基因組學(xué)第10教學(xué)課件

1、第10章 基因組表觀遺傳1) 什么是表觀遺傳2) 表觀遺傳現(xiàn)象3) 表觀遺傳機(jī)制 位置效應(yīng) 副突變 甲基化 基因組印記 染色質(zhì)重建 劑量補(bǔ)償表觀遺傳學(xué)的例子 1) 細(xì)胞的分化是一種典型 的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象, 如人 類眼睛細(xì)胞和肌肉細(xì)胞含 有相同的基因組, 但基因 的表達(dá)差異很大.2) while a mutation in the axin gene called axin-fused produces mice with kinky tails (彎曲尾巴), the degree of kinkiness varies among genetically identical litterma

2、tes (同一窩老鼠)(Figure). Epigenetics的歷史1) 上世紀(jì)40年代, Waddington首創(chuàng)“epigenetics” 一詞, 用以概括研究基因及其產(chǎn)物如何轉(zhuǎn)變?yōu)楸憩F(xiàn)型的領(lǐng)域. 用現(xiàn)在的話說, 就是遺傳信息如何轉(zhuǎn)變?yōu)楸硇偷倪^程.2) 就詞義而言, “epi”是“其上” (upon) 或“超越” (over)的意思. 因此, 在epigenetics的定義中, genetics只涉及基因的結(jié)構(gòu)層次, 而epigenetics則涉及基因如何發(fā)揮其功能以及基因之間的互作關(guān)系.3) 在Waddington的“epigenetics”定義中, epigenetics的位置處于遺

3、傳學(xué), 發(fā)育和生態(tài)學(xué)的交叉口.表觀遺傳的通俗解釋我國古代有“橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實(shí)味不同”的記載，說明相同基因型的生物在不同的環(huán)境條件下表型有很大的差別。同一種中藥材在不同產(chǎn)地生長，其藥效相差甚遠(yuǎn)，這也是環(huán)境影響基因表達(dá)的突出例子。這種因環(huán)境影響而改變的基因表達(dá)模式并不涉及基因型的變異，但可以重復(fù)出現(xiàn)，穩(wěn)定遺傳，是一種典型的表觀遺傳現(xiàn)象。同卵孿生子的表型趨異也是一種表觀遺傳. 最近的研究發(fā)現(xiàn), 隨著年齡的增長同卵孿生子的表型差異有擴(kuò)大的趨勢.Epigenetics概念的變遷1) 1982年“Dictionary of Biology”的定義: epigenetics系指

4、遺傳因子與發(fā)育過程之間的互作, 通過這種互作使基因型轉(zhuǎn)變?yōu)楸硇?2) 1992年, Hall在其所著的“Evolutionary Developmental Biology”一書中, 將epigenetics定義為: 在發(fā)育過程中遺傳因子和非遺傳因子作用于細(xì)胞, 選擇性控制基因的表達(dá), 并逐步增加表型復(fù)雜性的過程.3) 1996年, 在“Epigentic Mechanisms of Gene Regulation”一書中將epigenetics定義為: 不涉及DNA順序的改變而發(fā)生的基因功能的差異, 這種差異能通過有絲分裂和減數(shù)分裂穩(wěn)定傳遞.4) 2001年Science雜志對(duì)epigene

5、tics的定義為: 不涉及DNA順序的變異但能通過有絲分裂和減數(shù)分裂遺傳的基因表達(dá)模式的改變.表觀遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué)(epigenetics):研究在不改變DNA順序的情況下基因表達(dá)出現(xiàn)可遺傳變化的分支學(xué)科. 這種表達(dá)模式的改變可通過有絲分裂和減數(shù)分裂傳遞給子代細(xì)胞或個(gè)體. 表觀遺傳學(xué)是功能基因組學(xué)研究的重要領(lǐng)域.表觀遺傳是基因組程序化的一種表現(xiàn)形式.表觀遺傳-位 置 效 應(yīng)1) 位置效應(yīng)是指由于基因在染色體上的位置發(fā) 生改變而引起的表型改變的現(xiàn)象。2) 位置效應(yīng)表明, 基因的功能以及基因?qū)ι锉?型的影響可以在不改變遺傳物質(zhì)本身的順 序組成情況下僅僅由于遺傳物質(zhì)在染色體上 的位置差別而發(fā)生變化

