基因表達及分析技術(shù)

1、基因表達及其分析技術(shù)生命現(xiàn)象的奧秘隱藏在基因組中，對基因組的解碼一直是現(xiàn)代生命科學(xué)的主 流。 基因組學(xué)研究可以說是當今生命科學(xué)領(lǐng)域炙手可熱的方向。從DNA測序 到SNP、拷 貝數(shù)變異(咿響er variation CNV)等DNA多態(tài)性分析，到DNA甲基化修飾等表觀遺傳學(xué)研究，生命過程的遺傳基礎(chǔ)不斷被解讀?；蚪M研究的重要性自然不言而喻。應(yīng)該說，DNA測序技術(shù)在基因組研究 中功不可沒，從San ger測序技術(shù)到目前盛行的新一代測序技術(shù)(NextGen eration Seque ncing NGS)到即將走到前臺的單分子測序技術(shù)，測序技術(shù)是基 因組解讀最重要的主流技術(shù)。而基因組測序、基因組多態(tài)

2、性分析、DNA甲基化修飾 等表觀遺傳分析等在基因組研究中是最前沿的課題。但是基因組研究終究類似“基 因算命”，再清晰的序列信息也無法真正說明一個基因的功能，基因功能的最后鑒 定還得依賴轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)，而轉(zhuǎn)錄作為基因發(fā)揮功能的第一步，對基因功能 解讀就變得至關(guān)重要。聲稱特定基因、特定SNP、特定CNV、特定DNA修飾等與某種表型有關(guān)，最終需要轉(zhuǎn)基因、基因敲除、突變、 RNAi、中和抗體等技術(shù)驗證，并必不可少要結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白修 飾等數(shù) 據(jù)?；?qū)崿F(xiàn)功能的第一步就是轉(zhuǎn)錄為mRNA或非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要研 究基因 轉(zhuǎn)錄為RNA的過程。在轉(zhuǎn)錄研究中，下面幾點是必須考慮的：1，基因是否

3、轉(zhuǎn)錄(基因是否表達)及基因表達水平高低(基因是低豐度表 達還是 中、高豐度表達)。特定基因有時候在一個細胞中只有一個拷貝的表達，而表達量會 隨細胞類型不同或發(fā)育、生長階段不同或生理、病理狀態(tài)不同而改變。因此任何基因表達檢測技術(shù)，其是否科學(xué)，就是要看能否檢測到低豐度表達基因，能否檢測到基因豐度的變化尤其是微弱變化，線性范圍是否寬廣等。 這方面的誤區(qū)在于，很多人過分強調(diào)特定技術(shù)能否檢測到低豐度基因的表達，忽視 了特定技術(shù)能否檢測到基因表達豐度微弱的改變。如果關(guān)注全基因組表達信息，那么目前最經(jīng)典的技術(shù)就是全基因組表達譜芯片技 術(shù)，這種基因芯片設(shè)計了數(shù)據(jù)庫中所有已知基因、EST和預(yù)測基因、EST的已知

4、轉(zhuǎn)錄本的探針，用來分析全基因組中已知基因、預(yù)測基因的已知轉(zhuǎn)錄本 的表 達信息。在利用基因芯片進行轉(zhuǎn)錄研究時，應(yīng)該選擇能檢測低豐度表達基因的芯片 技術(shù)，選擇可以反映基因表達微弱變化并且線性范圍廣的技術(shù)，比如?Affymetrix公司的轉(zhuǎn)錄研究方面的芯片。以GeneChip? Human Genome U133Plus 2.0 Array為例，該芯片可以分析多達38500個基因的47400個轉(zhuǎn)錄本（而 GeneChip? Human Genome U133A 2.0 Array 是對其中 14500 個 well- characterized human gen e的18400個轉(zhuǎn)錄本進行分析的）

5、。從精確度、重復(fù) 性、性價比等角度來講，芯片技術(shù)仍然是基因表達研究的首選技術(shù)。除人全基因組表達譜芯片外，Affymetrix公司還可以提供以下物種的全基 因 組表達譜芯片：大鼠，小鼠，擬南芥，大麥，牛，線蟲，狗，雞，柑橘，棉花，果 蠅，大腸桿菌，玉M，苜蓿，綠膿桿菌，蚊子/瘧原蟲、楊樹，豬，恒河 猴，水 稻，金黃色葡萄球菌，大豆，甘蔗，西紅柿，葡萄，小麥，爪蟾，酵 母，斑馬魚 等。2,對mRNA表達而言，更重要的問題是，每個基因的編碼區(qū)域由若干外 顯子組成，而特定基因在不同細胞類型中或不同發(fā)育、生長階段或不同生理、病理狀態(tài) 下，外顯子存在選擇性剪接(alternative splici ng)

