微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

1、.：.；微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形狀構(gòu)造和培育特性察看 、微生物的形狀構(gòu)造察看主要是經(jīng)過染色，在顯微鏡下對其外形、大小、陳列方式、細(xì)胞構(gòu)造包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等及染色特性進(jìn)展察看，直觀地了解細(xì)菌在形狀構(gòu)造上特性，根據(jù)不同微生物在形狀構(gòu)造上的不同到達(dá)區(qū)別、鑒定微生物的目的。、細(xì)菌細(xì)胞在固體培育基外表構(gòu)成的細(xì)胞群體叫菌落colony。不同微生物在某種培育基中生長繁衍，所構(gòu)成的菌落特征有很大差別，而同一種的細(xì)菌在一定條件下，培育特征卻有一定穩(wěn)定性。，以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此，微生物培育特性的察看也是微生物檢驗(yàn)鑒別中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。細(xì)菌的培育特征包括以下內(nèi)容：在固體培育基

2、上，察看菌落大小、形狀、顏色色素是水溶性還是脂溶性、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起外形、邊緣特征及遷移性等。在液體培育中的外表生長情況菌膜、環(huán)混濁度及沉淀等。半固體培育基穿刺接種察看運(yùn)動、分散情況。霉菌酵母菌的培育特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體培育基上構(gòu)成的菌落和細(xì)菌的很類似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培育也和細(xì)菌類似，有均勻生長、沉淀或在液面構(gòu)成菌膜。霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培育基里，菌絲無限伸長沿培育基外表蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因此菌落邊緣和中心，正面和反面顏色經(jīng)常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培育外

3、表構(gòu)成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。革蘭氏染色:革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)建的。革蘭氏染色法可將一切的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G兩大類，是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G菌，是由這兩類菌的細(xì)胞壁構(gòu)造和成分的不同所決議的。G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時(shí)溶解了類脂質(zhì)，添加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)菌就被脫色，再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處置后反而使肽聚糖層的孔徑減少，通透性降低，

4、因此細(xì)菌仍保管初染時(shí)的顏色步驟：1涂片：涂片方法與簡單染色涂片一樣。2晾干：與簡單染色法一樣。3固定，與簡單染色法一樣4結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上，加適量以蓋滿細(xì)菌涂面的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。5水洗：傾去染色液，用水小心地沖洗。6媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。7水洗：用水洗去碘液。8脫色：將玻片傾斜，延續(xù)滴加95%乙醇脫色2025s至流出液無色，立刻水洗。9復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min。10水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液。11晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干。12鏡檢：鏡檢時(shí)先用低倍，再用高倍，最后用油鏡察看，并判別菌體的革蘭氏染色反響性。13實(shí)驗(yàn)終了后的處

5、置：將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈，a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦23次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦23次。留意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭?？春蟮娜旧Ｆ脧U紙將香柏油擦干Aseptic technique:Streak plate:Pour plateSpread plate二、生理生化實(shí)驗(yàn)微生物生化反響是指用化學(xué)反響來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反響常用來鑒別一些在形狀和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反響是微生物分類鑒定中的重要根據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反響有：1、尿素酶Urease實(shí)驗(yàn)有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個(gè)分子的氨，使

6、培育基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，由于不論底物尿素能否存在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。實(shí)驗(yàn)方法：挑取1824h待試菌培育物大量接種于液體培育基管中，搖均，于361培育10，60和120min，分別察看結(jié)果。或涂布并穿刺接種于瓊脂斜面，不要到達(dá)底部，留底部作變色對照。培育2，4和24h分別察看結(jié)果，如陰性應(yīng)繼續(xù)培育至4天，作最終斷定，變?yōu)榉奂t色為陽性。2、氧化酶Oxidase實(shí)驗(yàn)氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶，為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶，氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反響。實(shí)驗(yàn)方法：在瓊脂斜面培育物上或血瓊脂平板菌落上滴加