6、。 3) 位置效應(yīng)實(shí)際上反映了基因組不同區(qū)域特定 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)基因施加的影響。 兩種位置效應(yīng)美國學(xué)者E.B.劉易斯把位置效應(yīng)分為兩大類型：穩(wěn)定型和花斑型。穩(wěn)定型位置效應(yīng) 簡稱S型位置效應(yīng)，表型 改變是穩(wěn)定的?；ò咝臀恢眯?yīng) 簡稱V型效應(yīng)，其表型改 變是不穩(wěn)定的，從而導(dǎo)致顯性和隱性 性狀嵌合的花斑現(xiàn)象。 花斑型位置效應(yīng)當(dāng)某一基因由于染色體重排從原來的常染色質(zhì)區(qū)移到異染色質(zhì)區(qū)附近, 因異染色質(zhì)的擴(kuò)散效應(yīng), 造成基因表達(dá)的改變. 這種抑制效應(yīng)的差別使基因表達(dá)受抑程度不同,由此產(chǎn)生嵌合.位置效應(yīng)-座位控制區(qū)1) 什么是座位控制區(qū)(locus control region , LCR). The lev

7、el of activity of a euchromatic region of a chromosome is regulated by a cis-acting DNA element designated a locus control region. 可調(diào)控常染色質(zhì)區(qū)活性水平的一段順式DNA成分.2) LCR的功能:以順式(cis-)方式調(diào)控與其連鎖的基因表達(dá).3) 第一個(gè)LCR首先在人類-球蛋白基因座位區(qū)發(fā)現(xiàn).見: Blood, 100:3077-3086, 2002-球蛋白質(zhì)基因座位控制區(qū)-球蛋白質(zhì)基因座位控制區(qū)的結(jié)構(gòu)球蛋白基因簇含有5個(gè)功能基因，分別為、G、A、,分布在50 k

8、b的DNA區(qū)段。球蛋白基因只在血紅細(xì)胞中表達(dá)，但每個(gè)基因表達(dá)的時(shí)期與組織特異性各不相同。-球蛋白基因在胚胎卵囊中表達(dá)，G和A 卵黃囊表達(dá)，和僅在成體骨髓中表達(dá)。盡管每個(gè)球蛋白基因都有一套彼此獨(dú)立的調(diào)控系統(tǒng)，但它們都毫無例外地受到位于該區(qū)上游一段長約12 kb的LCR控制.5HSs1-5是LCR區(qū)5個(gè)DNA-I酶高敏感位點(diǎn),是處在開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū).5HSs1-4位點(diǎn)是類紅細(xì)胞專一性的調(diào)控區(qū), 5HSs5-7為非類紅細(xì)胞活性. 增強(qiáng)子活性位于5HSs2-3位點(diǎn). human hispanic deletion為LCR區(qū)缺失, 引起地中海貧血病. 卵圓型為氣味受體基因區(qū)(olfactor rece

9、ptor genes).LCR區(qū)ncRNA的調(diào)控作用副突變副突變:(paramuta-tion) 最初在玉米中發(fā)現(xiàn)的在雜合子中某一基因影響同一座位上另一等位基因的表型. 副突變?cè)谵D(zhuǎn)基因表現(xiàn)型中也已發(fā)現(xiàn), 稱為同源抑制.副突變的分子機(jī)制控制玉米紫色基因b1副突變的成分位于該基因上游100kb，是一段含有多個(gè)拷貝的重復(fù)順序。雜合子中已發(fā)生副突變的b1基因可將其修飾模式（B）“拷貝”到等位基因B-1，使后者轉(zhuǎn)變?yōu)楦蓖蛔儬?B） B-I和B都有7個(gè)串接重復(fù)順序，重復(fù)順序單位長853 bp。重復(fù)順序的多少涉及副突變和b1的轉(zhuǎn)錄水平。B-I和B的DNA順序完全相同，不同的只是表達(dá)水平。B-I狀態(tài)重復(fù)順序的

10、甲基化程度高于B.玉米的B-I和B的副突變涉及siRNA路線（Alleman M等，2006）。 小RNA與玉米B-I基因的沉默染色質(zhì)位置阻隔效應(yīng)絕緣子1）1985年，Udvardy等在果蠅染色體87A7條帶熱激蛋白基 因座的兩側(cè)發(fā)現(xiàn)了兩段取名為scs 和 scs (specialized chronatin structures, 特化染色質(zhì)區(qū)) 的順序。scs和scs長分別為350 bp 和 200 bp，對(duì) DNAase I 有高度抗性。這兩個(gè)序列的兩側(cè)均有DNAase I超敏位點(diǎn)，各為100 bp。2）將scs置于控制眼睛顏色的基因兩側(cè)然后導(dǎo)入果蠅，轉(zhuǎn) 化的果蠅品系不管轉(zhuǎn)基因位于何處，

