微生物學(xué)-09b微生物與基因工程課件

1、9.1 基因工程概述9.2 微生物與克隆載體9.3 微生物與基因工程工具酶9.4 微生物作克隆載體的宿主第九章 微生物與基因工程9.5 表達(dá)載體的構(gòu)建9.6 DNA的合成、體外擴(kuò)增9.7 基因工程的應(yīng)用基因工程技術(shù)基因工程（genetic engineering)：把分離到的或合成的基因經(jīng)過(guò)改造，插入載體中，導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而得到大量基因產(chǎn)物，或令生物表現(xiàn)出新的形狀?；蚬こ檀笫掠?973 Cohen和Boyer第一次將重組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆;1978 Genentech公司-人胰島素-世界上第一種基因工程蛋白藥物 1982 第一個(gè)基因工程藥物-重組

2、人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用 1985 第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó) 轉(zhuǎn)基因魚 1993 基因工程西紅柿在美國(guó)上市1997 英國(guó)羅斯林研究所-克隆羊多莉1999.9 中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃, 負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%2000.6.26 科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11 公布人類基因組基本信息9.1 基因工程概述三項(xiàng)重要技術(shù)為基因工程奠定了基礎(chǔ):1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功；1973年Cohen和Boyer第一次將重

3、組體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了DNA的分子克隆; 1977年Boyer等首先將人工合成的生長(zhǎng)激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測(cè)定法；90年代全自動(dòng)核酸測(cè)序儀問(wèn)世；一切基因工程操作都離不開(kāi)微生物1、基因工程所用克隆載體主要是用病毒、噬菌體和質(zhì)粒改造而成的。2、基因工程所用千余種工具酶是從微生物中得到的。3、微生物細(xì)胞是基因克隆的宿主。4、大規(guī)模表達(dá)基因產(chǎn)物，構(gòu)建工程菌，利用工廠發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。5、提供基因資源（抗高溫、高鹽、高堿、低溫等特性）。6、模式生物提供基礎(chǔ)理論

4、。二、微生物與基因工程關(guān)系克隆載體應(yīng)具備的性質(zhì)1、可獨(dú)立自主復(fù)制，具備復(fù)制原點(diǎn)；2、具有若干限制酶單一切割位點(diǎn)，且位于載體復(fù)制的非必需區(qū)，以便插入外源基因后不影響復(fù)制。3、有可供選擇的遺傳標(biāo)記（抗性基因、顯色反應(yīng)），以便于對(duì)陽(yáng)性克隆的鑒別和篩選。目前克隆載體種類質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體M13噬菌體載體真核細(xì)胞的克隆載體人工染色體。一、質(zhì)粒載體1、特點(diǎn)：（1）具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)；（2）具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量。1200kb，外源DNA15kb；（3）具有較高拷貝數(shù)，多為松馳控制型。人為增加拷貝數(shù)可用終濃度1020g/ml，氯霉素停止細(xì)胞蛋白合成，宿主DNA合成終止，質(zhì)粒復(fù)制正常進(jìn)行，可達(dá)數(shù)千個(gè)

5、拷貝；（4）具有便于選擇的標(biāo)記；（5）易于導(dǎo)入細(xì)胞，質(zhì)粒可通過(guò)轉(zhuǎn)化和電穿孔等方法導(dǎo)入細(xì)胞；（6）具有安全性。插入失活篩選轉(zhuǎn)化子 插入失活：pBR322抗生素抗性基因內(nèi)有許多單一切點(diǎn)的限制性位點(diǎn)，可以用來(lái)切開(kāi)分子，插入新的DNA片段，新DNA片段的插入將導(dǎo)致相應(yīng)抗性基因的失活，這種現(xiàn)象稱如BamHI可以從四環(huán)素位點(diǎn)切開(kāi)，使該基因不能表達(dá)，對(duì)四環(huán)素是敏感的，但仍能表達(dá)氨芐抗性基因。篩選重組pBR322 按照以下方法進(jìn)行，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)于氨芐培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以生長(zhǎng)形成克隆，影印到四環(huán)素培養(yǎng)基上，不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落可能就是目的克隆。pUC質(zhì)粒載體一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)具有更小的分子量：2.8