7、試劑12滴，陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色深紫色，Ewing氏改良試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改動。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)斷定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本卷須知：鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液容易氧化，溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，并在冰箱內(nèi)保管，如溶液變?yōu)榧t褐色，即不宜運(yùn)用。鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對苯撐二胺呈紅色反響，假設(shè)用它來挑取菌苔，會出現(xiàn)假陽性，故必需用白金絲或玻璃棒或牙簽來挑取菌苔。在濾紙上滴加試劑，以剛剛打濕濾紙為宜，如濾紙過濕，會防礙空氣與菌苔接觸，從而延伸了反響時(shí)間，呵斥假陰性。3、過氧化氫酶的測定過氧化氫酶又稱接觸酶，能催化過氧化氫分解水和氧。試劑：310過氧化氫H2O2菌種培育：將測試菌種接種于適宜的培育基斜面

8、上，適溫培育1824h。實(shí)驗(yàn)方法：取一干凈的載波片，在上面滴1滴310的H2O2，挑取1環(huán)培育1824h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹，假設(shè)有氣泡氧氣出現(xiàn)，那么為過氧化氫酶陽性，無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接參與斜面上，察看氣泡的產(chǎn)生。本卷須知：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶，所以測試菌所生長的培育基不可含有血紅素或紅血球。4、甲基紅Methyl Red實(shí)驗(yàn) 腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培育基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。實(shí)驗(yàn)方法：挑取新的待試

9、純培育物少許，接種于MRVP生化鑒定管，于36通用培育基，培育于361C或30C以30C較好35天，從第二天起，每日取培育液1ml，加甲基紅指示劑12滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可斷定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑，pH范圍為4.46.0，其pK值為5.0。故在pH5.0以下，隨酸度而加強(qiáng)黃色，在pH5.0以上，那么隨堿度而加強(qiáng)黃色，在pH5.0或上下接近時(shí)，能夠變色不夠明顯，此時(shí)應(yīng)延伸培育時(shí)間，反復(fù)實(shí)驗(yàn)。5、V-P實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培育基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，

10、二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，稱VP+反響。實(shí)驗(yàn)方法：OMeara氏法：將實(shí)驗(yàn)菌接種于通用培育基，于361C培育48h，培育液1ml加OMeara試劑加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液1ml，搖動試管12min，靜置于室溫或361C恒溫箱，假設(shè)4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即斷定為陰性。亦有主張?jiān)?850C水浴放置2h后斷定結(jié)果者。Barritt氏法：將實(shí)驗(yàn)菌接種于通用培育基，于361C培育4天、培育液2.5ml先參與5C萘酚2-na-phthol純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml，搖動25min，陽性菌常立刻呈現(xiàn)紅色，假設(shè)無紅

11、色出現(xiàn)，靜置于室溫或361C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可斷定為陰性?？焖俜ǎ簩?.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反響的三糖鐵瓊脂斜面培育物一接種環(huán)，乳化接種于其中，參與5%-萘酚3滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min，斷定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培育物不能運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)普通用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時(shí)，通用培育基中的磷酸鹽可妨礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故應(yīng)省去或以氯化鈉替代。6、含碳化合物的利用細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為獨(dú)一碳源，反映該菌能否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系，因此作為鑒定根據(jù)。測定的根底培育基配方很多，因種而異?，F(xiàn)引見1種合成的根底培育基

12、，有些細(xì)菌還可適當(dāng)補(bǔ)加各種維生素。培育基可制成液體，分裝試管，也可制成固體平板?？捎糜跍y定的底物種類很多，有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機(jī)酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳?xì)浠衔锏?。糖的含量普通?，醇類酚類等的含量普通為0.10.2，氨基酸的含量普通為0.5。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體培育基中振蕩培育，或參與到45的固體培育基中，振蕩后立刻倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌，可用過濾法滅菌后參與已滅菌的根底培育基中，某些醇類和酚類不用滅菌。接種和察看結(jié)果：菌種最好做成懸液，防止帶入少量碳源干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。平板培育用接種環(huán)點(diǎn)種，液體培育那么用直針接種。每一測定菌必需接種未加碳水化合物

