免疫實(shí)驗(yàn)課安排培訓(xùn)課件

1、免疫實(shí)驗(yàn)課安排免疫實(shí)驗(yàn)課安排 實(shí)驗(yàn)報(bào)告書(shū)寫(xiě)的原則實(shí)驗(yàn)題目：?jiǎn)魏思?xì)胞分離 實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2012.3.28實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍蛛x人類(lèi)外周血單核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原理：由于不同細(xì)胞的密度不同，因此可利用密度梯度 離心法將不同比重的細(xì)胞分開(kāi)。實(shí)驗(yàn)材料：試管、抗凝血實(shí)驗(yàn)步驟與結(jié)果：肉眼可見(jiàn)灰白層，1ml血收獲xx細(xì)胞。結(jié)果分析：本次分離細(xì)胞較正常人單個(gè)核細(xì)胞數(shù)少，可能原 因一是實(shí)驗(yàn)誤差所致，二是該患者為白細(xì)胞減少 癥。2免疫實(shí)驗(yàn)課安排 實(shí)驗(yàn)報(bào)告書(shū)寫(xiě)的原則實(shí)驗(yàn)題目：?jiǎn)魏思?xì)胞分離 2免疫實(shí)驗(yàn)課實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則研究的題目：確定研究題目是開(kāi)展研究工作的首要任務(wù)。研究摘要：研究背景，要開(kāi)展的主要研究（可以敘述利用什么樣的方法開(kāi)展研究）

2、，研究意義（本次研究的預(yù)期成果及其推動(dòng)科學(xué)進(jìn)步的作用）。研究?jī)?nèi)容：敘述主要開(kāi)展的工作。研究方案：利用什么樣的手段去解決研究?jī)?nèi)容提到的相關(guān)工作。研究的特色與創(chuàng)新之處：主要科學(xué)貢獻(xiàn)。3免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則研究的題目：確定研究題目是開(kāi)展研究工作的首要任題目：XX細(xì)胞因子誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究摘要：肺癌是最常見(jiàn)的腫瘤之一。XX與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其在肺癌中的作用仍缺乏報(bào)道。本研究采用人肺癌細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)分析XX誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡作用，通過(guò)分析Caspase3,8,12等確定XX誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制。本研究不僅可以進(jìn)一步揭示XX抗腫瘤作用機(jī)制，也為尋找新的肺癌治療方法提

3、供研究基礎(chǔ)。研究?jī)?nèi)容：1）XX在人肺癌腫瘤細(xì)胞的表達(dá)分析，確定XX表達(dá)與肺腫瘤的關(guān)系。2）檢測(cè)患者血清X(qián)X水平，確定其輔助診斷肺癌的價(jià)值 研究方案：1）采用腫瘤組織切片，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察XX在人肺癌組織中的表達(dá)情況。2）采用ELISA法檢測(cè)血清X(qián)X水平。研究的特色與創(chuàng)新之處：本研究闡述了XX與肺癌的關(guān)系，并提出XX可作為肺癌的血清學(xué)診斷標(biāo)志物，研究發(fā)現(xiàn)XX可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并闡述了其作用機(jī)制。4免疫實(shí)驗(yàn)課安排題目：XX細(xì)胞因子誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究4免疫實(shí)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考試腫瘤患者存在多種免疫異常，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)分析腫瘤患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞功能。主要包括 1）題目 2）研究?jī)?nèi)容

4、3）研究方案 4）預(yù)期結(jié)果5免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考試腫瘤患者存在多種免疫異常，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)分析腫瘤2010級(jí)五年制本科生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課主講：倪維華Email:6免疫實(shí)驗(yàn)課安排2010級(jí)五年制本科生免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課主講：倪維華6免疫實(shí)驗(yàn)課試管凝集測(cè)定血型抗體效價(jià)雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)內(nèi)容7免疫實(shí)驗(yàn)課安排試管凝集測(cè)定血型抗體效價(jià)雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)內(nèi)容7免疫實(shí)抗原抗體反應(yīng)分類(lèi)凝集反應(yīng)瓊脂沉淀反應(yīng)中和反應(yīng)補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)環(huán)狀法絮狀法沉淀反應(yīng)單向免疫擴(kuò)散、雙向免疫擴(kuò)散對(duì)流免疫電泳、火箭電泳免疫電泳反應(yīng)分類(lèi)8免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原抗體反應(yīng)分類(lèi)凝集反應(yīng)瓊脂沉淀反應(yīng)中和反應(yīng)環(huán)狀法絮狀法沉淀實(shí)驗(yàn)原理:在試管中，顆粒性抗原與相應(yīng)抗