11、均可產(chǎn)生類似表 型，說明scs可使轉(zhuǎn)基因免受內(nèi)源染色質(zhì)“位置影 響”3) 這種可以阻止鄰近位置激活或失活效應(yīng)的順序稱之為絕 緣子（insulator）或隔離子。 果蠅絕緣子（insulator） 果蠅多線染色體橫紋區(qū)SCS專一性結(jié)合蛋白質(zhì)絕緣子可阻止相鄰基因之間增強(qiáng)子的彼此干擾1) 真核生物增強(qiáng)子具有雙向作用, 超長距離功 能, 從而帶來位置相鄰基因之間的彼此干擾 問題.2) 有些基因位于異染色質(zhì)鄰近, 會(huì)受到抑制效應(yīng)的干擾.絕緣子可以阻止上述因位置原因產(chǎn)生的對(duì)基因表達(dá)的抑制效應(yīng).絕緣子的定向控制 絕緣子效應(yīng)的方向性絕緣子的效應(yīng)具有方向性 果蠅的yellow（y）座位有4個(gè)增強(qiáng)子元件，2個(gè)位于

12、啟動(dòng)子上游，另2個(gè)位于外顯子1和2之間，它們分別負(fù)責(zé)不同組織特異性的yellow基因的表達(dá)。將含有絕緣子的果蠅逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子gypsy依次分別插入每個(gè)增強(qiáng)子元件的附近，絕緣子對(duì)增強(qiáng)子的阻隔效應(yīng)依位置不同而異: 1) 如果插入位置在啟動(dòng)子的5方向，將影響絕緣子上游 增強(qiáng)子元件的作用。2) 如果插入位置在啟動(dòng)子的3方向，只影響下游增強(qiáng)子 元件的功能。3) 如果插入位置不在增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間，絕緣子對(duì)增 強(qiáng)子無阻隔效應(yīng)。 絕緣子（2） 絕緣子結(jié)合蛋白（CTCF）（1） 絕緣子DNA結(jié)合蛋白一種DNA-結(jié)合蛋白CTCF(CCCTC-binding factor, CCCTC結(jié)合因子)可專一性與該42 b

13、p順序結(jié)合。CTCF已在其它實(shí)驗(yàn)中被證明參與基因的轉(zhuǎn)錄激活與沉默，是一個(gè)含有11個(gè)鋅指的分子量為82 kD的蛋白質(zhì)。人體T細(xì)胞受體/座位及爪蟾（Xenopus）RO (repeat organizer, 重復(fù)順序組織者) rRNA基因調(diào)控區(qū)絕緣子均有保守的CTCF結(jié)合位點(diǎn) (Bell, 2001)。這些在進(jìn)化上處于不同地位的物種中廣泛存在絕緣子的現(xiàn)象表明，以絕緣子界定增強(qiáng)子的作用范圍是真核基因組一種普遍的控制基因活性的機(jī)制 絕緣子與果蠅BX-C基因調(diào)控果蠅腹節(jié)模式?jīng)Q定區(qū)中的絕緣子染色質(zhì)修飾與重建 增強(qiáng)子作用的DNA環(huán)化模型與絕緣子的關(guān)系高等生物基因組普遍存在甲基化1) DNA分子的化學(xué)修飾主要

14、是甲基化，脊椎動(dòng)物基因組中約60-80%雙核苷酸CpG的胞嘧啶(C)被甲基化。被子植物基因組中，甲基化位置主要出現(xiàn)在CpG和CpNpG回文對(duì)稱順序，大約20-30%的胞嘧啶(C)被甲基化。DNA的甲基化在基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。2） 基因組的甲基化模式可影響表型并能通過體細(xì)胞遺傳，但不該變細(xì)胞的基因型. 基因組的甲基化是表觀遺傳的重要內(nèi)容之一.3) 基因組DNA甲基化是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式, 并與染色體重建(chromatin remodeling)有關(guān).DNA去甲基化與肌肉細(xì)胞分化基因組DNA甲基化的生物學(xué)1）細(xì)胞命運(yùn)的確定與基因組DNA的甲基 化狀態(tài)有關(guān)；2）DNA甲基化是決定基因表