6、,因而會出現(xiàn)不同 轉(zhuǎn)錄本。不 同轉(zhuǎn)錄本正是解釋同一基因具有不同功能甚至相反功能遺傳基礎(chǔ)。因此分析基因表 達，不僅要知道基因是否表達與表達水平高低，更重要的是需要知道特定基因表達 的轉(zhuǎn)錄本是什么。如果關(guān)注全基因組所有外顯子表達并希望預(yù)測每個基因選擇性剪接，那么基因芯 片仍然是該方面研究的經(jīng)典技術(shù)。以Affymetrix公司的GeneChip Human Exon 1.0 ST Array為例，該芯片可以分析已知的及預(yù)測的轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)的超過1百萬個外顯子簇的表達，分析選擇性剪接。這是迄今為止最全面的、唯一的同時可 以研究基因表達與選擇性剪接的基因芯片。Affymetrix公司也可以提供小鼠、大 鼠的

7、此類芯片，分別分析小鼠的1百萬個外顯子或大鼠的85萬個外顯子。3，基因調(diào)節(jié)分析。任何基因表達都是受到嚴格調(diào)控的，包括轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控和表觀 遺傳修飾等。如果關(guān)注特定轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的所有基因，那么ChIP on chip技術(shù)是必 須的。以 Asymetrix 公司的 Gen eChip Human Promoter 1.0R Array 為 例，該 芯片可以分析任何特定蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子與超過25500個啟動子的相互作用。每個 啟動子覆蓋10-12.5kb (轉(zhuǎn)錄起始位點下游2.5kb+上游7.5kb，對1300個癌基因而 言，上游延長至10kb)。如果分析特定轉(zhuǎn)錄因子在特定細胞類型的特定生長、發(fā)育階

8、段或特定生理、病理下調(diào)控基因表達的特點，該芯片是很好的工具。該芯片也覆蓋 了 UCSC in NCBI human genome assembly(Build 34)中注解的 59% 的 CpG 島， 該芯片同時可以用于DNA甲基化修飾的分析。Affymetrix公司也可以提供小鼠的 此類芯片，分析轉(zhuǎn)錄因子與28000個啟動子 的相互作用Array可以分析71個物種的數(shù)以千計的microRNA與Small nucleolar RNAs （sn oRNAs ）的表達。樣本問題。最科學(xué)的樣本應(yīng)該是同質(zhì)細胞。不同細胞類型，其基因表達是有 差異的，建立細胞類型特異的基因表達數(shù)據(jù)，才能真正揭示特定細胞類

9、型基因表達 的真實面貌。對于組織，制作組織切片，利用（免疫）組織化學(xué)技術(shù)對特定細胞類型 進行鑒定，進而利用激光顯微切割技術(shù)分離特定細胞類型，這是目前從組織中獲得 同質(zhì)細胞的關(guān)鍵技術(shù)。問題在于組織切片制備和（免疫）組織化學(xué)等環(huán)節(jié)可能造成 RNA的降解，針對這種情況，Affymetrix公司有專門分析福爾馬林固定的、石蠟 包埋的組織的全基因組表達的芯片GeneChip（R） Human X3P Array,該芯片設(shè)計的每 個基因的探針，都更靠近mRNA 3端位 置，因為mRNA越靠近3端越穩(wěn)定。對于醫(yī)學(xué)樣品的分組，臨床上對疾病、行為等的診斷、分類的公認標準是轉(zhuǎn)錄分 析中對樣本分組的必不可少的參考，