5、體在有適量電解質(zhì)存在時(shí)，直接結(jié)合可形成肉眼可見(jiàn)的凝集塊。試管凝集測(cè)定血型抗體效價(jià)9免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)原理:試管凝集測(cè)定血型抗體效價(jià)9免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦媚囼?yàn)判斷抗體的效價(jià)效價(jià)：也稱(chēng)滴度，它的表示法與抗體的稀釋倍數(shù)有關(guān)，一般以該抗體能與其對(duì)應(yīng)的抗原發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)的最高稀釋度來(lái)表示。10免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)?zāi)康睦媚囼?yàn)判斷抗體的效價(jià)10免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)材料名稱(chēng)量/組生理鹽水20ml0.5%壓積血（RBC）8ml抗體1ml1ml刻度吸管2支1ml 加樣器1支1ml 加樣器頭若干小試管28支 (7支/人)試管架1個(gè)37孵箱1個(gè)/室記號(hào)筆1只實(shí)驗(yàn)以個(gè)人為單位，物品四個(gè)人一組11免疫實(shí)驗(yàn)課安排

6、實(shí)驗(yàn)材料名稱(chēng)量/組生理鹽水20ml0.5%壓積血（RBC）8實(shí)驗(yàn)步驟抗體倍比稀釋。稀釋好的試管中各加入紅細(xì)胞0.5ml。加樣后搖動(dòng)試管，使紅細(xì)胞與血清充分混合。37 孵育90mins后進(jìn)行結(jié)果觀察。試管號(hào)1234567抗體(血清)0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml-抗原(紅細(xì)胞)0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml血清稀釋度1/1201/2401/4801/9601/19201/3840-12免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)步驟試管號(hào)1234567抗體(血清)0.5ml0.5ml抗體(血清)倍比稀釋方法取七只抗體稀釋管，編號(hào)。每只管中先加入生理鹽水

7、0.5ml。取0.5ml血清加入第一管中，混勻后取出0.5ml加入第二管，依此類(lèi)推。第7管為陰性對(duì)照，不加抗體（血清）。0.5ml 生理鹽水1/60 1/120 1/240 1/480 1/960 1/1920 -1/30血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.51 2 3 4 5 6 7 13免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗體(血清)倍比稀釋方法取七只抗體稀釋管，編號(hào)。0.5ml 操作前清點(diǎn)好實(shí)驗(yàn)物品、器材。吸抗體與紅細(xì)胞的加樣器頭不能混用。觀察結(jié)果時(shí)不要搖動(dòng)試管。注 意 事 項(xiàng)14免疫實(shí)驗(yàn)課安排操作前清點(diǎn)好實(shí)驗(yàn)物品、器材。注 意 事 項(xiàng)14免疫實(shí)驗(yàn)課安排凝集程度判定：4：紅細(xì)胞全部凝集，上清澄清

8、，晃動(dòng)時(shí)凝集物成片狀分散3：紅細(xì)胞絕大部分凝集，上清較澄清2，紅細(xì)胞半數(shù)凝集，上清略澄清，紅細(xì)胞少數(shù)凝集，肉眼可見(jiàn)小凝塊，紅細(xì)胞極少數(shù)凝集，顯微鏡下可見(jiàn)凝集：無(wú)凝集，紅細(xì)胞在管底成界限清楚的小圓點(diǎn)陰性對(duì)照：第7管（無(wú)抗體）為陰性對(duì)照血型抗體效價(jià)的判定：肉眼可見(jiàn)凝集（）時(shí)血清的最高稀釋度為血型抗體的效價(jià)結(jié)果判定方法15免疫實(shí)驗(yàn)課安排結(jié)果判定方法15免疫實(shí)驗(yàn)課安排預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果16免疫實(shí)驗(yàn)課安排預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果16免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)17免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)17免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散18免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散18免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散的應(yīng)用 抗體效價(jià)的判定 檢測(cè)體液中各種

9、蛋白成分19免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散的應(yīng)用 抗體效價(jià)的判定19免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí) 驗(yàn) 材 料試劑：1.5%瓊脂 300ml/room抗OVA抗體 1份/組BSA 1份/組抗原(0.1mg/ml OVA) 1份/組器材：5ml刻度吸管1支/組20l pipette 1把Tip (小)若干1.5ml EP管10個(gè)培養(yǎng)箱371個(gè)/室濕盒1個(gè)/室打孔器1個(gè)打孔紙樣 1個(gè)20免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí) 驗(yàn) 材 料試劑：器材：20免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)步驟玻片正面標(biāo)記組別用5ml吸管吸取預(yù)熱的1.5%瓊脂4ml冷卻后按紙樣打孔，每塊載玻片打兩組孔，加樣濕盒中反應(yīng)（ over night)37NOTE:加樣時(shí)應(yīng)將加樣器頭