13、的空白根底培育基作對照。適溫培育2、5、7天后察看，凡測定菌在有碳水化合物的培育基中生長情況，明顯超越空白培育基的生長量為陽性，否那么為陰性。假假設(shè)兩種培育基上生長情況差別不明顯，開在同一培育基上延續(xù)移種3次，如差別仍不明顯那么以陰性論。7、葡萄糖的氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在細(xì)菌鑒定中，糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是1項(xiàng)重要根據(jù)。細(xì)菌對糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸，不需求以分子氧作為最終受氫體，稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種那么以分子氧作為最終受氫體，稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少，所產(chǎn)生的酸經(jīng)常被培育基中的蛋白胨分解時(shí)所產(chǎn)生的胺所中和，而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此，Hugh和Leifson提出一種含

14、有低有機(jī)氮的培育基，用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一實(shí)驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。普通用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一根底培育基來測定細(xì)菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的才干。1接種 ：以1824h的幼齡菌種，穿刺接種在上述培育基中，每株菌接4管，其中2管用油封蓋凡士林：液體石蠟1：1混合后滅菌，約加0.51厘米厚，以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開管，同時(shí)還要有不接種的閉管作對照。適溫培育1、2、4、7天察看結(jié)果。2結(jié)果察看：氧化型產(chǎn)酸僅開管產(chǎn)酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿12d，后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸那么開管及閉管均產(chǎn)酸，如產(chǎn)氣，那么在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。8、糖或醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)不

15、同微生物分解利用糖類的才干有很大差別，或能利用或不能利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培育物少許，接種于發(fā)酵液體培育基管，假設(shè)為半固體培育基，那么用接種針作穿刺接種。接種后，置361.0C培育，每天察看結(jié)果，檢視培育基顏色有無改動產(chǎn)酸，小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，假設(shè)為半固體培育基，那么檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時(shí)還可看出接種菌有無動力，假設(shè)有動力、培育物可呈彌散生長。本實(shí)驗(yàn)主要是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵才干，從而進(jìn)展各種細(xì)菌的鑒別，因此每次實(shí)驗(yàn)，常需同時(shí)接種多管。普通常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫

16、，溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。注：對于糖醇類發(fā)酵如今普通用糖、醇類細(xì)菌微量生化鑒定管在361824h即可出結(jié)果。9、硝酸鹽Nitrate復(fù)原實(shí)驗(yàn)有些細(xì)菌具有復(fù)原硝酸鹽的才干，可將硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽、氨或氮?dú)獾?。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法：臨試前將試劑的A磺胺酸冰醋酸溶液和B萘胺乙醇溶液試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培育物或瓊脂斜面培育物外表，立刻或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為實(shí)驗(yàn)陽性，假設(shè)無紅色出現(xiàn)那么為陰性。用-萘胺進(jìn)展實(shí)驗(yàn)時(shí)，陽性紅色衰退很快、故參與后應(yīng)立刻斷定結(jié)果。進(jìn)展實(shí)驗(yàn)時(shí)必需有未接種的培育基管作為陰性對照。-萘胺具有致癌性、故運(yùn)用時(shí)應(yīng)加

17、留意。10、靛基質(zhì)Imdole實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反響表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，構(gòu)成玫瑰吲哚，為紅色化合物。實(shí)驗(yàn)方法：將待試純培育物小量接種于實(shí)驗(yàn)培育基管，于361C培育24h時(shí)后，取約2ml培育液，參與Kovacs氏試劑23滴，輕搖試管，呈紅色為陽性，或先加少量乙醚或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培育液外表后，再沿試管壁徐緩參與Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反響，假設(shè)先用二甲苯或乙醚等進(jìn)展提取，再加試劑，那么只需靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)