15、達(dá)模式的重 要因素；3）DNA甲基化模式可以在上下代細(xì)胞之 間傳遞；4）DNA甲基化只限于堿基的修飾，并不 改變DNA的順序組成。 染色質(zhì)重建1)染色質(zhì)重建(chromatin remodeling)系指染色體結(jié)構(gòu)狀態(tài)的改變.染色質(zhì)重建可以是可逆的,也可以是不可逆的.2)染色質(zhì)重建涉及DNA的甲基化, 組蛋白的乙?；腿ヒ阴；?3)染色質(zhì)重建的目的是使染色質(zhì)的物理狀態(tài)處于松弛或收縮, 其結(jié)果使轉(zhuǎn)錄活化因子可接觸或不能接觸調(diào)控順序.DNA甲基化與染色質(zhì)重建siRNA可誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成見:Current Opinion in Cell Biology 16:230-238, 2004siRNA

16、介導(dǎo)的染色質(zhì)沉默 DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子活性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的不可逆變化與基因沉默在個(gè)體發(fā)育與細(xì)胞分化過程中，當(dāng)某些基因已經(jīng)完成預(yù)定的表達(dá)程序后必需永久性關(guān)閉。這一任務(wù)可以通過DNA甲基化促使染色質(zhì)的重建完成。Polycome:多結(jié)蛋白. DNA甲基化抑制轉(zhuǎn)座等位基因成員的非對(duì)稱表達(dá)1) 二倍體基因組中每個(gè)等位基因均有兩個(gè)等位基因成員.2)二倍體每個(gè)等位基因成員的表達(dá)模式有三種: 母源基因表達(dá), 父源基因表達(dá), 兩個(gè)成員均表達(dá)3) 有三種機(jī)制決定等位基因成員的非對(duì)稱表達(dá): 1.X-染色體失活; 2.基因組印記; 3.隨機(jī)選擇.基因組印記1)1991年TM.德切艾拉等報(bào)道, 老鼠7號(hào)染色體上中有一個(gè)稱為

17、類胰島素生長因子Igf2的基因(insulin-like growth factorII),該基因的突變純合子表現(xiàn)為侏儒癥.在雜合子中,如果突變等位基因來自父親, 表型異常.如果來自母親,表型正常,即母源Igf2基因在子代被抑制.2) 這種因?yàn)橛H本來源不同而使等位基因表達(dá)模式發(fā)生改變的現(xiàn)象稱為印記(imprinting).它有兩個(gè)特點(diǎn): 1.子代的兩個(gè)等位基因中有一個(gè)發(fā)生沉默, 即不表達(dá). 2.哪一個(gè)等位基因沉默取決于等位基因的親本來源. 這是在哺乳動(dòng)物中最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳現(xiàn)像. 隨后又在老鼠中發(fā)現(xiàn)另外一個(gè)基因, 即7號(hào)染色體上與Igf2緊密連鎖的H19也有類似的情況, 只是表現(xiàn)相反, 即父源

18、的H19等位基因在子代中不表達(dá), 母源的H19基因在子代中正常表達(dá). 基因組印記的分子機(jī)制綿羊肥臀突變的遺傳符合典型的基因組印記模式In 1996, a team led by Cockett and Georges explained what was going on: Only lambs that inherit the callipyge mutation from their father but not their mother develop the trait. All other combinations of normal and callipyge chromosome

19、s result in normal sheep. The researchers named the effect polar overdominance (極性超顯性效應(yīng)).見: Trends in Genetics 19:248-252, 2003.基因組印記的其它例子DNA甲基化與基因組程序化 受精胚與體細(xì)胞胚的發(fā)育差異哺乳動(dòng)物體細(xì)胞胚胎發(fā)與受精卵胚胎發(fā)育存在許多異.這些差異主要表現(xiàn)在體細(xì)胚與受精胚基因組的程序化. 受精胚的雄核與雌核在去甲化的程序上存在時(shí)間差.甲化程序的差異會(huì)導(dǎo)致胎發(fā)育異常.雙卵融合克隆小鼠 哺乳動(dòng)物均有基因組印記, 因此哺乳動(dòng)物沒有孤雌生殖. 只有將野生型H19基因