6、kb更高的拷貝數(shù)，每個(gè)細(xì)胞大約500各拷貝具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段攜帶了氨卞青霉素抗性基因（ampR）多克隆位點(diǎn)區(qū)位于lacZ基因中，在此位點(diǎn)上插入外源基因會(huì)導(dǎo)致lacZ基因失活，可利用藍(lán)白斑篩選重組子 。質(zhì)粒的不足（1）外源DNA15kb。（2）轉(zhuǎn)化效率低，約0.1的轉(zhuǎn)化率。噬菌體克隆載體的構(gòu)建a、縮短長(zhǎng)度野生型DNA包裝的上限為50.5kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，插入片段至多為2.0kb，如果將其縮短便能夠提高裝載量。I 插入型載體經(jīng)改造后的長(zhǎng)度為37kb，為包裝的下限，插入片段最大為13.5kb（50.5-37kb）由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因

7、。b 刪除重復(fù)的酶切口插入型載體在插入位點(diǎn)有一酶切口，但這必須是唯一的；取代型載體在取代位點(diǎn)有兩個(gè)酶切口，多了也不行，而天然的DNA上有許多重復(fù)的酶切口，如：EcoRI 5個(gè)，HindIII 7個(gè)，這些多余的酶切口必須被刪除噬菌體載體的優(yōu)點(diǎn)可在體外包裝成噬菌體，高效感染大腸桿菌裝載外源DNA的量大（23kb）重組-DNA的篩選提取方便噬菌體載體常用于構(gòu)建基因文庫(kù)。柯斯質(zhì)粒載體（COS載體，粘粒載體）考斯質(zhì)粒是含有-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒考斯質(zhì)粒的構(gòu)建由于 -DNA包裝蛋白只識(shí)別粘性末端的一小段順序cos區(qū)。將這段DNA與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建的重組質(zhì) 粒，可裝載外源DNA（45.5kb)，它仍可

8、象-DNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進(jìn)入細(xì)胞后，要通過(guò)質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。考斯質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)能象-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞可以裝載更大的外源DNA片段，可裝載45.5kb。攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選有質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。M13噬菌體載體1、 M13 噬菌體基本特點(diǎn)：（1） M13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細(xì)胞，而是從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂；（2） M13 噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由 6407 的堿基組成 ；（3）在宿主細(xì)胞內(nèi)，感染性的單鏈?zhǔn)删w DNA （正鏈）在宿主酶的

9、作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復(fù)制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復(fù)制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA ；M13噬菌體的改造野生型M13不適于作為克隆載體，因此人們對(duì)野生型M13進(jìn)行了改造，構(gòu)建了一系列M13克隆載體。在M13基因組中，除基因間隔區(qū)（IG）外，其他均為復(fù)制和組裝所必需的基因。外源DNA插入IG區(qū)，可不影響M13活動(dòng)，因此對(duì)野生型M13的改造主要在IG區(qū)中進(jìn)行。 插入半乳糖苷酶選擇標(biāo)記在IG區(qū)中插入半乳糖苷酶N端一小段編碼序列及其調(diào)控序列，該序列編碼半乳糖苷酶的肽，肽可與大腸桿菌LacZ突變基因 M15進(jìn)行互補(bǔ)，產(chǎn)生具有活

10、性的半乳糖苷酶。若將M13和宿主細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物質(zhì)5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(Xgal)培養(yǎng)基的平板上時(shí)，可形成藍(lán)色噬菌斑。 插入一小段多克隆位點(diǎn)區(qū)在肽的編碼區(qū)內(nèi)插入一小段密集限制酶單一位點(diǎn)的DNA片段，當(dāng)外源DNA插入到這一區(qū)段，則會(huì)破壞互補(bǔ)作用。這時(shí)若將M13（含外源DNA）和宿主細(xì)胞涂布在含有IPTG和Xgal培養(yǎng)基的平板上，則形成無(wú)色噬菌斑。M13載體克隆外源DNA的能力較小，一般只適于克隆300400bp的外源DNA片段；它的突出優(yōu)點(diǎn)是，特別適合用于制備克隆基因的單鏈DNA。因此，它主要被用于制備測(cè)序用單鏈DNA模板、特異的單鏈D