18、紅色，因此結(jié)果更為可靠。11、三糖鐵TSI瓊脂實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培育物，穿刺接種并涂布于斜面，置361培育1824h，察看結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)可同時(shí)察看乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣變黃；產(chǎn)生硫化氫變黑。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃，但因量少，生成的少量酸，因接觸空氣而氧化，加之細(xì)菌利用培育基中含氮物質(zhì)，生成堿性產(chǎn)物，故使斜面后來又變紅，底部由于是在厭氧形狀下，酸類不被氧化，所以仍堅(jiān)持黃色。12、氨基酸脫羧酶的測定 有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶，使羧基釋出，生成胺類和二氧化碳。此反響在偏酸的條件下進(jìn)展。當(dāng)培育基含胺類時(shí)呈堿性反響，使指示劑變色。接種與察看結(jié)果：用幼齡培育液作為菌種

19、，直接接種。接種后封油，對看管與測定管同時(shí)接種封油。腸肝菌科的細(xì)菌于37培育4天察看。當(dāng)指示劑呈紫色或帶紅顏色的紫色者為陽性，呈黃色者為陰性。對看管應(yīng)呈黃色反響。13、硫化氫H2S實(shí)驗(yàn)有些細(xì)菌可分解培育基中含硫氨基酸或含硫化合物，而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。實(shí)驗(yàn)方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培育基中，沿管壁穿刺接種，于361培育2428h，培育基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培育至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于普通營養(yǎng)肉湯，再將醋酸鉛紙條懸掛于培育基上空，以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置361培育16天。紙條變黑為陽性。14、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用某些細(xì)菌能利

20、用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源，及磷酸胺作為氮源，將檸檬酸分解為二氧化碳，那么培育基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。接種與察看結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上，適溫培育37天，培育基呈堿性藍(lán)色者為陽性反響，不變者那么為陰性。15、利用丙二酸鹽實(shí)驗(yàn)丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽，也是細(xì)菌鑒定中的一個(gè)鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán)，而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個(gè)環(huán)節(jié)，丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶，與丙二酸不被分解，所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù)，不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反響，抑制了三羧酸循環(huán)。接種和察看結(jié)果：用幼齡菌種接種測定培育基和空白培育基，于適溫培育12d，察看培育

21、基變色情況。如測定培育基生長并變藍(lán)色，表示可利用丙二酸鹽，為陽性結(jié)果。反之，如測定培育基未變色，而空白對照培育基生長，那么為陰性，即不利用丙二酸鹽。16、葡萄糖酸鹽的氧化假單胞菌屬和腸道桿菌科的細(xì)菌，可氧化葡萄糖酸為2酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸無復(fù)原性基團(tuán)，氧化后構(gòu)成酮基，那么可將斐林氏試劑的呈藍(lán)色的銅鹽復(fù)原為磚紅色的Cu2O沉淀。實(shí)驗(yàn)方法：用pH7.2的磷酸緩沖液配制成含1葡萄糖酸鹽可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣的溶液。分裝試管，每管2mL。刮取適溫培育1824小時(shí)的菌苔至2mL的葡萄糖酸鹽溶液中制成濃的菌懸液，置30過夜，然后每管參與0.5mL的斐林試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，試管中液體由藍(lán)色

22、變?yōu)辄S綠，綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽性反響，如溶液不變色者為陰性。17、硫化氫-靛基質(zhì)-動力SIM瓊脂實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度，置361培育1824h，察看結(jié)果。培育物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性，混濁或沿穿刺線向外生長為有動力，然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培育外表，靜置10min，假設(shè)試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培育基未接種的下部，可作為對照。本實(shí)驗(yàn)用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化挑選，與三糖鐵瓊脂等結(jié)合運(yùn)用可顯著提高挑選效果。18、-半乳糖苷酶ONPG的測定本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用于腸肝菌科的鑒定。測定步驟：將測定菌接種于TSI斜面上，培育于3718h或其他最適溫度挑取1大環(huán)菌苔入約0.