10、比如腫瘤樣本的病理學(xué)判讀、血液分 析中的各 種參數(shù)、心腦血管分析中的各種參數(shù)、精神類疾病診斷中的行為學(xué)參數(shù)等。優(yōu)秀的 高級別的科學(xué)論文，往往在樣本分組分類上非常嚴格，描述很清晰，篇幅很大。沒 有合格樣本及沒有合格樣本分組，任何下游分析技術(shù)都無法得出有價值數(shù)據(jù)。候選基因表達分析技術(shù)。在實際研究中，經(jīng)常會遇到兩類轉(zhuǎn)錄分析，全基因 組表達分析與候選基因表達分析。應(yīng)該說，只有通過全基因組表達分析，才能了解特定生命過程相關(guān)的所有基因表 達，從中鑒定出特定生命過程的關(guān)鍵候選基因（如轉(zhuǎn)錄因子）及相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)、 信號通路。關(guān)于候選基因表達分析技術(shù)，在實時定量PCR技術(shù)獨領(lǐng)風騷很多年后，新的技術(shù)不斷沖擊，包括

11、Affymetrix公司的Branch-DNA技術(shù)。該技術(shù)在分析基因表達 時，不是基于將模板進行PCR擴增的原理，而是檢測雜交于特異基因的一組特異探 針的信號，避免了 PCR過程引發(fā)的很多問題；而且可以進行單基因表 達分析或3- 36個基因表達的多重分析。本期基因快訊有專門介紹Branch-DNA技術(shù)的文獻。相 信Branch DNA技術(shù)很快會成為候選基因表達分析的主流技術(shù)?？傊珹ffymetrix全基因組表達譜芯片等技術(shù)被廣泛應(yīng)用于 人類和動物生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究中，如鑒定發(fā)育、生長、分裂、分 化、細胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生命過程的相關(guān)基因，鑒定疾病相關(guān) 基因。大量的研究在利用基因芯片技術(shù)鑒

12、定癌癥發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基 因，對癌癥進行分子分類/分期，尋找癌癥分子機制的關(guān)鍵分子，為癌癥診 斷篩選重要標志分子，為癌癥治療篩選重要的靶分子，預(yù)后分析 等而在作物遺傳育種領(lǐng)域，針對轉(zhuǎn)基因生物新品種培育，全基因組 表達譜芯片等技術(shù)也大有作為：1，高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)等農(nóng)業(yè)優(yōu)良性狀相關(guān)基因的鑒定：每個物種在自然界中都有不同品種， 傳統(tǒng)育種也產(chǎn)生了很多栽培種。不同品種、栽培種間性狀差異很明顯，因此深入分析表 型差異的遺傳機制，鑒定高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)等農(nóng)業(yè)優(yōu)良性狀相關(guān)基因?qū)D(zhuǎn)基因育種很重 要。利用中國豐富的種質(zhì)資源，通過各物種全基因組表達物種的全基因組表達芯片，包括：大豆基因組（包括大豆線蟲基因組、大豆疫霉

13、 菌基 因組）、玉M、小麥、大麥、水稻、苜蓿（含固氮菌）、楊樹（包括胡楊）、葡萄、 西紅柿、擬南芥、豬、牛、雞、甘蔗、棉花、柑橘等。2，轉(zhuǎn)基因生物安全的評估：轉(zhuǎn)基因生物安全的評估需要從多層次綜合進行，系統(tǒng)比較基因修飾作物與傳統(tǒng)育種作物是必須的。國際上這方面的評估正在形成相關(guān)理論技術(shù) 體系，具體包括：基因組層次（轉(zhuǎn)進去的目的基因是否對作物基因組穩(wěn)定性產(chǎn)生影響）， 轉(zhuǎn)錄組層次（從基因轉(zhuǎn)錄水平上評估轉(zhuǎn)進去的目的基因及其表達是否對作物全基因組表 達產(chǎn)生影響），蛋白組層次（轉(zhuǎn)進去的目的基因的蛋白產(chǎn)物是否對作物蛋白組學(xué)特征產(chǎn) 生影響）。其他包括代謝組層次，功能特征分析等。轉(zhuǎn)錄組學(xué)層次的分析是至關(guān)重要的， 而且技術(shù)相當成熟。已經(jīng)有科學(xué)家做了初步研究，結(jié)果顯示：傳統(tǒng)育種的大豆不同栽培 品種間基因表達是有差異的，這也從遺傳機制上解釋了大豆不同栽培品種間為什么有性 狀差異；更重要的是，該研究也顯示，轉(zhuǎn)基因大豆與其相應(yīng)的對照栽培種間的基因表達 差異非常小，也就是說，轉(zhuǎn)基因大