11、NA探針，定位誘變等。表9-1 幾類大腸桿菌克隆載體比較載體類型 克隆外源DNA片段大小 主要用途 質(zhì)粒載體 15kb 克隆和表達(dá)外源基因；DNA測(cè)序 噬菌體載體 23kb 構(gòu)建基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù) 柯斯質(zhì)粒載體 45kb 構(gòu)建基因文庫(kù) M13載體 300400bp 制備單鏈DNA；定位誘變；噬菌體展示 三、真核生物的克隆載體1.酵母質(zhì)粒載體酵母質(zhì)粒載體都是利用其2m質(zhì)粒和其酵母染色體組分與細(xì)菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建而成的。可分別在細(xì)菌、酵母中復(fù)制，又稱穿梭質(zhì)粒。主要有三種：附加體質(zhì)粒、復(fù)制質(zhì)粒、整合質(zhì)粒（1）附加體質(zhì)粒（episomal plasmid） 結(jié)構(gòu)：pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、Amp

12、r（氨芐青霉素抗性基因）；2m的復(fù)制起點(diǎn)；酵母選擇標(biāo)記的URA3基因（尿嘧啶核苷酸合成酶基因3）。 細(xì)胞中拷貝數(shù)：酵母中高拷貝數(shù)。（2）復(fù)制質(zhì)粒含有：來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來(lái)自酵母染色體的自主復(fù)制序列（ARS）；作為酵母選擇標(biāo)記的URA3基因和TRP1基因（色氨酸合成酶基因1）。這種質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，能在大腸桿菌或酵母細(xì)胞中復(fù)制，重組質(zhì)粒導(dǎo)入酵母細(xì)胞中可獲得中等拷貝數(shù)的質(zhì)粒。（3）整合質(zhì)粒含有：來(lái)自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)；氨芐青霉素抗性基因（Ampr）、四環(huán)素抗性基因（Tetr）。來(lái)自酵母的URA3基因；它既可以作為酵母細(xì)

13、胞的選擇標(biāo)記，也可與酵母染色體DNA進(jìn)行同源重組。這種質(zhì)粒可在大腸桿菌中復(fù)制，但不能在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制。一旦導(dǎo)入酵母細(xì)胞，可整合到酵母染色體上，成為染色體DNA的一個(gè)片段。2.真核生物病毒載體（1）哺乳動(dòng)物病毒載體：目前利用許多哺乳動(dòng)物病毒如SV40，腺病毒、牛痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。（2）昆蟲(chóng)病毒載體：主要為高克隆容量（100kb）；其次具有高表達(dá)效率（25）；安全，僅感染無(wú)脊椎動(dòng)物；（3）植物病毒載體四、人工染色體酵母人工染色體（YAC）：能容納最大外源DNA片段。1、組成：著絲粒（centromere，CEN）、端粒（telomere， TEL）、酵母自主復(fù)

14、制序列（ARS）、選擇性標(biāo)記（如URA3）。2、功能：大片段克?。?00萬(wàn)bp），多用于真核生物基因庫(kù)的載體。3、相關(guān)：細(xì)菌人工染色體（BAC）。常用工具酶種類 內(nèi)切酶 把DNA長(zhǎng)鏈切割為短的片段 連接酶 將2段DNA片段拼接起來(lái) 聚合酶 催化合成形成核酸鏈 末端轉(zhuǎn)移酶 片段末端加接多聚核苷酸 核酸酶 水解酶，非專一性 反向轉(zhuǎn)錄酶 逆轉(zhuǎn)錄酶9.3 微生物與基因工程工具酶一、限制性內(nèi)切酶 1、限制性內(nèi)切酶的定義 是指已被證明是限制修飾系統(tǒng)中的一個(gè)組成部分，具有識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核酸序列并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶統(tǒng)稱為限制性內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) Luria和Human發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能

15、將外來(lái)的DNA片段在某些專一位點(diǎn)上切斷，從而保證其不被外來(lái)噬菌體所感染，而其自身的DNA由于被一種特殊的酶所修飾（甲基化）而得以保護(hù)，這種現(xiàn)象叫做限制修飾。Smith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離到一種酶，能夠特異性的切割DNA，這個(gè)酶被命名為Hind I,這是第一個(gè)分離到的限制性內(nèi)切核酸酶。3、限制性核酸內(nèi)切酶的命名 按酶來(lái)源菌的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的三個(gè)斜體字母作略語(yǔ)表示；如有株名，再加上一個(gè)字母，其后再按發(fā)現(xiàn)的先后寫上羅馬數(shù)字。例如：從流感嗜血桿菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分離到3種限制酶，則分別命名為Hind、H

