實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介、結(jié)果分析及報(bào)告周向陽(yáng)

1、廣西臨床檢驗(yàn)中心周向陽(yáng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介、結(jié)果分析及報(bào)告 PCR技術(shù)簡(jiǎn)介1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析3 結(jié)果報(bào)告的要點(diǎn)分析41985年，Kary.B.Mullis教授發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的PCR技術(shù)。1993年， Kary.B.Mullis因該技術(shù)的發(fā)明而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 一、 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR：Polymerase Chain Reaction)PCR反應(yīng)過程93 98 變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂湣?7 65 退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部形成雜交鏈 。70 75 延伸：耐熱DNA聚合酶按53方向催化以引物為起始點(diǎn)的延伸反應(yīng)。 循環(huán)次數(shù) D

2、NA的鏈數(shù) 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10億 PCR特點(diǎn)：高效擴(kuò)增、忠實(shí)復(fù)制PCR技術(shù)原理PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)和分析ladderPCR fragment二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real time Quantitative PCR)定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板起始濃度進(jìn)行定量分析的方法。TaqMan作用機(jī)理reverse primerRQforward primer33553551. Polyme

3、risationprobeRQ33553552. Strand displacementQ33553553. CleavageR3553554. Polymerisation completedQR3每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位信號(hào)信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比普通PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR開管操作、需要后處理、易造成污染，假陽(yáng)性率高。閉管操作、無(wú)需后處理、避免了污染，防止假陽(yáng)性。PCR結(jié)束后，對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行分析，不能定量，重復(fù)性差。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增，在指數(shù)擴(kuò)增期對(duì)起始模板進(jìn)行定量，重復(fù)性好。人工分析結(jié)果，操作復(fù)雜，存在誤差。儀器自動(dòng)分析，操作簡(jiǎn)單，

4、增加了靈敏度和客觀性。與普通PCR的區(qū)別實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用病原體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)基因表達(dá)研究基因表達(dá)差異分析親子鑒定、個(gè)體識(shí)別基因分型三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果分析擴(kuò)增曲線的認(rèn)識(shí)結(jié)果分析時(shí)幾個(gè)基本概念數(shù)據(jù)分析的一般流程樣本復(fù)檢的一般情況PCR擴(kuò)增曲線線性圖擴(kuò)增曲線線性圖譜：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle number）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度（Delta Rn）?；€期指數(shù)增長(zhǎng)期線性增長(zhǎng)期平臺(tái)期閾值線CT值基線期指數(shù)擴(kuò)增期平臺(tái)期線性擴(kuò)增期擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖譜：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle number）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度（Delta Rn）。PCR擴(kuò)增曲線對(duì)數(shù)圖擴(kuò)增曲線線性基線期：指PCR反應(yīng)處

5、于起始階段。此階段，擴(kuò)增產(chǎn)物很少，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)很低，反應(yīng)了系統(tǒng)背景情況。指數(shù)增長(zhǎng)期：指PCR達(dá)到其最大的擴(kuò)增階段，理想條件下，每一循環(huán)后，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)倍增加。線性增長(zhǎng)期：指PCR達(dá)到穩(wěn)定的線性擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物呈幾何倍數(shù)增加。平臺(tái)期：由于原料消耗殆盡，擴(kuò)增減緩，熒光信號(hào)不再隨循環(huán)數(shù)增加而增加。S型曲線的四個(gè)特征性階段結(jié)果分析時(shí)的幾個(gè)基本概念基線（Baseline）閾值線（Threshold）Ct值（Cycle threshold）基線基線（Baseline）：擴(kuò)增曲線中的水平部分。調(diào)整原則：如果Ct值18，不需調(diào)整，使用自動(dòng)分析結(jié)果； 如果Ct值18，修改終點(diǎn)，再分析一次； 起點(diǎn)一般

6、取36，終點(diǎn)一般取1215。閾值線閾值線（Threshhold）：熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。手動(dòng)調(diào)節(jié)閾值線的原則：要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正的信號(hào)是熒光信號(hào)超過域值。Ct值Ct（Cycle Threshhold）值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 Ct 值（ threshold value ）。PCR擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，是實(shí)時(shí)