10、插入孔底，緩慢加入液體，直到孔滿（約8-10ul）1抗OVA抗體OVABSABSAOVA抗OVA抗體21免疫實(shí)驗(yàn)課安排實(shí)驗(yàn)步驟玻片正面標(biāo)記組別用5ml吸管吸取預(yù)熱的1.5%瓊脂4注 意 事 項(xiàng)在玻片正面做好標(biāo)記，玻片應(yīng)水平放置。瓊脂一定加熱均勻后再進(jìn)行鋪膠。鋪膠動(dòng)作要快，均勻、厚薄一致。加樣時(shí)樣品量要適當(dāng)，注意不要使樣品溢出。吸抗體和抗原的槍頭不能混用。22免疫實(shí)驗(yàn)課安排注 意 事 項(xiàng)在玻片正面做好標(biāo)記，玻片應(yīng)水平放置。22免疫實(shí) 抗原抗體反應(yīng) 淋巴細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù) 細(xì)胞因子的檢測(cè)技術(shù) 免疫學(xué)常用的分子生物學(xué)技術(shù)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)23免疫實(shí)驗(yàn)課安排 抗原抗體反應(yīng)免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)23免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原抗

11、體反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標(biāo)記技術(shù)24免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原抗體反應(yīng)凝集反應(yīng)24免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1. 抗原與抗體的結(jié)合是特異性的 交叉反應(yīng)2. 抗原抗體結(jié)合是可逆的 引力：氫鍵、疏水鍵、靜電引力、范德華力 斥力：電子云產(chǎn)生的排斥力3. 抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段 抗原抗體特異性結(jié)合階段 可見(jiàn)反應(yīng)階段4. 抗原抗體的分子比例與抗原抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象密切相關(guān) 1. 抗原與抗體的結(jié)合是特異性的 交叉反應(yīng)2. 抗原抗體結(jié)合是可逆的 引力：氫鍵、疏水鍵、靜電引力、范德華力 斥力：電子云產(chǎn)生的排斥力3. 抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段 抗原抗體特異性結(jié)合階段 可見(jiàn)反應(yīng)階段4. 抗原抗體

12、的分子比例與抗原抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象密切相關(guān) 1. 抗原與抗體的結(jié)合是特異性的 交叉反應(yīng)2. 抗原抗體結(jié)合是可逆的 引力：氫鍵、疏水鍵、靜電引力、范德華力 斥力：電子云產(chǎn)生的排斥力3. 抗原抗體反應(yīng)可分為兩個(gè)階段 抗原抗體特異性結(jié)合階段 可見(jiàn)反應(yīng)階段4. 抗原抗體的分子比例與抗原抗體結(jié)合是否呈現(xiàn)可見(jiàn)的反應(yīng)現(xiàn)象密切相關(guān) 25免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1. 抗原與抗體的結(jié)合是特異性的1. 抗原抗體過(guò)剩區(qū)抗原過(guò)剩區(qū)等價(jià)區(qū)26免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗體過(guò)剩區(qū)抗原過(guò)剩區(qū)等價(jià)區(qū)26免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0.85%的氯化鈉作為稀釋液 ，以供給適應(yīng)濃度

13、的電解質(zhì)。溫度：一般常使反應(yīng)在37度水浴或孵育箱中進(jìn)行。酸堿度：抗原-抗體反應(yīng)適應(yīng)的酸堿度為PH68。27免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗原-抗體反應(yīng)受多種因素影響電解質(zhì)：抗原-抗體反應(yīng)通常應(yīng)用0凝集反應(yīng)(Agglutination) 細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原或吸附于顆粒上的可溶性抗原（或抗體）中加入相應(yīng)抗體（或抗原），在電解質(zhì)存在的條件下形成凝集物的現(xiàn)象，稱(chēng)為凝集反應(yīng)。 28免疫實(shí)驗(yàn)課安排凝集反應(yīng)(Agglutination) 凝集反應(yīng)的分類(lèi)直接凝集反應(yīng) 間接凝集反應(yīng)間接凝集抑制試驗(yàn)協(xié)同凝集試驗(yàn)抗球蛋白試驗(yàn)29免疫實(shí)驗(yàn)課安排凝集反應(yīng)的分類(lèi)直接凝集反應(yīng) 29免疫直接凝集試驗(yàn)（Direct Agglutinat

14、ion） 細(xì)菌或紅細(xì)胞等顆粒性抗原與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。 1. 玻片法：定性試驗(yàn) 菌種鑒定及血型鑒定 2. 試管法：半定量試驗(yàn) 抗體效價(jià)滴定30免疫實(shí)驗(yàn)課安排直接凝集試驗(yàn)（Direct Agglutination） 間接（被動(dòng)）凝集反應(yīng)（Indirect/Passive Agglutination） 將可溶性抗原（或抗體）吸附于一種與免疫無(wú)關(guān)的、一定大小的載體表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在電解質(zhì)存在的條件下出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。31免疫實(shí)驗(yàn)課安排間接（被動(dòng)）凝集反應(yīng)（Indirect/Passive A間接凝集抑制試驗(yàn)（Indirect Agglutination

