DB12-T839-2018茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法

1、ICS 65. 020. 20B 04DB12天 津 市 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB12/T 8392018茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法Method of identifying seed purity of eggplant by using SSR-based marker2018- 11 -07 發(fā)布2018-12-01 實(shí)施天津市市場(chǎng)和質(zhì)量監(jiān)督管理委員會(huì) 發(fā)布DB12/T 8392018 I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1. 12009給岀的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市農(nóng)村工作委員會(huì)提岀并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龍江省農(nóng)業(yè)科 學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研

2、究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蘭青闊、王利英、趙新、王成、蘭璞、喬軍、劉靖、陳銳、關(guān)海濤、張耀中、 焦賀敏。DB12/T 8392018 茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了茄子種子純度SSR分子標(biāo)記鑒定方法的原理、儀器設(shè)備及試劑、方法步驟、純度計(jì)算。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于茄子單交種的純度鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本標(biāo) 準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 3543. 2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程抨樣GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本

3、文件。3. 1種子純度 seed purity種子在SSR分子標(biāo)記帶型方面典型一致的程度，用具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)占鑒定樣品種子 粒數(shù)的百分率表示，以反映某品種特征特性的一致性程度。3. 2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) po I ymerase cha i n react i on （PGR）一種在體外通過酶促反應(yīng)擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。3. 3簡(jiǎn)單重復(fù)序列 simple sequence repeat （SSR）由幾個(gè)核昔酸（16個(gè)）為重復(fù)單位聚集而成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)至幾百個(gè)bp （一般為100200）的串聯(lián) 重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星序列或短串聯(lián)重復(fù)序列，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。3. 4分子

4、標(biāo)記 mo I ecu I ar marker以蛋白質(zhì)、核酸分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)，鑒定生物在遺傳上的差異。4原理SSR分布于茄子整個(gè)基因組，每個(gè)位點(diǎn)上重復(fù)單位的數(shù)目不同造成了品種間的多態(tài)性，利用PCR技術(shù) 將多態(tài)的SSR擴(kuò)增岀來，通過電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，利用電泳圖譜進(jìn)行茄子種子純度鑒定。5儀器設(shè)備及試劑5. 1儀器設(shè)備PCR儀；測(cè)序電泳槽；水平電泳槽；高壓電泳儀(3000 V, 400 mA, 400 W)；萬分之一電子天平； 微量加樣器；磁力攪拌器；臺(tái)式離心機(jī)；紫外-可見成像系統(tǒng)；膠片觀察燈；水平搖床；高壓滅菌鍋； pH計(jì)等。5.2試劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)；三羥甲基氨基甲烷(Tr

5、is)；鹽酸(HCL 36%)；十二烷基硫酸 鈉(SDS)；氯化鈉(NaCl)；氫氧化鈉(NaOH)；硼酸；去離子甲酰胺；漠酚藍(lán)；二甲苯青FF；甲叉 雙丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；親和硅烷；剝離硅烷；無水乙醇；四甲基乙二胺(TEMED)；過硫酸鉉; 冰醋酸；硝酸銀；甲醛溶液(37%) ； Taq DNA聚合酶(含Mg*的10XPCR緩沖液)；四種脫氧核糖核昔酸 (dNTPs) ； SSR引物；瓊脂糖；Gold View染料；定性PCR試劑盒；DNA提取試劑盒；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餡 水或符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水等。除特殊說明外，所用試劑均為分析純?cè)噭?.3溶液配制相關(guān)溶液配制方法見附錄A。

6、6方法步驟6. 1取樣檢測(cè)樣品的分樣和保存，應(yīng)符合GB/T 3543.2的規(guī)定，從中隨機(jī)取100粒以上種子，取其父母本材料 各10份。6. 2單粒種子的DNA提取6. 2. 1樣品預(yù)處理在玻璃培養(yǎng)皿底部墊上一層厚度約3mm的棉花或?yàn)V紙，用水浸濕后均勻地撒上檢測(cè)樣品，再于表面 覆蓋一層紗布，置于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件為16h 35C光照培養(yǎng)，8h 28C暗培養(yǎng)，待種子長(zhǎng)岀子葉 后備用。DNA 提取取單株幼苗子葉，放入1.5 mL離心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL離心管中。將DNA提取液預(yù)熱 到65 C,每管放入400)1L混合樣品，將離心管置于65 C金屬浴或水浴鍋中，保溫30 min后取