7、熒光定量PCR判斷陰、陽(yáng)性和進(jìn)行定量分析的依據(jù)。數(shù)據(jù)分析一般流程曲線分析（Amplification Plot）標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（Standard Curve）定值濃度或Ct值數(shù)據(jù)分析三部曲數(shù)據(jù)分析一般流程該步驟主要是對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行整體或單個(gè)的調(diào)整，主要包括：對(duì)數(shù)曲線與線性曲線的轉(zhuǎn)換、模板或內(nèi)標(biāo)檢測(cè)探針的選擇、基線的調(diào)整、閾值的設(shè)定等幾個(gè)方面。曲線分析（Amplification Plot）數(shù)據(jù)分析一般流程對(duì)數(shù)曲線與線性曲線的轉(zhuǎn)換：一般情況下，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析都是在線性曲線基礎(chǔ)上進(jìn)行的，因此在實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)束后，需先將對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線轉(zhuǎn)換為線性曲線，以便于后續(xù)的分析。曲線分析（Amplificatio

8、n Plot）對(duì)數(shù)曲線與線性曲線的轉(zhuǎn)換對(duì)數(shù)曲線線性曲線數(shù)據(jù)分析一般流程檢測(cè)通道的選擇：該步驟主要是由于多色熒光檢測(cè)在PCR檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，比如含有內(nèi)標(biāo)的試劑，內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)通道與目的基因的檢測(cè)通道不同，因此需根據(jù)需求選擇不同的通道進(jìn)行結(jié)果分析。曲線分析（Amplification Plot）對(duì)數(shù)曲線與線性曲線的轉(zhuǎn)換目的基因：FAM內(nèi)標(biāo)：HEX數(shù)據(jù)分析一般流程基線的調(diào)整：其作用直觀反應(yīng)為曲線基線形狀的高低或均一性變化。通常情況下，選擇自動(dòng)分析，此時(shí)儀器會(huì)針對(duì)每條曲線進(jìn)行優(yōu)化分析，因此效果通常比較好。在基線自動(dòng)分析的基礎(chǔ)上，如果出現(xiàn)某些形狀異常的曲線，則在其他結(jié)果分析完成后，再單獨(dú)對(duì)異常曲線進(jìn)

9、行手動(dòng)基線調(diào)整分析。曲線分析（Amplification Plot）數(shù)據(jù)分析一般流程手動(dòng)基線設(shè)定原則：1.基線的結(jié)束點(diǎn)應(yīng)在進(jìn)入線性期的前幾個(gè)循環(huán)；2.基線開始點(diǎn)應(yīng)避開反應(yīng)開始時(shí)不穩(wěn)定的幾個(gè)循環(huán)；3.基線應(yīng)選擇比較平坦的區(qū)域；4.基線設(shè)定以剛好超過正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。曲線分析（Amplification Plot）自動(dòng)基線與手動(dòng)基線自動(dòng)分析結(jié)果基線設(shè)定為起始值為6，結(jié)束值為12數(shù)據(jù)分析一般流程閾值設(shè)定：在基線調(diào)整后則可進(jìn)行閾值設(shè)定，一般選擇人工閾值設(shè)定，即通過人為的移動(dòng)閾值線，到達(dá)良好分析效果的目的。閾值的高低直接關(guān)系著最后的定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。閾值設(shè)定的原則：閾值線一般置于曲線的指數(shù)