20、和突變型H19基因的卵細(xì)胞融合才得到成體克隆鼠. 見:Nature 428:860-864,2004劑量效應(yīng)1) 劑量效應(yīng)系指具有兩份基因拷貝的個(gè)體和一份基因拷貝的個(gè)體在表現(xiàn)型上保持一致的機(jī)理. 2) 多細(xì)胞生物中性別染色體在雌性和雄性細(xì)胞中的拷貝數(shù)不同, 為平衡基因表達(dá)產(chǎn)物的數(shù)量, 出現(xiàn)整條染色體被抑止或超激活現(xiàn)象.染色體劑量效應(yīng)染色體劑量效應(yīng)可通過基因的上調(diào)或下調(diào)形式達(dá)到: 1) 哺乳動(dòng)物雌性一條X-染色體失活,形成Barr小體;2) 果蠅雄性X-染色體超表達(dá)以達(dá)到平衡;3) 線蟲雌性一條X-染色體低表達(dá).X-染色體失活機(jī)制雌性老鼠在胚胎早期兩個(gè)XIST等位基因低水平表達(dá), 但RNA產(chǎn)物不

21、穩(wěn)定,并與其編碼基因結(jié)合. 隨著發(fā)育進(jìn)行,其中一個(gè)XIST基因的表達(dá)逐步穩(wěn)定最終覆蓋了其所在的整個(gè)X-染色體. 另一X-染色體上的XIST基因則隨之因啟動(dòng)子甲基化而關(guān)閉. 選擇那條X-染色體失活是一個(gè)隨機(jī)的過程.干細(xì)胞與表觀遺傳人類皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成胚胎多能干細(xì)胞美日兩國研究小組2007年11月20日分別在兩家權(quán)威科學(xué)雜志發(fā)表相關(guān)研究報(bào)告, 宣稱成功將人類皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成多能干細(xì)胞, 即iPS (induced pluripotent stem) 。美國威斯康星大學(xué)詹姆斯湯姆森實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)表在科學(xué)雜志，而日本京都大學(xué)教授山中伸彌領(lǐng)導(dǎo)的研究小組把報(bào)告發(fā)表在細(xì)胞雜志。 兩個(gè)小組的研究方法和原理大同小異

22、。山中伸彌研究小組從一名36歲女性的臉部提取了科學(xué)家稱為纖維原細(xì)胞的皮膚細(xì)胞。詹姆斯湯姆森實(shí)驗(yàn)室的皮膚細(xì)胞來自一名新生兒的陰莖包皮細(xì)胞。詹姆斯湯姆森實(shí)驗(yàn)室的旅美華人女科學(xué)家俞君英參與了這次皮膚干細(xì)胞的研究。學(xué)界評(píng)價(jià)這一突破可能意味著風(fēng)靡一時(shí)的胚胎干細(xì)胞克隆技術(shù)將退出舞臺(tái)。俞君英在湯姆森實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行有關(guān)干細(xì)胞的試驗(yàn) 基因組程序化與胚胎干細(xì)胞1) 什么是胚胎干細(xì)胞?2) 胚胎干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)意義3) 如何獲取胚胎干細(xì)胞?4) 人類胚胎干細(xì)胞獲取的困難5) 從人體體細(xì)胞誘導(dǎo)胚胎干細(xì) 胞的可能性6) 哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重新程序化(reprogramming)人類iPS細(xì)胞的培育過程1) 篩選與克隆控制胚胎干細(xì)

23、胞基因組重新程序化的基因.2) 把4種基因注入皮膚細(xì)胞，這些特定基因能夠“重組”皮膚細(xì)胞的基因.3) 將普通人體皮膚細(xì)胞成功改造成干細(xì)胞.4) 培育器官從理論上講，這種干細(xì)胞的功能類似通過胚胎克隆技術(shù)取得的胚胎干細(xì)胞，能夠最 終培育成人體組織或器官.靈長類胚胎干細(xì)胞Thomson JA對(duì)靈長類胚胎干細(xì)胞所給出的定義特征如下:1) 來自未植入子宮之前的胚胎;2) 可以無限保持未分化及增生狀態(tài);3) 即使在培養(yǎng)之后仍然可以穩(wěn)定地發(fā)育成胚胎的三個(gè)胚層, 具有多向分化的潛能.見: Science 282, 1998胚胎的特征及發(fā)育全能性干細(xì)胞所應(yīng)具有的特征1) 來源于一個(gè)全能性的細(xì)胞群體;2) 具有正

