動物細胞工程動物細胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)技術課件 高中生物競賽

1、動物細胞的大規(guī)模離體培養(yǎng)技術一、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)概述（一）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的概念 指在人工條件（除滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，還要進行pH和溶解氧的最佳控制）下，在細胞生物反應器中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產生物制品的技術。 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術（large-scale culture technology） 人工條件下，動物細胞在反應器中進行大量地、高密度培養(yǎng)，以生產珍貴生物制品的技術。 pH溫度溶氧發(fā)酵工藝等條件發(fā)展簡史1907 Harrison創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)技術； 1951 Earle開發(fā)動物細胞體外培養(yǎng)合成培養(yǎng)基；1957 Graff應用灌注技術，培養(yǎng)密度達1010個

2、/L；1962 Capstick成功實現(xiàn)小鼠腎細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，標志著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的開始；1967 Van Wezel成功地以DEAE-Sephadex A50為載體，實現(xiàn)動物細胞的載體培養(yǎng)；1975 Kohler和Milstein成功建立單克隆抗體技術；1975 Sato用激素代替血清使垂體細胞株在無血清介質中生長成功，預示無血清培養(yǎng)的誘人前景；1986 Deme Biotech公司首次成功地用微囊化技術大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞來生產單克隆抗體；1989 Konstantinovti首次提出大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中的生理狀態(tài)控制技術，更新培養(yǎng)工藝的優(yōu)化控制理論。發(fā)展簡史動物細胞培養(yǎng)技術應用

3、 疫苗生產上的應用 已實現(xiàn)商業(yè)化生產的產品有口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、骨髓灰質炎病毒疫苗、牛白血病疫苗 干擾素生產上的應用 自1957年發(fā)現(xiàn)干擾素以來，經(jīng)歷了自然干擾素、基因重組干擾素和蛋白質工程干擾素等3個發(fā)展階段。英國Wellcome公司為了滿足臨床實驗的需要，采用8000L Namalwa細胞生產干擾素。 DMEM培養(yǎng)基胎牛血清其他成分錐形瓶逐級放大培養(yǎng)加堿（碳酸氫鈉）加糖（葡萄糖）灌注培養(yǎng)液微載體5L種子罐培養(yǎng)培養(yǎng)液50L生物反應器接種狂犬病毒出液口收獲病毒Vero細胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝單克隆抗體生產上的應用 應用動植物細胞生產單克隆抗體是一條經(jīng)濟、可靠的途徑。 英國Celltech公

4、司采用無血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應器中培養(yǎng)雜交瘤細胞生產單克隆抗體；國內也已成功地應用中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)和微載體培養(yǎng)動物細胞生產單克隆抗體作為血型定型試劑。 其他基因重組產品生產上的應用 細胞能精確地轉錄、翻譯和加工較大或更復雜的克隆蛋白質；可以簡化蛋白質的分離提純；美國Endotronic公司用中空纖維生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞生產出免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生長激素等。 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的一般工藝流程1 組織塊；2組織塊碎片；3消化；4離心；5原代培養(yǎng)；6傳代培養(yǎng)；7液氮罐保存細胞；8復蘇培養(yǎng)；9擴大培養(yǎng)；10大規(guī)模生物反應器培養(yǎng)二、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 根據(jù)動物細

5、胞的培養(yǎng)特性不同，可采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)三種培養(yǎng)方法進行大規(guī)模培養(yǎng)。1、懸浮培養(yǎng) 指細胞在生物反應器中自由懸浮生長增殖的培養(yǎng)方法。 主要用于非貼壁依賴型細胞培養(yǎng)，雜交瘤細胞、血液白細胞、淋巴細胞、某些腫瘤細胞等屬于此類細胞。貼壁型細胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當生物反應器中實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點： 操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質和傳氧效果比較好，容易擴大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設備的設計和實際操作中可以借鑒許多細菌發(fā)酵的經(jīng)驗。懸浮培養(yǎng)的缺點： 不能采用灌流培養(yǎng)，導致細胞密度較低，另外只有少數(shù)細胞適合懸浮培養(yǎng)。攪拌式生物反應器氣升式生物反應器2、貼壁培養(yǎng) 指細胞貼