15、 Inhibition） 可溶性抗原與相應(yīng)抗體充分作用后，再加入抗原致敏的載體顆粒，此時(shí)因抗體已被可溶性抗原結(jié)合，不會(huì)再出現(xiàn)載體凝集現(xiàn)象。32免疫實(shí)驗(yàn)課安排間接凝集抑制試驗(yàn)（Indirect Agglutinati協(xié)同凝集試驗(yàn)（Coagglutination） 金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁中的A蛋白（SPA）能與人及哺乳動(dòng)物血清中IgG類(lèi)抗體的Fc段結(jié)合。IgG的Fc段與SPA結(jié)合后，其Fab段與特異性抗原結(jié)合出現(xiàn)特異的凝集現(xiàn)象。 檢測(cè)血液、腦脊液及其他分泌液中的微量抗原。 33免疫實(shí)驗(yàn)課安排協(xié)同凝集試驗(yàn)（Coagglutination） 免疫實(shí)驗(yàn)課安排培訓(xùn)課件抗球蛋白試驗(yàn)（Antiglobulin

16、Test，Coombs Test） 某些血球凝集反應(yīng)，如Rh紅細(xì)胞與抗Rh抗體的反應(yīng)，因抗體為IgG，結(jié)合價(jià)為兩價(jià)，與IgM相比，分子較小，抗體與紅細(xì)胞間的結(jié)合力不能克服細(xì)胞間的排斥力，不出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。若加入抗IgG的抗體，則可以在包被了Rh抗體的紅細(xì)胞之間建立數(shù)量較多、距離較遠(yuǎn)、因而排斥力較小的聯(lián)接，引起凝集現(xiàn)象。35免疫實(shí)驗(yàn)課安排抗球蛋白試驗(yàn)（Antiglobulin Test，Coom36免疫實(shí)驗(yàn)課安排36免疫實(shí)驗(yàn)課安排沉淀反應(yīng)（Precipitation) 血清、蛋白質(zhì)、細(xì)胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合出現(xiàn)沉淀物，這一類(lèi)反應(yīng)稱(chēng)為沉淀反應(yīng)。大多沉淀

17、反應(yīng)是用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)，進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散故也稱(chēng)免疫擴(kuò)散。 37免疫實(shí)驗(yàn)課安排沉淀反應(yīng)（Precipitation) 沉淀反應(yīng)的分類(lèi)雙向免疫擴(kuò)散單向免疫擴(kuò)散 對(duì)流免疫電泳 火箭電泳免疫電泳38免疫實(shí)驗(yàn)課安排沉淀反應(yīng)的分類(lèi)雙向免疫擴(kuò)散38免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散 （Double Immunodiffusion) 在瓊脂板上按一定距離打兩個(gè)小孔，將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周?chē)鷶U(kuò)散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。 本法常用于抗原或抗體的定性 、組成的檢測(cè)。39免疫實(shí)驗(yàn)課安排雙向免疫擴(kuò)散 （Double I

18、mmunodiffusio 在中間孔加入定量的抗體，按一定距離在四周打數(shù)個(gè)小孔，分別加入不同稀釋度的抗原，可形成粗細(xì)不等的沉淀線，從而可判定抗體的效價(jià)。雙向免疫擴(kuò)散(Double Immunodiffusion)40免疫實(shí)驗(yàn)課安排 在中間孔加入定量的抗體，按一定距離在四周打數(shù)定性實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)兩種抗原的相關(guān)性雙向免疫擴(kuò)散(Double Immunodiffusion)41免疫實(shí)驗(yàn)課安排定性實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)兩種抗原的相關(guān)性雙向免疫擴(kuò)散41免疫實(shí)單向免疫擴(kuò)散(Single Immunodiffusion) 將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔后將抗原加入孔中擴(kuò)散?？乖跀U(kuò)散過(guò)程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比。 本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)42免疫實(shí)驗(yàn)課安排單向免疫擴(kuò)散(Single Immunodiffusion43免疫實(shí)驗(yàn)課安排43免疫實(shí)驗(yàn)課安排對(duì)流免疫電泳(Counter Immunoelectrophoresis) 在電場(chǎng)中進(jìn)行的雙向免疫擴(kuò)散。AgAb電泳電滲44免疫實(shí)驗(yàn)課安排對(duì)流免疫電泳(Counter Immunoelectrop45免疫實(shí)驗(yàn)課安排45免疫實(shí)驗(yàn)課安排電滲：電場(chǎng)中溶液相對(duì)于固體的移動(dòng)。瓊脂是酸性物質(zhì)，在堿性溶液中帶負(fù)電，而與它接觸的溶液帶正電，因此液體向陰極