?鄄SF

2、、Fill淋巴細胞分散液購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；胎牛血清(超等)購自杭州四序青生物成品公司；人AB血清由福建省血液中央提供；1640造就基購自Gib公司；FIT標識表記標幟的小鼠抗人D83、HLA?鄄DR、D14、D86及同亞型比擬抗體購于晶美生物工程。1.2要領(lǐng)SG在52、37條件下，用含有10胎牛血清RPI1640造就液通例造就。將造就貼壁腫瘤細胞用胰酶消化懸浮，離心棄上清，用無血清RPI1640造就液重懸，超聲破膜，30000r/in超速離心90in，取上清。濃縮透析，調(diào)解卵白濃度為25g/l，經(jīng)0.22濾膜濾過除菌，80保存。無菌條件下網(wǎng)羅的正凡人抗凝外全面血，經(jīng)淋巴細胞分散液梯度離心，獵

3、取單個核細胞，用含10%AB血清的RPI1640懸浮細胞，調(diào)解細胞濃度至5107/l，加1l至6孔板內(nèi)造就箱中造就2h，吸掉上清，用造就液洗去非黏附細胞，得到貼壁細胞，每孔再參加3l含有rhIL?鄄4500U/l及rhG?鄄SF500g/l的10%AB血清的RPI1640造就液，23d半量換液1次。將上述造就5d的D用含有rhIL?鄄4500U/l及rhG?鄄SF500g/l的10%AB血清的RPI1640造就液調(diào)解細胞濃度為1106/l，向6孔板內(nèi)參加2l的細胞，每孔參加腫瘤細胞總卵白1l25g，于第8d網(wǎng)絡(luò)懸浮細胞為抗原致敏的D。比擬組參加無血清RPI1640造就液1l，于第8d網(wǎng)絡(luò)懸浮細

4、胞為空缺的D。別離網(wǎng)絡(luò)第1d、第5d及第8d抗原致敏的D，用流式細胞儀檢測D外貌分子HLA?鄄DR、D83、D86、D14表達。同前法從外周血中獵取單個核細胞，用含10%AB血清的RPI1640懸浮細胞，37、5%2造就箱中造就2h，取懸浮細胞，調(diào)解細胞數(shù)為1106/l，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液造就，23d半量換液1次至第8d。試驗組用將其別離與空缺的D及抗原致敏的D按10：1比例相混，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液在6孔板內(nèi)造就。比擬組僅用含有IL?鄄2(25

5、0U/l)、D3Ab(50g/L)的10%AB血清的RPI1640造就液在6孔板內(nèi)造就。5d后別離獵取抗原致敏D誘導(dǎo)IK，空缺的D誘導(dǎo)IK及IK為效應(yīng)細胞。試驗組網(wǎng)絡(luò)成熟經(jīng)抗原致敏及空缺的D，用含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab(50g/L)10%AB血清的RPI1640調(diào)解細胞數(shù)為1106/l。網(wǎng)絡(luò)同時期造就的TK用同樣的造就液調(diào)解細胞數(shù)為1107/l。將100lIK別離與100l經(jīng)抗原致敏及空缺的D在96孔造就板中混淆造就。比擬組100lIK參加100l含有IL?鄄2(250U/l)、D3Ab50g/L10%AB血清的RPI1640繼承造就。72h后參加四甲基偶氮唑藍TT10g，繼承

6、造就4h，離心棄去孔內(nèi)上清，每孔參加150l二甲基亞砜DS震蕩10in，待結(jié)晶物充實溶解，用酶標儀在570n處測D值A(chǔ)，每組設(shè)3個復(fù)孔，取均值按下式盤算：刺激指數(shù)SI=A實行孔/A比擬孔100用TT比色法測定抗原致敏D誘導(dǎo)IK，空缺的D誘導(dǎo)IK及IK對SG細胞的殺傷活性，效靶比為5：1、10：1、20：1。調(diào)解細胞至所需濃度，各取100l的效靶細胞懸液參加96孔板中，于37、5%2造就箱中造就24h后，參加四甲基偶氮唑藍TT10g，繼承造就4h，離心棄上清，每孔參加150l二甲基亞砜DS震蕩10in，待結(jié)晶物充實溶解，用酶標儀在570n處測D值，同時設(shè)空缺比擬、靶細胞比擬、效應(yīng)細胞比擬。每孔設(shè)

7、3個復(fù)孔，取其均值按下式盤算：IK細胞毒性1A效+靶A效/A靶100%1.3統(tǒng)計學(xué)要領(lǐng)接納SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)舉行析因闡發(fā)及t查驗。2效果2.1D形態(tài)學(xué)的不雅察從外周血得到單個核細胞，造就2h，得到貼壁細胞，多為體積孝圓形的單個核細胞。5d時可見細胞舒展體積變大，外形不規(guī)矩，部門細胞懸福經(jīng)抗原致敏后第8d時可見大部門細胞懸浮，變大并伸出偽足，細胞內(nèi)可見大量的顆粒，倒置相差顯微鏡下可見毛刺狀突起，為典范D形態(tài)。2.2抗原負載前后D表型的變革用流式細胞儀檢測D外貌分子HLA?鄄DR的表達第1d為5.01、第5d為28.21、第8d為62.01。D83別離為1.03、4.50、15.57。D8