23、25mL的生理鹽水中制成菌懸液，每管加1滴甲苯，搖勻有助于酶的釋放，于37放置5分鐘。在菌懸液中參與0.25mL的0.75mol/L ONPG，測定管置于37水浴培育。經(jīng)30分、1、2、3、24h進(jìn)展察看，如有黃色者那么為陽性。19、耐鹽性實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)是察看浸透壓對細(xì)菌生長的影響。由于不同菌類耐鹽性不同，故常以此作為鑒別特征。普通可根據(jù)不同種類的菌株，選擇其適宜生長的培育基，在其中參與不同量的NaCl，接種后察看其生長與否，以判別其耐鹽性。以肉湯培育液根據(jù)鑒定需求，配成不同濃度的NaCl，如2、3.5、5、7、10等。培育基要求非常廓清，接種時(shí)應(yīng)采用幼齡菌液，直針接種，適溫培育37d，與未接種的

24、對看管對比，目測生長情況。20、卵磷脂酶的測定菌體如存在有卵磷脂酶，就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。接種與察看結(jié)果：將測試菌的菌液，環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對看管中，適溫培育1、3或5天察看。假假設(shè)與對看管相比較，在卵黃胰胨液中或外表，構(gòu)成白色沉淀者，那么為陽性反響，表示卵磷脂被分解，生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿，闡明有卵磷酶的存在。另一種方法：以無菌操作取出卵黃，放入滅菌的三角瓶中，加相當(dāng)于等量的生理鹽水搖勻后，取10mL卵黃液參與到溶化的約5055的200mL肉汁胨瓊脂培育基中，混合均勻后倒入培育皿，制成卵黃平板，過夜后即可運(yùn)用。接種與察看結(jié)果：將測試菌點(diǎn)接在卵黃平板上，每

25、皿可分散點(diǎn)接45株菌、芽孢桿菌以點(diǎn)接12株菌為宜以不影響結(jié)果察看為度，如測試厭氧菌，那么須在上面加蓋無菌的蓋玻片。每株菌至少反復(fù)點(diǎn)接兩皿。適溫培育12d察看，在菌落周圍構(gòu)成乳白色混濁環(huán)，表示卵磷脂被分解，生成脂肪，闡明該菌株有卵磷脂酶存在。21、石蕊牛奶的反響牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白，在牛奶中參與石蕊是作為酸堿指示劑和氧化復(fù)原指示劑。石蕊在中性時(shí)呈淡紫色，酸性時(shí)呈粉紅色，堿性呈藍(lán)色，復(fù)原時(shí)那么自上而下地褪色變白。細(xì)菌對牛奶的作用有一下幾種：產(chǎn)酸細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使石蕊變紅。產(chǎn)堿細(xì)菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)。胨化細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶，使酪蛋白分解，故牛奶變得比較廓清。酸凝固細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸

26、，使石蕊變化，當(dāng)酸度很高時(shí)，可使牛奶凝固。凝乳酶凝固有些細(xì)菌能產(chǎn)生凝乳酶，使牛奶中的酪蛋白凝固，此時(shí)石蕊常呈藍(lán)色或不變色。復(fù)原細(xì)菌生長旺盛，使培育基氧化復(fù)原電位降低，因此石蕊復(fù)原褪色。接種與察看結(jié)果：接種待測菌株，適溫培育3、5、7d或14d，按上述特征察看和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反響。22、酪素水解實(shí)驗(yàn)酪蛋白水解牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉參與50mL蒸餾水中或用50mL脫脂牛奶，另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中，將兩液分開滅菌。待冷至4550時(shí)，將兩液混勻倒平板，即成牛奶平板。將平板倒置過夜，使外表水分枯燥，然后將菌種點(diǎn)接在平板上，每皿可點(diǎn)接35株菌。適溫培育1、3、5天，

27、記錄菌落周圍和下面酪素能否已被分解而呈透明。配制該培育基時(shí)，切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌，以防牛奶凝固。23、酪氨酸水解將L酪氨酸0.5g懸浮于10mL蒸餾水中，8磅20分鐘滅菌，然后于100mL無菌的營養(yǎng)肉湯瓊脂混合，傾倒平板，待凝固后，將測試菌接種于平皿上，培育7到14d，記錄酪氨酸結(jié)晶能否被水解而變透明。24、苯丙氨酸脫氨實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌如變形桿菌具有苯丙氨酸脫氨酶，能將苯丙氨酸氧化脫氨，構(gòu)成苯丙酮酸，苯丙酮酸遇到三氯化鐵呈藍(lán)綠色。本實(shí)驗(yàn)用于腸肝菌科和某些芽孢桿菌屬的鑒定。接種與察看結(jié)果：將菌種接種于該培育基斜面上，適溫培育37d某些芽孢桿菌須培育21d。取10的FeCl3水溶液45滴，滴加在生