10、擴(kuò)增初期，通常是曲線傾斜程度整體一致的地方。曲線分析（Amplification Plot）閾值線的設(shè)定閾值線三原則：指數(shù)擴(kuò)增初期、整體曲線傾斜程度一致、高于陰性對(duì)照的地方數(shù)據(jù)分析一般流程整體曲線的觀察：分析是否存在污染（主要是試劑污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的異常曲線情況；陰性對(duì)照分析：觀察是否存在污染；陽(yáng)性對(duì)照分析：觀察是否在質(zhì)控范圍內(nèi)；標(biāo)準(zhǔn)品分析：觀察標(biāo)準(zhǔn)品分布是否均勻，梯度是否正常，Ct值是否正常；曲線分析（Amplification Plot）數(shù)據(jù)分析一般流程該面板主要用于標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)的分析，通過對(duì)曲線各個(gè)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)，可以判斷實(shí)驗(yàn)定量的準(zhǔn)確程度或者試劑的穩(wěn)定程度。其主要包括

11、三個(gè)參數(shù)：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（線性相關(guān)性）。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（Standard Curve）PCR擴(kuò)增的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0(1+E)nn: 擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)無(wú)量 X0：初始模板量E：擴(kuò)增效率 等式僅在限定的擴(kuò)增指數(shù)增長(zhǎng)期成立。超過此時(shí)期后，擴(kuò)增過程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率，最終達(dá)到平臺(tái)，不再擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光PCR定量原理上圖為外標(biāo)定量方法原理圖。模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣本的擴(kuò)增效率一致。 Log(濃度)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷

12、貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中的起始模板量。k=-1/log(1+E)CtLog C0標(biāo)準(zhǔn)曲線分析斜率、截距、相關(guān)性數(shù)據(jù)分析一般流程Slope（斜率）：理論值為-3.32。可以從兩個(gè)方面來(lái)分析，首先是標(biāo)準(zhǔn)曲線的10倍梯度關(guān)系，如果梯度正確，斜率數(shù)值會(huì)比較接近理論值；其次是試劑的擴(kuò)增效率，當(dāng)梯度正確的情況下，擴(kuò)增效率越高越接近理論值。Intercept（截距）：不同公司的試劑截距有很大的不同，主要是指只有1個(gè)病毒擴(kuò)增時(shí)，曲線出現(xiàn)的Ct值。R2（線性相關(guān)性）：指示本次實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系。注：優(yōu)質(zhì)試劑的標(biāo)準(zhǔn)品每次實(shí)驗(yàn)的參數(shù)是比較穩(wěn)定的，做質(zhì)控分析后偏差應(yīng)在2SD范圍

13、內(nèi)，Ct值變異系數(shù)應(yīng)小于10%。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析（Standard Curve）數(shù)據(jù)分析一般流程通過上述步驟分析后，可以得到一個(gè)比較準(zhǔn)確的定量結(jié)果或Ct值，如果在上述步驟中沒有記錄到異常曲線或者情況，則可以發(fā)出正確的報(bào)告，對(duì)于異常的曲線或者情況，則需單獨(dú)分析，確定復(fù)檢的必要性。定值濃度或Ct值復(fù)檢的一般情況-失控陽(yáng)性質(zhì)控或陽(yáng)性樣本的失控陰性質(zhì)控或陰性樣本的失控失控的一般情況陽(yáng)性質(zhì)控或者樣本沒有典型的擴(kuò)增；陽(yáng)性質(zhì)控Ct值或者定值偏差在2SD之外陽(yáng)性質(zhì)控或者樣本擴(kuò)增曲線異常，不呈典型的“S”型，如直線傾斜擴(kuò)增或者折線型；陽(yáng)性質(zhì)控或樣本失控的一般表現(xiàn)失控的一般情況核酸提取中的隨機(jī)誤差：如核酸提取過程中的