8、6別離為4.47、25.75、41.03。D14別離為13.02、3.26、0.55。2.3混淆淋巴細胞反響2.4細胞殺傷試驗用TT比色法測定抗原致敏D誘導(dǎo)IK抗原?鄄D?鄄IK，空缺的D誘導(dǎo)IK空缺?鄄D?鄄IK及IK對SG細胞的殺傷活性表1。析因闡發(fā)效果表現(xiàn)：差異因素誘導(dǎo)IK對胃癌細胞SG殺傷作用差異，抗原致敏D誘導(dǎo)IK對該腫瘤細胞殺傷作用最強P0.01，提示抗原致敏D誘導(dǎo)IK對該腫瘤細胞有特異性的殺傷作用。差異效靶比之間殺傷作用差異P0.01，效果比力表現(xiàn)效靶比越高，殺傷作用越強。IK與效靶比之間有交互作用，此中抗原致敏D誘導(dǎo)IK在效靶比為20：1時殺傷作用較別的各組強。但空缺的D誘導(dǎo)I

9、K與IK兩組之間闡發(fā)效果表現(xiàn)兩組殺傷作用差異有無明顯性意義P0.05，提示空缺的D誘導(dǎo)IK對SG無特異性殺傷作用。結(jié)合混淆淋巴細胞反響效果提示，抗原致敏D誘導(dǎo)IK可通過激活對該腫瘤有特異性殺傷作用的淋巴細胞及促進淋巴細胞增殖兩方面可明顯性進步IK對腫瘤的細胞殺傷作用。3討論D在體外的致敏與其在體內(nèi)發(fā)育歷程相似，履歷未成熟與成熟兩個階段。未成熟D泉源于外周血或骨髓中的單個核細胞，經(jīng)IL?鄄4及G?鄄SF誘導(dǎo)形成3。本研究亦用此要領(lǐng)得到D。體外誘導(dǎo)D成熟有抗原負載、細胞因子和佐劑刺激等要領(lǐng)。本研究從人胃癌細胞系SG經(jīng)超聲破膜獵取含有多種腫瘤抗原的腫瘤總卵白，用其致敏D，顯微鏡下可不雅察到致敏的D細

10、胞呈典范成熟D的形態(tài)。用流式細胞儀檢測D外貌分子效果表現(xiàn),接納SG抗原負載的D，代表D成熟的外貌分子HLA?鄄DR、D83、D86升高，代表單個核細胞外貌分子D14落落，說明經(jīng)SG腫瘤細胞抗原負載可誘導(dǎo)D成熟。腫瘤細胞總卵白中包羅有富厚的膜抗原、H類和類抗原表位、多種熱休克卵白分子等身分，顛末D的攝娶加工和呈遞后，可引發(fā)針對多種腫瘤抗原簇的克隆4；可誘導(dǎo)針對該抗原的特異性細胞毒性T淋巴細胞，發(fā)揮有用的抗腫瘤免疫效應(yīng)5。IK細胞除了具有NK細胞非H限定的殺瘤作用，還具有T細胞的抗瘤作用。因此用抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細胞，與未經(jīng)抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細胞及IK細胞比擬，對雷同抗原靶細胞具有更強的殺傷作

11、用。本研究中TT試驗的效果證明經(jīng)抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細胞的殺瘤作用較未經(jīng)抗原致敏的D誘導(dǎo)IK細胞及IK細胞殺瘤作用強。虞積仁等6也證明，抗原致敏的D誘導(dǎo)細胞僅對帶有雷同抗原的靶細胞有特異性殺傷。而空缺D誘導(dǎo)IK細胞與細胞因子誘導(dǎo)IK缺乏特異性，兩者之間殺傷試驗無顯著差異。張宏文等7研究亦創(chuàng)造同樣效果?；煜馨图毎错懶Ч憩F(xiàn)D與IK混淆造就72h后，視野中D細胞消散與成熟D在完成抗原呈遞后凋亡有關(guān)8?？杖钡腄與抗原致敏的D，兩者均能顯著促進IK增殖，但兩者之間差異無明顯性意義，張嵩等9亦有雷同的報道。說明成熟D促進IK增殖與有無抗原負載無關(guān)，大概與成熟D高表達種種黏附分子與IK外貌的受體結(jié)合促

12、進IK細胞的增殖有關(guān)。本研究通過對人腫瘤細胞系SG提取腫瘤抗原致敏D誘導(dǎo)IK殺傷成效的試驗研究，證明抗原致敏D誘導(dǎo)IK可通過誘導(dǎo)特異性IK細胞及促進IK細胞增殖兩方面明顯進步IK細胞的殺瘤效應(yīng)，為進一步的臨床試驗研究提供試驗根據(jù)。【參考文獻】1鄭秋紅,鄭天榮,盧林,等.人外周血樹突細胞的分散與提純J.福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,34(2):115118.2鄭秋紅,鄭天榮,謝云青,等.樹突狀細胞對自體IK細胞體外殺傷肺腺癌細胞影響的研究J.腫瘤防治雜志,2022,12(16):384-387.3rseE,ZhuLJ,TedderTF,etal.Generatinfdendritellsinvit

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