16、ind和Hind。4、限制性內(nèi)切酶的類型 限制性內(nèi)切酶可分為三大類型：類型I和類型III ：由于識(shí)別位點(diǎn)并非嚴(yán)格專一，很少被應(yīng)用。類型II的特點(diǎn): 識(shí)別位點(diǎn)嚴(yán)格專一；識(shí)別序列的堿基數(shù)一般為4、6、8個(gè)bp；識(shí)別位點(diǎn)經(jīng)常是一種回文序列的DNA；是DNA重組技術(shù)最為常用的工具酶。寡核苷酸順序具有二沖旋轉(zhuǎn)對(duì)稱軸，又稱為回文順序（palindromic sequence） GAA TTC CTT AAG也有一些對(duì)稱順序被一個(gè)或幾個(gè)非特定的核苷酸間隔開(kāi)。N-四種均可 Py-嘧啶 Pu-嘌呤如GTPyPuAC Hind I6、限制性內(nèi)切酶的切割方式就切割位點(diǎn)相對(duì)于對(duì)稱軸的位置而言,切割方式有三種:在對(duì)稱軸

17、5 側(cè)切割產(chǎn)生5 粘端在對(duì)稱軸3 側(cè)切割產(chǎn)生3 粘端在對(duì)稱軸處切割產(chǎn)生平二、DNA連接酶配對(duì)的堿基產(chǎn)生的氫鍵還不足以把兩個(gè)DNA分子拴在一起，還需要通過(guò)DNA連接酶在3羥基和5磷酸基團(tuán)之間形成新的磷酸二酯鍵。大多數(shù)DNA連接酶都是從T4噬菌體中分離出來(lái)的，它可以催化在兩條DNA鏈的末端形成磷酸二酯鍵，包括粘性末端堿基配對(duì)的兩條DNA鏈和末端都是平末端的兩條DNA鏈其它常用工具酶3. Tag DNA聚合酶：是一種耐熱的依賴于DNA的DNA聚合酶，具有5 3聚合酶活性，該酶最適反應(yīng)溫度為7580 ，主要用途是進(jìn)行PCR反應(yīng)。4. 逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴于RNA的DNA聚合酶）主要作用是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成c

18、DNA（二）堿性磷酸酶其作用是去除DNA、RNA的5磷酸根（ 5-P），以防自身環(huán)化；另外在用32P標(biāo)記5末端前，可先用其去除DNA或RNA上的5- P（三）核酸酶S1核酸酶：主要用于去除DNA片段粘末端而產(chǎn)生平端；打開(kāi)cDNA中發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使其成平端。核糖核酸酶（RNaseA)：在質(zhì)粒提取時(shí)降解RNA；從DNA-RNA雜交體中去除未雜交的RNA區(qū)。9.4 微生物作為克隆載體的宿主一、宿主的基本要求與性質(zhì)1、能夠高效吸收外源DNA；2、具有使外源DNA進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)；3、不具有限制修飾系統(tǒng)，故不會(huì)使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源DNA發(fā)生降解；4、一般為重組缺陷型（RecA-）菌株，使克隆載

19、體DNA與宿主染色體DNA之間不發(fā)生同源重組；5、便于進(jìn)行基因操作和篩選；6、具有安全性。二、原核生物宿主1、首先應(yīng)根據(jù)克隆載體性質(zhì)以及它們導(dǎo)入細(xì)胞的方式選擇相應(yīng)的宿主細(xì)胞：噬菌體載體E.coli k12菌株、M13含有F因子的雄性大腸桿菌。2、其次為了便于陽(yáng)性克隆的篩選，作為克隆宿主的基因型應(yīng)與載體基因相對(duì)應(yīng)。3. 最后為了安全目的，需嚴(yán)格限制載體的宿主范圍，以達(dá)到盡量避免重組體從實(shí)驗(yàn)室逃逸出去。三、真核生物宿主（釀酒酵母）利用真核生物作為克隆載體宿主具有兩個(gè)重要意義。第一，它促進(jìn)了對(duì)真核生物復(fù)雜基因組及其基因調(diào)控的研究；第二，它有利于真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工。釀酒酵母是一種理想的真核生物克