14、丟失、有機(jī)溶劑的去除不徹底、標(biāo)本中產(chǎn)生擴(kuò)增抑制物的殘留、所用耗材存在PCR抑制物等；儀器問題：如擴(kuò)增儀孔間溫度的不均一性、孔內(nèi)溫度與所示溫度的不一致性等；試劑問題：如Taq酶和（或）反轉(zhuǎn)錄酶的失活、探針的純度及標(biāo)記效率和核酸提取試劑的效率等；陽(yáng)性質(zhì)控或樣本失控的一般原因失控的一般情況純化核酸：但不能完全避免來(lái)自標(biāo)本核酸提取過程中所混入的去垢劑、有機(jī)溶劑的抑制作用；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：對(duì)臨床樣本進(jìn)行重復(fù)雙份測(cè)定，避免由于操作的隨機(jī)性導(dǎo)致結(jié)果的誤差，同時(shí)也可以監(jiān)測(cè)試劑的穩(wěn)定性；稀釋標(biāo)本：對(duì)于含有已知抑制物的標(biāo)本如強(qiáng)溶血，則可對(duì)標(biāo)本在擴(kuò)增前進(jìn)行稀釋，再來(lái)測(cè)定；使用“內(nèi)質(zhì)控”：即內(nèi)標(biāo)，可以避免由于試劑、擴(kuò)增儀

15、或標(biāo)本處理不當(dāng)所致的假陰性，因此衛(wèi)生部建議使用帶有“內(nèi)標(biāo)”的檢測(cè)試劑；陽(yáng)性質(zhì)控或樣本失控的預(yù)防措施失控的一般情況標(biāo)本間的交叉污染：如在實(shí)驗(yàn)過程中，由于操作不當(dāng)，或者樣本采集不當(dāng)造成的交叉污染；產(chǎn)物污染：通常指擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏導(dǎo)致的氣溶膠污染；試劑污染：如在提取過程中或配制反應(yīng)液時(shí)造成了試劑污染，從而使得檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)污染；陰性質(zhì)控或樣本失控的一般原因失控的一般情況對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)使用帶“濾芯”的吸頭設(shè)立“陰性”質(zhì)控（與標(biāo)本同時(shí)處理）使用防“污染”（含UNG）的PCR試劑陰性質(zhì)控或樣本失控的預(yù)防措施假陽(yáng)性的控制UNG酶+dUTP防污染體系UNG酶的作用原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU代替dT。d

16、U化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴(kuò)增的能力，其對(duì)不含dU的模板無(wú)任何影響。假陰性的控制內(nèi)標(biāo)FAM:525nmHEX:555nm目的基因內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線圖內(nèi)標(biāo)：已知低含量的與模板擴(kuò)增效率相似的一段DNA片段，將它加入PCR反應(yīng)液中，與模板共同擴(kuò)增，以反應(yīng)每管真實(shí)得擴(kuò)增情況如果內(nèi)標(biāo)和樣品都未擴(kuò)增出結(jié)果，則表示該管擴(kuò)增無(wú)效，應(yīng)重新做。此外，在圣湘磁珠法中，內(nèi)標(biāo)加到提取溶液中，不僅可以監(jiān)控反應(yīng)體系是否有效；也可以監(jiān)控整個(gè)提取過程的有效性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)核酸提取過程和擴(kuò)增過程的監(jiān)控。真陰性？！四、結(jié)果報(bào)告的要點(diǎn)分析報(bào)告的基本要求目前報(bào)告存在的一般性問題報(bào)告結(jié)果：IU與拷貝的含義報(bào)告的基本要求檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告應(yīng)準(zhǔn)確、清晰和客觀；定性測(cè)定報(bào)告“陰性”或“陽(yáng)性”，定量測(cè)定則以“拷貝數(shù)/ml”或“IU/ml”報(bào)告，避免二者之間的混淆；每份報(bào)告應(yīng)包括以下信息：標(biāo)題、唯一標(biāo)識(shí)、檢測(cè)標(biāo)本說(shuō)明、標(biāo)本特性和狀態(tài)、標(biāo)本接收日期和檢測(cè)日期、檢測(cè)方法、檢測(cè)和審核人員簽字及發(fā)出日期、參考結(jié)果或范圍；如對(duì)報(bào)告有效性有疑問，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)立即通知臨床相關(guān)科室予以糾正；病人要求用電話、傳真或郵件報(bào)告結(jié)果時(shí)，注意保密性原則；報(bào)告存在的一般性問題通常報(bào)告存在以下問題： 唯一標(biāo)識(shí)不清楚、標(biāo)本特性和狀態(tài)缺失、標(biāo)本