24、常的細(xì)胞核型;3) 具永生性,半場在胚胎狀態(tài)下能無限制的分裂;4）培養(yǎng)的細(xì)胞株在體外或在畸胎瘤中能自發(fā)分化成胚胎外組織（extraembryonic tissues）和分屬所有3種胚層的體細(xì)胞此前所有已培養(yǎng)成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，除小鼠外，靈長類動(dòng)物ES細(xì)胞只滿足上述4條標(biāo)準(zhǔn)的前3條。 體細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)成為胚胎干細(xì)胞1) 就基因組的遺傳信息組成而言, 每個(gè)體細(xì) 胞都具備潛在的可能.2) 因?yàn)轶w細(xì)胞是胚胎發(fā)育與形態(tài)建成的終極產(chǎn)物, 自然狀態(tài)下這是一個(gè)屗可逆的過程3) 胚胎發(fā)生與細(xì)胞分化是基因組程序化的結(jié)果,體細(xì)胞要逆轉(zhuǎn)為胚胎干細(xì)胞必需重新程序化.4) 因體細(xì)胞核移植到卵細(xì)胞中可以獲得類似自然受精發(fā)育

25、的胚胎, 在卵細(xì)胞中必定存在使基因組重新程序化的因子.5) 將基因組重新程序化的因子導(dǎo)入體細(xì)胞可以使體細(xì)胞命運(yùn)逆轉(zhuǎn), 產(chǎn)生具有多能分化的干細(xì)胞.幾個(gè)關(guān)鍵的步驟1) 基因組重新程序化基因的篩選2) 基因組重新程序化基因的轉(zhuǎn)化3) 轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選與鑒定4) iPS細(xì)胞的功能驗(yàn)證常規(guī)胚胎干細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ジ杉?xì)胞1) 根據(jù)核移植可以判斷卵細(xì)胞中含有促使體細(xì)胞基因組重新程序化的因子.2) 胚胎干細(xì)胞可以持續(xù)維持多能分化的潛力, 表明有控制胚胎干細(xì)胞屬性(identity)的遺傳因素.3) 分離與鑒定與胚胎干細(xì)胞生成與維持的基因是逆轉(zhuǎn)體細(xì)胞程序化的前提.尋找決定胚胎干細(xì)胞命運(yùn)的

26、基因1) Yamanaka等選擇24個(gè)在胚胎干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)的基因作為胚胎干細(xì)胞決定候選基因.2) 將上述基因構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體中,它們處于Fbx15基因的調(diào)控順序下游, 并將它們轉(zhuǎn)化老鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF).3) Fbx15基因是胚胎干細(xì)胞專一性表達(dá)的.4) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)單個(gè)外源基因的導(dǎo)入不能獲得胚胎成纖維細(xì)胞的逆轉(zhuǎn), 但組合的轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生具有胚胎干細(xì)胞形態(tài)特征的細(xì)胞, 這些細(xì)胞被稱為iPS(induced pluripotent stem)細(xì)胞.見: Cell 126:663-676, 2006胚胎干細(xì)胞命運(yùn)決定基因篩選策略胚胎干細(xì)胞決定基因的篩選1) 上述小組在10個(gè)基

27、因組合產(chǎn)生MEF細(xì)胞逆轉(zhuǎn)的基礎(chǔ)上,采取排除法確定4個(gè)基因?yàn)镸EF細(xì)胞逆轉(zhuǎn)所必需, 分別為: Oct3/4, Klf4, Sox2和c-Myc.2) 在這初篩的4個(gè)基因中任意缺失一個(gè)基因,均不能產(chǎn)生類胚胎干細(xì)的特征.因此這4個(gè)基因是最低要求的逆轉(zhuǎn)MEF細(xì)胞的因子.3) Oct3/4, Klf4, Sox2和c-Myc四個(gè)基因轉(zhuǎn)化的MEF細(xì)胞可促使Fbx15和Nanog基因的表達(dá).4) Fbx15和Nanog基因的表達(dá)可作為篩選iPS細(xì)胞的標(biāo)記.iPS細(xì)胞功能的驗(yàn)證1) iPS-MEF細(xì)胞系具有類似天然胚胎干細(xì)胞的形態(tài)特征.2) iPS-MEF細(xì)胞系的Oct3/4和Nanog基因的啟動(dòng)子區(qū)核小體組