7、下，向 離心管中加入400 gL 24:1氯仿-異戊醇(V:V),振蕩混勻。10 000 g離心10 min。將上清液200嘰轉(zhuǎn) 入另一支1. 5 mL離心管，加入400 |iL -20 C預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA。10 000 g離心1 min,棄上清液， 加入500嘰乙醇乙酸鉉溶液，6000 g離心5 min收集沉淀。加入100 gL TE (pH8.0)溶液溶解DNA。DNA的濃度和質(zhì)量將DNA適當(dāng)稀釋或濃縮，使其0D河值在0.10.8的區(qū)間內(nèi)，測(cè)定并記錄其在260 nm和280 nm的吸光 度。以1個(gè)0D滅值相當(dāng)于50 mg/L DNA濃度來計(jì)算純化DNA的濃度，并進(jìn)行DNA凝膠電泳檢測(cè)

8、DNA完整性。 DNA溶液的0D260/0D280值應(yīng)在1. 7-2. 0之間，或質(zhì)量能復(fù)合檢測(cè)要求。6.3分子標(biāo)記篩選DB12/T 8392018 用15對(duì)核心引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增雙親及送檢樣品各10份DNA,篩選帶型清晰，雙親間差異大，互 補(bǔ)性好的引物作為純度鑒定的SSR分子標(biāo)記。6. 4 PCR擴(kuò)增6. 4. 1反應(yīng)體系總體積10卩L,包括5卩L超純水、1卩L含Mg*的10XPCR緩沖液、0. 8卩L dNTPs (2. 5mmol/L)、 0. 6 p LSSR引物(10 p mol/L)、1 p L Taq DNA聚合酶(2. 5U/p L)、1 卩 LDNA (3050 ng/

9、p L), 混勻。6. 4.2反應(yīng)程序94 C預(yù)變性5 min； 94 C變性 1 min, 55 C退火30 s, 72 C延伸 1 min,循環(huán)35次；72 C延伸 10 min； -20 C保存?zhèn)溆谩?.5變性聚丙烯酰氨凝膠電泳按照附錄C規(guī)定的方法，進(jìn)行4. 5%變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。7 純度計(jì)算以篩選岀來的SSR分子標(biāo)記為引物擴(kuò)增送檢樣品的DNA,通過帶型統(tǒng)計(jì)，用具有本品種特異帶型的種 子粒數(shù)占檢測(cè)樣品種子粒數(shù)的百分率表示純度，計(jì)算公式如下：純度 =具有本品種特異帶型的種子粒數(shù)檢測(cè)樣品種子粒數(shù)X 附錄A(規(guī)范性附錄)溶液配制A. 1 DNA提取液含有200 mmol

10、/L Tris-HCl (pH 8. 0) , 250 mmol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA, 0. 5%SDS,經(jīng)高壓蒸 汽滅菌后使用。A. 2引物稀釋按照引物合成單的說明先配制100 p mol/L的儲(chǔ)存液，取適量?jī)?chǔ)存液稀釋40倍，配制濃度為2. 5 mmol/L的使用液。A. 3 6 X變性上樣緩沖液去離子甲酰胺49 mL, 0. 5 mol/L的EDTA溶液(pH 8. 0) ImL,漠酚藍(lán)0. 125 g,二甲苯青0. 125 g。A. 4 10X電泳緩沖液Tris 108g,硼酸55 g, 0. 5 mol/L EDTA (pH 8. 0)溶液37 mL,定容至

