復(fù)爾康注射液對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

1、復(fù)爾康注射液對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響【摘要】目的研究復(fù)爾康注射液對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vasularendthelialgrthfatr,VEGF)表達(dá)的影響。方法HepG2細(xì)胞增殖采用K8試劑盒(elluntingkit-8)進(jìn)展檢測(cè)，VEGF的表達(dá)采用免疫組化SAB法進(jìn)展染色分析。結(jié)果復(fù)爾康注射液可抑制HepG2細(xì)胞的增殖，I50值為(29.631.22)gL-1;經(jīng)5，10gL-1的復(fù)爾康注射液作用48h后，HepG2細(xì)胞VEGF的表達(dá)明顯減弱，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)論復(fù)爾康注射液可抑制HepG2細(xì)胞的增殖和VEGF的表達(dá)，抗血管生

2、成可能是復(fù)爾康注射液抗腫瘤的作用機(jī)制之一。【關(guān)鍵詞】復(fù)爾康注射液;腫瘤;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;血管生成Abstrat：bjetiveTstudytheeffetfFuerkanginjetinntheexpressinfvasularendthelialgrthfatr(VEGF)inhepatblastaG2(HepG2)ells.ethdsTheprliferatinfHepG2asdeterinedbyK8(elluntingkit-8)assay.TheexpressinfVEGFastestedbySABiunhistheialethd.ResultsFuerkanginjetinuld

3、inhibitedtheprliferatinfHepG2ells,andtheI50valueas(29.631.22)gL-1.AftertreatentfFuerkanginjetinatnentratinf5，10gL-1fr48h,FuerkanginjetinstrnglyinhibitedtheexpressinfVEGFinHepG2ellsinadse-dependentanner.nlusinFuerkanginjetinaninhibittheprliferatinfHepG2ellsandexpressinfVEGF,andantiangigenesisaybeneft

4、heehanissfitsantituratin.Keyrds：Fuerkanginjetin;Tur;VEGF;Angigenesis血管生成(angigenesis)是指已存的血管(毛細(xì)血管和小靜脈)通過(guò)出芽或分裂的方式產(chǎn)生新的血管1。目前抑制腫瘤血管生成已成為抗腫瘤治療的一個(gè)重要方向與研究熱點(diǎn)。復(fù)爾康注射液是從中藥青蒿中提取出有效成分青蒿油，研制成能供靜脈給藥的多相脂質(zhì)體注射液。前期的研究結(jié)果顯示，復(fù)爾康注射液能抑制荷H22實(shí)體瘤的生長(zhǎng)，對(duì)荷P388和H22腹水瘤小鼠有明顯生命延長(zhǎng)作用，對(duì)A549和E-7細(xì)胞株的生長(zhǎng)有抑制作用。為深化討論復(fù)爾康注射液抗腫瘤的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了復(fù)爾康注

5、射液對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響。1材料1.1藥品和試劑復(fù)爾康注射液由瀘州醫(yī)學(xué)院藥物研究所提供，批號(hào)：061017;RPI1640培養(yǎng)基，GIB公司產(chǎn)品;K8(elluntingkit-8)，碧云天生物技術(shù)研究所提供;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，天津?yàn)笊镏破房萍钾?zé)任產(chǎn)品，批號(hào)：20220112;SAB試劑盒和DAB顯色劑由武漢博士德生物工程提供，批號(hào)：070119。1.2細(xì)胞株人肝癌HepG2細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPI1640培養(yǎng)基，37、5%2條件下常規(guī)培養(yǎng)。2方法2.1K8檢測(cè)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，0.25%胰酶制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為1108L-

6、1，接種于96孔板，每孔90l，空白孔加90lRPI1640，37，5%2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后每孔加藥10l，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，復(fù)爾康終濃度分別為2.5，5，10，20，40，80gL-1，陰性對(duì)照組加等體積無(wú)血清RPI1640，繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔參加K810l繼續(xù)培養(yǎng)1h，酶標(biāo)儀450n波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度A值，按以下公式計(jì)算抑制率，細(xì)胞增殖抑制率(%)=1-(A給藥組-A空白孔)/(A陰性對(duì)照組-A空白孔)100，LGIT法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(I50)。2.2免疫組化SAB法檢測(cè)VEGF的表達(dá)調(diào)整HepG2細(xì)胞懸液密度為5107L-1。接種于預(yù)先鋪好蓋玻片的24孔板，每孔450l，37，5%