6、附在一定的固相表面進行的培養(yǎng)。 目前為細胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質主要有旋轉瓶、中空纖維、細胞工廠和微載體等。其中微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，是目前公認的最有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術。貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點： 容易更換培養(yǎng)液；容易采用灌注式培養(yǎng)、不需過濾系統(tǒng)；同一設備可采用不同的培養(yǎng)液/細胞的比例、適用于所有類型細胞。貼壁培養(yǎng)的缺點： 擴大培養(yǎng)比較困難，投資大，占地面積大；不能有效監(jiān)測細胞的生長。3 2 旋轉瓶培養(yǎng)14 中空纖維培養(yǎng) 細胞工廠培養(yǎng) 微載體培養(yǎng)目前為細胞提供貼附表面的培養(yǎng)基質主要有旋轉瓶、中空纖維、細胞工廠和微載體等。兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點（1）旋轉瓶培養(yǎng) 細

7、胞貼附在轉瓶或轉管的內表面，培養(yǎng)液隨旋轉而流動，細胞交替接觸營養(yǎng)和空氣，利于細胞吸收營養(yǎng)、進行氣體交換。細胞在體內、體外的生存空間：存在差異三維空間，高密度生長二維空間，單層生長，生長密度低體內體外（2）中空纖維培養(yǎng) 中空纖維培養(yǎng)技術模擬細胞在體內生長的三維狀態(tài)，利用一種人工的“毛細血管”即中空纖維來為細胞提供物質代謝條件。 中空纖維是細微的管狀結構，管壁為極薄的半透膜，水分子、小分子營養(yǎng)物質和氣體可以通過。管壁表面有許多海綿狀多孔結構，細胞能在上面貼壁生長。 細胞接種到中空纖維的外表面，而充氧的培養(yǎng)液灌流到中空纖維的內腔。貼附在外表面的細胞吸取內腔滲出的營養(yǎng)，迅速生長繁殖。一段時間后細胞占據(jù)

8、中空纖維外壁所有空間，并在纖維表面堆積。（3）細胞工廠培養(yǎng)由一組長方形培養(yǎng)小室組成。(a)向培養(yǎng)室內灌注培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在各培養(yǎng)小室之間流動 ；(b)細胞工廠轉動90。，每個培養(yǎng)小室液體被分隔，氣相仍到達各個培養(yǎng)小室；(c)向下放平，封閉入口，或者連接到5CO2通氣管上（4）微載體培養(yǎng)微載體（Microcarrier）：是直徑60-250m的適用于貼壁依賴型細胞生長的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。良好微載體的特點：1、好的生物相容性：無毒無害；2、好的黏附性：適于細胞附著、伸展和增殖，一般帶正電荷；3、大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一； 4、良好的傳質性能；5、強的機械性能：

9、保護細胞、重復利用；6、好的熱穩(wěn)定性：適合高壓蒸汽滅菌。微載體培養(yǎng)的操作過程： 微載體培養(yǎng)動物細胞也經(jīng)過以上四步。大致可以分為五個階段，即培養(yǎng)初期階段、黏附貼壁階段、維持培養(yǎng)階段、細胞收獲階段、微載體培養(yǎng)的放大階段。培養(yǎng)初期階段：保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的p和溫度，對數(shù)生長期細胞接種至1/3體積的培養(yǎng)基中。黏附貼壁階段：緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，增加攪拌速度保證完全均質混合。維持培養(yǎng)階段：隨細胞增殖，微球變重，增加攪拌速率。經(jīng)過3天左右，培養(yǎng)液呈酸性，需換液。細胞收獲階段：排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗1次，加入酶，快速攪拌，解離收集細胞及其產品。微載體培養(yǎng)的放大階段：增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行

10、放大。微載體培養(yǎng)的優(yōu)點：1、表面積體積大 ，單位體積培養(yǎng)液的細胞產率高。2、把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合， 兼有兩者的優(yōu)點。3、可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況。4、培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間?。粍趧訌姸刃?；放大容易，使大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞成為可能。5、接種與收獲方便，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用率較高。微載體培養(yǎng)的缺點： 細胞生長在微載體表面，培養(yǎng)過程中連續(xù)攪拌會損傷微載體表面的細胞，而且培養(yǎng)后期細胞容易從微載體上脫落下來。 為克服傳統(tǒng)的實心微載體的不足，現(xiàn)開發(fā)出大孔微載體。大孔微載體內部具有網(wǎng)狀結構的小孔，細胞在其內部生長，保證細胞充分的生長空間，使細胞免受機械損傷，增加細胞貼壁的