28、長菌苔的斜面上，當(dāng)斜面和試劑液面處呈藍(lán)綠色時(shí)為陽性反響，表示從苯丙氨酸構(gòu)成苯丙酮酸。25、產(chǎn)糊精結(jié)晶實(shí)驗(yàn)?zāi)承┬柩跹挎邨U菌能產(chǎn)生淀粉酶，使淀粉水解為糊精。該反響僅用于區(qū)別多粘芽孢菌，浸麻芽孢菌和環(huán)狀芽孢菌的培育物。在大試管中200X20mm裝碾過的小麥或燕麥0.5g，CaCO30.2g，蒸餾水10mL，滅菌后接種，35培育3、5和7d后，取1滴盧哥爾氏碘液混勻，枯燥后，用顯微鏡察看有暗褐色或藍(lán)色的六角形結(jié)晶的糊精，假假設(shè)大量構(gòu)成，那么陳列為扇形或針狀。26、從甘油產(chǎn)生二羥基丙酮本實(shí)驗(yàn)主要是用于區(qū)分醋酸單胞菌屬和假單胞菌屬以及某些芽孢桿菌的鑒定。生酮反響是由相應(yīng)的多元醇的脫氫酶的作用，此反響就是測

29、定有否這些脫氫酶。接種與察看結(jié)果：融化三角瓶中的培育基，倒成平板，凝固后在平板上劃短線接種，適溫培育10天，在平板上倒入斐林試劑A、B混合液，以覆蓋菌落為度，2小時(shí)內(nèi)檢查，假設(shè)在菌落周圍出現(xiàn)紅色的暈者為陽性反響。為了能掌握這一實(shí)驗(yàn)，可接種多粘芽孢桿菌作陽性對照。27、厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣在厭氧情況下，有些好氧細(xì)菌，能以硝酸鹽替代分子氧作為受氫體，進(jìn)展厭氧呼吸，將硝酸鹽復(fù)原為氣態(tài)氮，即為土壤中的反硝化作用。某些芽孢桿菌，假單胞菌及產(chǎn)堿菌等屬的細(xì)菌具有此反響。接種封油：以斜面菌種用接種環(huán)接種后，用凡士林油凡士林和液體石蠟為1：1封管，封油的高度約1厘米。必需同時(shí)接種不含有硝酸鉀的肉汁胨培育液作對照。察看

30、結(jié)果：培育27d，察看在含有硝酸鉀的培育基中有否生長和產(chǎn)生氣泡。如有氣泡產(chǎn)生，表示反硝化作用產(chǎn)生氮?dú)?，為陽性反響。但如不含硝酸鉀的對照培育基也可產(chǎn)生氣泡，那么只能按可疑或陰性處置。28、馬尿酸鹽水解實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)作為區(qū)分某些芽孢桿菌的鑒定和黃單胞菌屬的鑒定之用。接種和察看結(jié)果：以幼齡菌種接種于上述培育液中，適溫培育4周高溫芽孢菌培育2周，取1mL培育物，和1.5mL50的；硫酸混合，靜置片刻，在酸性混合物中有針狀結(jié)晶出現(xiàn)為陽性，證明從馬尿酸鹽構(gòu)成安息香酸。29、對疊氮化鈉的抗性本實(shí)驗(yàn)用于高溫芽孢桿菌的測定。接種和察看結(jié)果：取1環(huán)幼齡的菌液，接種于上述培育基中，同時(shí)接種營養(yǎng)肉湯作為對照。45培育7至

