病毒感染力滴定

1、關(guān)于病毒感染力的滴定第一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月半數(shù)致死量LD50（50% lethal dose）半數(shù)感染量ID50 (50% infective dose)半數(shù)雞胚致死量ELD50 (egg 50% lethal dose)半數(shù)雞胚感染量EID50 (egg 50% infective dose)半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID50（tissue culture 50% infective dose)蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）測定病毒感染力的方法:第二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月將病毒作一定梯度的連續(xù)稀釋后接種于實驗動物或雞胚

2、或培養(yǎng)細胞，每一稀釋度作多個重復(fù)，在一定時間內(nèi)，記錄動物（雞胚）發(fā)病或死亡的數(shù)量或細胞病變的情況，利用Reed-Muench法或Karber法計算病毒的感染力。測定病毒感染力的基本過程:第三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、病毒TCID50的測定操作步驟在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。 將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8 孔，每孔接種100l。在每孔加入細胞懸液100l，使細胞量達到3105個/ml。 第四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月設(shè)正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。結(jié)果的

3、計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法第五張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8TCID50的計算方法（Calculation of TCID50）第六張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月病毒液 出現(xiàn) 無CPE 累 計 出現(xiàn)CPE孔稀釋度 CPE孔數(shù) 孔數(shù) CPE孔數(shù) 無CPE孔數(shù) 所占的% 10-1 8 0 51 0 100（51/51） 10-2 8 0 43 0 100（43/43） 10-3 8 0 35 0 100（35/35） 10-4 8 0 27 0 100（27/27） 10

4、-5 8 0 19 0 100（19/19） 10-6 7 1 11 1 91.7（11/12） 10-7 3 5 4 6 40（4/10） 10-8 1 7 1 13 7.1（1/14）1、Reed-Muench法CPE：Cytopathic effect第七張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月距離比例（高于50%病變率的百分數(shù)-50%）/（高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù)） （91.7-50）/（91.7-40） 0.8第八張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月lgTCID50=距離此例稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù) =0.8(-1)+(-6

5、) =-6.8 TCID50=10-6.80.1ml含義：將該病毒稀釋106.8倍接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100l，可使50%接種孔的細胞發(fā)生病變。第九張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、Karber法病毒液稀釋度 出現(xiàn)CPE的孔數(shù) 出現(xiàn)CPE孔的比率 10-1 8 8/8=1 10-2 8 8/8=1 10-3 8 8/8=1 10-4 8 8/8=1 10-5 8 8/8=1 10-6 7 7/8=0.875 10-7 3 3/8=0.375 10-8 1 1/8=0.125第十張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高濃度的稀釋

6、度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1(6.375-0.5) =-6.875 TCID50=10-6.875/0.1ml 第十一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、病毒蝕（噬）斑技術(shù)病毒蝕斑（plaque) 又稱空斑，指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。第十二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：適當稀釋的病毒懸液接種已經(jīng)長成單層的敏感細胞后，在覆蓋的固體或半固體介質(zhì)（瓊脂糖、甲基纖維素）的作用下，病毒在最初感染的細胞內(nèi)增殖后，只能進而感染并破壞臨近的細胞，經(jīng)過幾個增殖周期后，形成一個局限性的肉眼可見的病變細胞區(qū)，即局限性的病灶。

7、plaques第十三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月Procedures第十四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月操作步驟將敏感細胞在平皿或6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內(nèi)的單層細胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。（一）用瓊脂糖覆蓋，中性紅染色第十五張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月將培養(yǎng)板置37 5% CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔點瓊

8、脂糖，融化后降溫至38-42，與等量預(yù)熱至38-42含6%-10%犢牛血清的無酚紅DMEM混合，注入細胞培養(yǎng)板中。第十六張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月室溫放置直至瓊脂糖凝固，或于4冰箱放置幾分鐘至瓊脂糖凝固，然后于37 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。 每天于顯微鏡下觀察細胞病變情況。出現(xiàn)空斑后（2-3天），用含鈣、鎂的PBS將0.1%的中性紅貯存液10倍稀釋后滴加到細胞培養(yǎng)板上。于37 5% CO2培養(yǎng)箱中作用1h，吸棄染液，繼續(xù)于溫箱中培養(yǎng)2-3h。第十七張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月TK-突變株與野毒形成的空斑的比較第十八張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月（二

9、）用甲基纖維素覆蓋，結(jié)晶紫染色將敏感細胞在平皿或6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層。吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內(nèi)的單層細胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。將培養(yǎng)板置37 5% CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。第十九張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月覆蓋配好的4%羧甲基纖維素鈉（含3%新生牛血清）。48-72h后，待細胞出現(xiàn)病變或蝕斑時，各孔補滿10%中性甲醛，固定4h以上。棄掉孔中液體，流水側(cè)板沖洗數(shù)次。各

10、孔補加配好的結(jié)晶紫溶液（0.35%、w/v），作用15min。棄掉染液，繼續(xù)沖洗數(shù)次，在37溫箱中敞口烘干，顯微鏡下計空斑數(shù)。第二十張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月蝕斑技術(shù)的應(yīng)用：用于病毒純化：挑選病毒的克隆株測定病毒懸液中感染病毒的含量第二十二張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月如果是作病毒純化 挑取空斑于200L維持液中，反復(fù)凍融3次，接種于PK-15細胞已長成單層的24孔細胞培養(yǎng)板，再于37 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至完全發(fā)生病變。第二十三張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一般的毒種純化：收集病變的細胞懸液，通過PCR或其它方法進行鑒定，并測定TCID50，然后選TCID50較高者再作幾輪空斑純化，獲得高滴度的病毒，擴大培養(yǎng)后作種用。篩選重組病毒：收集病變的細胞或病毒懸液，通過PCR或其它方法進行鑒定，取陽性者再作下一輪空斑純化。如此3-5輪空斑純化后即可得到純化的病毒粒子。第二十四張，PPT共二十六頁，創(chuàng)作