7、2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。每孔加藥50l，使其終濃度分別為5，10gL-1(分別設(shè)為復(fù)爾康注射液低、高劑量組)，同時(shí)設(shè)復(fù)爾康注射液終濃度為10gL-1時(shí)相應(yīng)的溶劑為溶媒對(duì)照，陰性對(duì)照組加等體積無(wú)血清RPI1640，37，5%2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。吸凈培養(yǎng)液，PBS液洗2次，勿使細(xì)胞脫落。按免疫組化SAB染色試劑盒說(shuō)明書步驟染色、封片、顯微鏡觀察。胞漿和胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為VEGF陽(yáng)性染色，每組隨機(jī)采取8個(gè)視野拍照，結(jié)果用Iage-Prplus6.0圖像分析軟件進(jìn)展分析，檢測(cè)其陽(yáng)性物質(zhì)的積分光密度平均值(IDean)。結(jié)果用s表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析(組間比擬用SNK法)。3

8、結(jié)果3.1K8檢測(cè)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響當(dāng)復(fù)爾康注射液終濃度大于5gL-1時(shí)，HepG2細(xì)胞的增殖即受到抑制，且呈明顯的劑量依賴性，其I50值為(29.631.22)gL-1。見(jiàn)圖1。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.圖1復(fù)爾康注射液對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的濃度抑制率曲線(n=3)3.2免疫組化SAB法檢測(cè)VEGF的表達(dá)陰性對(duì)照組與溶媒對(duì)照組HepG2細(xì)胞均明顯表達(dá)VEGF，VEGF分布于胞質(zhì)及胞膜，呈棕黃色顆粒狀，細(xì)胞陽(yáng)性率為99%，復(fù)爾康注射液作用48h后HepG2細(xì)胞VEGF的表達(dá)不同程度減弱，見(jiàn)圖2。采用Iage-Prplus6.0圖像分析軟件進(jìn)展分析，復(fù)爾康注射液組的陽(yáng)性物質(zhì)積分光密度平均值明

9、顯降低，與陰性對(duì)照組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。表1HepG2細(xì)胞VEGF表達(dá)免疫組化染色積分光密度平均值4討論腫瘤發(fā)生、開(kāi)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的各個(gè)階段，均有賴于腫瘤的血管生成，新生血管提供腫瘤生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)，排除代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是癌細(xì)胞播散的途徑，又能促進(jìn)血管滲漏。血管生成構(gòu)成了腫瘤進(jìn)程中的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)2。腫瘤細(xì)胞(含間質(zhì)細(xì)胞)分泌多種血管生成因子參與調(diào)節(jié)血管生成，其中以VEGF的作用最為突出3。VEGF與其受體結(jié)合后，可釋放各種生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子，并以多種方式促進(jìn)腫瘤血管生成，從而為腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件4。Yaaguhi等5認(rèn)為在肝細(xì)胞癌的開(kāi)展過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為

10、一種特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能蛋白，可誘導(dǎo)微血管形成，增加血管通透性，促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，認(rèn)為VEGF的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)及預(yù)后親密相關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)依賴于脈管系統(tǒng)的新生，限制血管新生能控制腫瘤生長(zhǎng)，最有效的途徑包括阻斷VEGF信號(hào)通路，阻斷VEGF通路從而抑制腫瘤生長(zhǎng)已在臨床前模型上得到證實(shí)6。VEGF為促進(jìn)腫瘤新生血管形成及轉(zhuǎn)移的主要因子之一7，與腫瘤的發(fā)生、開(kāi)展息息相關(guān)。因此，可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的分泌來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移是治療腫瘤的一條新途徑。青蒿是藥源廣泛、價(jià)廉易得的中藥，近年來(lái)研究說(shuō)明，青蒿素及其衍生物具有明顯的抗腫瘤作用，作用機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生及氧

11、化應(yīng)激、延遲細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗血管生成等有關(guān)8。復(fù)爾康注射液是從中藥青蒿中提取出有效成分青蒿油，研制成能供靜脈給藥的多相脂質(zhì)體注射液。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)爾康注射液對(duì)體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，其I50值為(29.631.22)gL-1。經(jīng)不同濃度的復(fù)爾康注射液作用48h后，HepG2細(xì)胞VEGF的分泌表達(dá)不同程度減弱，與陰性對(duì)照組比擬差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)，具有一定的抗血管生成作用。結(jié)合我們前期對(duì)復(fù)爾康注射液抗腫瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究，提醒抗血管生成為其抗腫瘤的作用機(jī)制之一。【參考文獻(xiàn)】1Risau.ehanissfangigenesisJ.Na

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