11、1000 mLA. 5 40%丙烯胺膠丙烯酰胺19。g,甲叉雙丙烯酰胺10 g,定容至50。mLA. 6 A. 6 4. 5%丙烯胺膠尿素450 g, 10X電泳緩沖液100 mL, 40%丙烯酰胺膠112. 5 mL,定容至1000 mLA. 7 1 %親和硅烷20卩L親和硅烷，20卩L冰醋酸，加無水乙醇至2 mL現(xiàn)用現(xiàn)配。A. 8 2%剝離硅烷1 mL剝曷硅烷，49 mL三氯甲烷。A.9 10%過硫酸鍍0. 1 g過硫酸鉉溶于1 mL超純水中。現(xiàn)用現(xiàn)配。A. 10固定液200 mL冰醋酸，定容至2000 mLA. 11染色液4 g硝酸銀，定容至2000 mLA. 12顯影液2000 mL蒸

12、餡水中加入40 g氫氧化鈉和10 mL甲醛。附錄B（規(guī)范性附錄）15對(duì)核心引物15對(duì)核心引物見表B. 1表B. 1 15對(duì)核心引物表序號(hào)引物引物序列（53，）退火溫度笆1QZ-1F: GGATCAACTGAAGAGCTGGTGGTT R: CAGAGCTTCAATGTTCCATTTCACA552QZ-2F: ACGTCTCATCCGAAATATAATGCCGC R: GTTTGATAAGAAGGGCAAGCTCAGTCC553QZ-3F: ACAAGACGAAAGTGTGCAGACCAG R: GTTTGAAAGTGAAGAGTCCGTGCAGT554QZ-4F: ATGTTCTTCCCTTT

13、TTCCCCTTTTR: GTTTCCAAGAAAGAAGAAAACCCCACA555QZ-5F: ATCAAGATGAACAAGACTAAGGAGTGC R: GTTTCTTCAACCTGTCTTTAGCCCA556QZ-6F: ATCATTGCCGIATCAGGTTCACTCR: GTTTGGGAAAGTTGAGAATTTCTTGGGG557QZ-7F: ACAGGCATCACAAAGCATTATCAG R: GTTTCAGAGTGAGCCTCTGCTCC558QZ-8F: ACAACATTTCTAAGGGCCTTCACG R: GTTTGGGCATATTTGGCACTTGTTGAAT55

14、9QZ-9F: ATTTACTATGCTACTTCACACCCACC R: GTTTACTGATCGCAGGAAAAGGGAAAG5510QZ-10F: ATGTGTGAACTCAAATGGAAGGGA R: GTTTCGAATTGCTTTTTGGTGCATGTAG5511QZ-11F: ATTGGTGAACGATGATCCTGAATGR: GTTTAGAGAATGGGATGAGATTGCTTCG5512QZ-12F: ATTGACGGTGGAAAAGGAGTTGGT R: GTTTGGCGGCTTGATGATTTAAGTTTTG5513QZ-13F: ATCAAATGGGAGAAAATACT

15、GCATCR: GTTTGGCTTAAACACACAACGTATATGGAC5514QZ-14F: ACCTTACGCAATTTACACTTCCCC R: GTTTCAATGGCGTCACCTCTCTCTCT5515QZ-15F: AGTGCATTTCTCAAATCAAAAGGG R: GTTTCAATTTCACAGGCTCCTGCATTA557DB12/T 8392018附錄C（規(guī)范性附錄）制膠過程C. 1凝膠制作將玻璃板洗凈，用無水乙醇擦兩遍，晾干。在長(zhǎng)板上涂1%親和硅烷，在短板上涂2%玻璃硅烷。操作 過程中防止兩塊玻璃板互相污染。待玻璃板徹底干燥后，將其組裝好，用水平儀調(diào)平。取4. 5%丙烯酰胺 膠80 mL,加入TEMED 80卩L和10%過硫酸鉉400卩L,迅速混勻后灌膠。灌膠過程中防止氣泡產(chǎn)生。灌 膠結(jié)束后，將梳子齒向外，輕輕的插入膠中，使其聚合1 h以上。6. 2預(yù)電泳待膠凝固后，拔岀梳子，將電泳槽組裝好，80 W恒功率下預(yù)電泳15 min20 min。C. 3變性在20卩L PCR產(chǎn)物中加入4卩L 6X變性上樣緩沖液，混勻后，在PCR