31、14d察看生長情況。30、氰化鉀實(shí)驗(yàn)氰化鉀KCN是呼吸鏈末端抑制劑。能否在含有氰化鉀的培育基中生長，是鑒別腸桿菌科各屬常用的特征之一。接種和察看結(jié)果：用幼齡菌種接種于加氰化鉀的測定培育基和未加氰化鉀的空白培育基中，適溫培育12d，察看生長情況。能在測定培育基上生長者，表示氰化鉀對測定菌無毒害作用，為陽性。假設(shè)在測定培育基和空白培育基上均不生長，表示空白培育基的營養(yǎng)成分不適于測定菌的生長，必需選用其它適宜的培育基。而測定菌在空白培育基上能生長，在含氰化鉀的測定培育基上不生長，為陰性結(jié)果。應(yīng)該留意：氰化鉀是劇毒藥品，操作時(shí)必需小心。培育基用畢，每管加幾粒硫酸亞鐵和0.5mL20KOH以解毒，然后清

32、洗。31、對溶菌酶抗性的測定在100mL的三角瓶中，放入6065mL無菌的0.01mol/L HCL，在其中參與0.1g溶菌酶，瓶上塞無菌棉花，在小火上煮沸20分鐘后，冷到室溫，加無菌的0.01mol/L HCL補(bǔ)足到100mL。取1mL溶菌酶溶液與99mL無菌的肉湯培育液混合，分裝無菌試管，每管2.5mL，在含有0.001溶菌酶肉湯管子及無溶菌酶的營養(yǎng)肉湯對看管中，各接種1環(huán)菌液，適溫培育57d，記錄兩管的生長情況。32、在pH5.7營養(yǎng)肉湯上的生長本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用于芽孢桿菌屬中種的鑒定。接種和察看結(jié)果：取菌液一環(huán)，接種于上述培育基中，同時(shí)接種普通肉湯液7.2pH作對照。適溫培育13d后察看生長情

33、況。該培育液要求非常廓清，pH必需準(zhǔn)確，最好用pH計(jì)調(diào)測。33、需氧性試樣假設(shè)在培育基中參與復(fù)原劑，如巰基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉等，以除去培育基中的氧氣或氧化型物質(zhì)，使厭氧菌能在有氧情況下生長。接種與察看結(jié)果：用1小環(huán)外徑1.5毫米的接種環(huán)的肉湯菌液，穿刺接種到上述培育基中，必需穿刺到管底。30培育，分別在3至7天察看結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱外表上生長者為好氧菌，如沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。34、明膠Gelatin液化實(shí)驗(yàn)有些細(xì)菌具有明膠酶亦稱類蛋白水解酶，能將明膠先水解為多肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。實(shí)驗(yàn)方法：挑取1824h待試菌培育物，以較大量穿刺接種于明膠高層約

34、2/3深度或點(diǎn)種于平板培育基。于2022培育714天。明膠高層亦可培育于361。每天察看結(jié)果，假設(shè)因培育溫度高而使明膠本身液化時(shí)應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再察看其能否被細(xì)菌液化，如確被液化，即為實(shí)驗(yàn)陽性。平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果的察看為在培育基平板點(diǎn)種的菌落上滴加試劑，假設(shè)為陽性，1020min后，菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)明晰帶環(huán)。否那么為陰性。35、淀粉水解實(shí)驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)方法：以1824h的純培育物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板一個(gè)平板可分區(qū)接種，實(shí)驗(yàn)數(shù)種培育物或直接移種于淀粉肉湯中，于361C培育2448h，或于20培育5天

35、。然后將碘試劑直接滴浸于培育外表，假設(shè)為液體培育物，那么加數(shù)滴碘試劑于試管中。立刻檢視結(jié)果，陽性反響淀粉被分解為瓊脂培育基呈深藍(lán)色、菌落或培育物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反響那么無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐漸進(jìn)展的過程，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的才干、培育時(shí)間，培育基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培育基pH必需為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保管于冰箱，因此以臨用時(shí)制備為妥。36、生長溫度的測定細(xì)菌生長的最高、最適和最低溫度，經(jīng)常是某些細(xì)菌鑒定的特征之一。測定細(xì)菌的生長溫度，要求培育液非常明晰如普通肉湯培育液，并采用液體菌種直針接種不用接種環(huán)接種