28、蛋白的乙?；蚄9的甲基化以及CpG雙堿基甲基化模式與胚胎干細(xì)胞類似.3) iPS-MEF細(xì)胞系的DNA芯片雜交檢測基因表達(dá)譜也與胚胎干細(xì)胞類似.4) 將iPS-MEF細(xì)胞系注入到裸鼠皮下細(xì)胞可產(chǎn)生畸胎瘤, 表明具有胚胎干細(xì)胞特征.iPS-MEF具多向分化潛能將iPS-MEF轉(zhuǎn)化細(xì)胞注入到裸鼠皮下組織后可產(chǎn)生的畸胎瘤含有不同的組織細(xì)胞,具多向分化潛能.逆轉(zhuǎn)的老鼠胚胎成纖維細(xì)胞具多向分化潛能Nanog更適合iPS細(xì)胞篩選因?yàn)橐訤bx15為標(biāo)記篩選的iPS-MEF與天然老鼠囊胚混合后不能生成嵌合成體, 其胚胎干細(xì)胞潛能競爭力差. 實(shí)驗(yàn)證明Nanog更適合.Nanog更適合iPS細(xì)胞篩選以Nano

29、g為標(biāo)記的篩選可獲得具有細(xì)胞增生的iPS及畸胎瘤分化的胚胎干細(xì)胞.轉(zhuǎn)化人類皮膚細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞Yu等的研究如下:1) 選擇14個(gè)涉及胚胎干細(xì)胞形成與維持相關(guān)的基因構(gòu)建到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中轉(zhuǎn)化體細(xì)胞.2) 根據(jù)不同的基因組合轉(zhuǎn)化體細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞效果, 確定4個(gè)基因即Oct4, Sox2, Nanog和Lin28足以轉(zhuǎn)化體細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞.3) 由人類皮膚體細(xì)轉(zhuǎn)化為胚胎干細(xì)胞的驗(yàn)證.由人類皮膚體細(xì)轉(zhuǎn)化為胚胎干細(xì)胞的驗(yàn)證1) iPS細(xì)胞具有人類自然胚胎干細(xì)胞的形態(tài).2) iPS細(xì)胞具有正常的核型.3) 具端粒酶活性.4) 細(xì)胞表面膜蛋白標(biāo)記與自然胚胎干細(xì)胞相同.5) 基因表達(dá)譜相一致.6) Oct4

30、啟動(dòng)子甲基化模式與自然胚胎干細(xì)胞相似.7) 具有發(fā)育成三胚層細(xì)胞的潛能, 來自iPS細(xì)胞的 畸胎瘤可分化為多種組織細(xì)胞.畸胎瘤的分化iPS細(xì)胞系接種到裸鼠肌肉組織產(chǎn)生畸胎瘤并分化出不同的組織細(xì)胞: 左, 神經(jīng)細(xì)胞, 內(nèi)胚層發(fā)育;右, 腸道細(xì)胞, 內(nèi)胚層發(fā)育.iPS細(xì)胞具有癌癥傾向1) iPS細(xì)胞可與天然小鼠胚胎囊胚期細(xì)胞混合并參于胚胎發(fā)育長成成年個(gè)體.2) 含有iPS來源的小鼠個(gè)體有一定的比例產(chǎn)生癌癥.3) 產(chǎn)生癌癥的原因: 1, LTR載體的影響; 2, c-Myc基因具有癌變的潛能.4) 路漫漫兮其修遠(yuǎn), .產(chǎn)生iPS細(xì)胞的多種方法Nature Biotechnology, 26:1246, 2008干細(xì)胞重新程序化方法比較染色質(zhì)重建與基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄時(shí)要以編碼DNA為模板合成mRNA前體, 但DNA分子纏繞在核小體上, 因此必需使DNA離開核小體.染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)染色質(zhì)重建依賴于組蛋白的修飾1) 核小體的修飾是染色質(zhì)水平進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的中心環(huán)節(jié).2) 核小體修飾的目的是促使核小體核心8聚體與DNA分子的結(jié)合或者松弛或者強(qiáng)化, 便于核小體移動(dòng)或固定, 使轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合或排斥.組蛋白的修飾目前已發(fā)現(xiàn)的組蛋白修飾:1)