11、穩(wěn)定性。3、固定化培養(yǎng) 將動物細胞與水不溶性載體結合起來再進行培養(yǎng)的方法。 具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點，細胞易與產物分開，有利于產物分離純化。 在動物細胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法。三、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)反應器類型滿足：低剪切力、良好的混合狀態(tài)、合適氧濃度、等。 20世紀70年代以來，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應器有了很大的發(fā)展，種類越來越多，規(guī)模越來越大。 動物細胞培養(yǎng)用生物反應器類型 懸浮培養(yǎng)反應器貼壁培養(yǎng)反應器包埋培養(yǎng)反應器攪拌反應器攪拌反應器（微載體培養(yǎng)）流化床反應器氣升式反應器玻璃珠床反應器固定床反應器中空纖維反應器

12、中空纖維反應器陶質矩形通道蜂窩狀反應器陶質矩形通道蜂窩狀反應器動物細胞培養(yǎng)反應器1、攪拌罐式生物反應器 與傳統(tǒng)的微生物反應器相類似，只是根據(jù)動物細胞培養(yǎng)的特性，作適當?shù)恼{整。要求攪拌器轉動時產生的剪切力小，混合性能好，同時通氣培養(yǎng)過程中盡量減小操作對細胞的損傷程度而又能達到充足供氧的目的。 2、氣升式生物反應器 自1979年Katinger等首次用氣升式生物反應器成功地進行了動物細胞的懸浮培養(yǎng)以來，氣升式生物反應器在動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應用一直是生物工程學家關注和熱衷的焦點。 3、中空纖維生物反應器 中空纖維生物反應器是個特制的圓筒，圓筒里面封裝著數(shù)千根中空纖維。纖維是一種細微的管狀結構，類

13、似于動物組織內的毛細血管，中空纖維的外徑一般為100500um，管壁厚度約5075um，管壁是極薄的半透膜，似海綿，富含毛細管。在中空纖維生物反應器中就形成了兩個空間：一是“內室”，即纖維管內空間，可灌流無血清培養(yǎng)液供細胞生長；二是“外室”，即纖維管與管之間的間隙；細胞接種到外室，細胞貼附在外室的管壁上，并迅速吸取從內室滲透出來的養(yǎng)分，迅速生長繁殖。 中空纖維反應器具有無剪切力和高傳質等優(yōu)點。 中空纖維生物反應器的總體發(fā)展趨勢是讓細胞在管束外空間生長，以達到更高的培養(yǎng)細胞密度。中空纖維材質可以是纖維素、改性纖維素、醋酸纖維、聚丙烯、聚砜、銅氨人造纖維、聚甲基丙烯酸甲酯及其他聚合物。 大規(guī)模HE

14、K293細胞發(fā)酵培養(yǎng) 重組腺病毒的純化 實時HPLC質量監(jiān)測技術四、大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術的操作方式1、分批式培養(yǎng)2、流加式培養(yǎng) 3、半連續(xù)式培養(yǎng)4、連續(xù)式培養(yǎng) 5、灌注式培養(yǎng)1、分批式培養(yǎng) 將細胞和培養(yǎng)液一次性轉入生物反應器內，培養(yǎng)過程中體積不變，不添加其他成分，待細胞增長和產物形成積累到適當?shù)臅r間，一次性收獲細胞、產物、培養(yǎng)基。 2、流加式培養(yǎng) 將終體積1/31/2的培養(yǎng)液裝入反應器中，適宜條件下接種細胞，培養(yǎng)過程中流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)液，使細胞持續(xù)生長至較高密度、目標產品達到較高水平。 采用機械攪拌式生物反應器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞。 3、半連續(xù)式培養(yǎng) 也稱為重復批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間取出部分培養(yǎng)物，再用新培養(yǎng)液補足到原有體積，維持反應器內總體積不變。特點：（1）培養(yǎng)物的體積逐步增加； （2）可進行多次收獲； （3）細胞可持續(xù)指數(shù)生長，保持產物和細胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)很長時間。4、連續(xù)式培養(yǎng) 將細胞接種于一定體積的培養(yǎng)基，細胞達最大密度之前，以一定速度連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，同時含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應器流出，以保持培養(yǎng)體積恒定。 細胞可在穩(wěn)定狀態(tài)下生長，環(huán)境條件如營養(yǎng)物質濃度、產物濃度、pH可恒定，可有效延長細胞的對數(shù)生長期。5、灌注式培養(yǎng) 細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增