36、。放置于恒溫水浴培育。指示溫度計(jì)應(yīng)放在同樣的試管和培育基內(nèi)，在指定溫度下培育25d，察看生長情況。在接近0的低溫培育，那么察看時(shí)間可延伸至710d，甚至30d。察看記錄結(jié)果：目測生長情況，與未接種的空白培育基對比，留意混濁度、沉淀物和懸浮物等項(xiàng)，并分級記錄如下：1“：表示生長良好；與對看管相比，可清楚地?cái)喽ㄊ腔鞚岬摹?“：表示生長差；與對看管相比，只需在某一察看角度時(shí)方能看到明顯的混濁。3“：表示不生長；在適宜的角度下察看，與對照無差別?？傊?，培育5d，能生長者均按生長計(jì)，否那么按不生長計(jì)，凡培育5d仍屬可疑者或不生長者必需重測，在重測時(shí)，能夠出現(xiàn)有時(shí)生長，有時(shí)不生長的不穩(wěn)定景象，這能夠有兩種

37、緣由：一種是水浴溫度不穩(wěn)定，培育時(shí)溫度動搖大；另一種緣由能夠是所測定的溫度，恰好是測定菌的臨界生長溫度，在這種情況下，可用提高一度或降低一度的方法一定之。必需留意，當(dāng)測定的試管較多時(shí)，不可將試管捆成一捆浸于水浴中，這樣捆著的試管內(nèi)外溫度不一致，易出現(xiàn)誤差。最好用特制試管架放試管，所用溫度計(jì)運(yùn)用規(guī)范溫度計(jì)標(biāo)定過。37、構(gòu)成芽孢的培育基構(gòu)成芽孢是芽孢桿菌的關(guān)鍵性特征，但不是一切的芽孢桿菌都能在任何條件下構(gòu)成芽孢。在鑒定細(xì)菌時(shí)，為了確定能否屬芽孢菌，需求對那些在普通條件下不構(gòu)成芽孢的細(xì)菌，采用生孢子培育基，來確定能否能構(gòu)成芽孢。38、O/129的敏感性實(shí)驗(yàn)O/129即2，4二氨基6，7二異丙醇喋啶，

38、為弧菌抑制劑。該實(shí)驗(yàn)用于弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬的鑒定。取2，4二氨基6，7二異丙醇喋啶150mg，溶于10mL1：1的乙醇：二乙基乙醚中。把6mm大小的濾紙片浸入該溶液后取出，在空氣中晾桿，然后放在帶菌的半固體培育基上做分散敏感實(shí)驗(yàn)。三、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)血清學(xué)反響是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集景象。在食品微生物檢驗(yàn)中，常用血清學(xué)反響來鑒定分別到的細(xì)菌，以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。血清學(xué)反響的普通特點(diǎn)：1)抗原體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時(shí)，會出現(xiàn)交叉反響。2)抗原體的結(jié)合是分子外表的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。3)抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)

39、展的，只需比例適當(dāng)時(shí)，才干出現(xiàn)可見反響。4)血清學(xué)反響大體分為兩個(gè)階段進(jìn)展，但其間無嚴(yán)厲界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段，反響速度很快，只需幾秒至幾分鐘反響即可終了，但不出現(xiàn)肉眼可見景象。第二階段為抗原體反響的可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反響等。反響速度慢，需幾分、幾非常以致更長時(shí)間。而且，在第二階段反響中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境要素的變化，都直接影響血清學(xué)反響的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反響分三種類別：凝集反響、沉淀反響和補(bǔ)體結(jié)合反響。、凝集反響顆粒性抗原細(xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所構(gòu)成的肉眼可見的凝集景象，稱為凝集反響Agglutination reaction。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。在該反響中，由于單位體積抗體量