20、隆載體宿主。四、外源基因?qū)胨拗?、外源DNA導(dǎo)入導(dǎo)入原核細(xì)胞（1）轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染：外源DNA以重組質(zhì)粒載體形式存在，則可通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入原核細(xì)胞；外源 DNA構(gòu)建成重組噬菌體DNA或重組噬菌質(zhì)粒，則可通過(guò)轉(zhuǎn)染方式進(jìn)入 宿主細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞：用氯化鈣處理宿主細(xì)胞，使細(xì)胞變得易于吸引外源DNA。（2）DNA的侵染（體外包裝轉(zhuǎn)染技術(shù)）體外包裝（將重組DNA分子與噬菌體的頭部、尾部以及有關(guān)包裝蛋白混合，組裝成具感染力的噬菌體粒子）感染宿主。較轉(zhuǎn)染效率要高出104105倍。2、外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞（1）外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞原生質(zhì)體蝸牛酶CaCl2和聚乙二醇復(fù)合體（含DNA的原生質(zhì)體）長(zhǎng)出有壁細(xì)胞再

21、生培養(yǎng)基中（2）外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞 其中最簡(jiǎn)便的是微量注射法和電穿孔法。（3）外DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞： 除了微量注射法及電穿孔法可將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞外。 還有兩種方法，一種是基因槍法或稱微彈槍法；另一種是將含有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)（即共培養(yǎng)法）或與植物葉片培養(yǎng)（即葉片培養(yǎng)法）。五、基因文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的構(gòu)建利用重組DNA技術(shù)，可將某一原核生物或真核生物染色體基因組的全部遺傳信息，貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群體）構(gòu)成的基因文庫(kù)(genomic library)或cDNA文庫(kù)(cDNA library)1. 基因文庫(kù)的構(gòu)建所謂基因文庫(kù)是指生物染色體基因

22、組各DNA片段的克隆總體。文庫(kù)中的每一個(gè)克隆只含基因組中某一特定的DNA片段。一個(gè)理想的基因文庫(kù)應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息（即全部DNA序列）。2、基因文庫(kù)的構(gòu)建步驟：（1）從組織或細(xì)胞提取基因組DNA；（2）用限制性酶部分水解或機(jī)械剪切成適當(dāng)長(zhǎng)度DNA 片段，經(jīng)分級(jí)選出一定大小合適克隆DNA片段；（3）選擇容載量較大的克隆載體，通常采用噬菌體或 柯斯質(zhì)粒載體，在適當(dāng)位點(diǎn)將載體切開(kāi)；（4）將基因組DNA片段與載體進(jìn)行體外連接；（5）重組體DNA直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌或用體外包裝的重組噬 菌體顆粒感染敏感細(xì)菌細(xì)胞。最后得到攜帶重組 DNA的細(xì)菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫(kù)。2. cDNA文庫(kù)構(gòu)

23、建所謂cDNA文庫(kù)是指生物體全部mRNA的cDNA克隆總體。cDNA文庫(kù)中的每一個(gè)克隆只含一種mRNA信息。由于真核生物基因組十分龐大，因此要求構(gòu)建基因文庫(kù)的庫(kù)容量要足夠大，才能篩選到某一目的基因。但基于這樣一個(gè)事實(shí)，即細(xì)胞中的mRNA分子數(shù)要比基因組的基因數(shù)小得多（通常大約僅有15%左右基因被表達(dá)），因而若由mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，那么所構(gòu)建的cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量相應(yīng)比基因文庫(kù)小。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的主要步驟：從生物體或細(xì)胞中提取mRNA。利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚(dT)或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合成cDNA的第一條鏈。利用DNA聚合酶I，以cDNA第一條鏈作為模板，用適當(dāng)引物合成cDNA第二條鏈;常

24、用RNA酶H在雜交分子的mRNA鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列RNA引物;或是除去雜交分子的mRNA后，加入隨機(jī)引物，即可合成第二條鏈。cDNA與載體的體外連接。噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于cDNA不含基因的啟動(dòng)子和內(nèi)含子，因而序列比基因短，其克隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。六、重組體的篩選與鑒定1. 重組體表型特征的鑒定 2. 重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定 3. 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 1. 重組體表型特征的鑒定(1) 抗生素平板法 (2) 插入失活法 (3) 插入表達(dá)法 (4) -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法抗生素平板法缺點(diǎn):假陽(yáng)性高插入失活法 因外源 DNA 的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象

25、，稱為插入失活（ insertional inactivation ）插入表達(dá)法 在某些載體的標(biāo)記基因前面連接一段負(fù)控制序列，當(dāng)外源 DNA 片段插入該負(fù)控制序列中，使負(fù)控制序列失活，因而位于下游的標(biāo)記基因因解除阻遏而得到表達(dá)。例如質(zhì)粒 pTR262 有一個(gè)負(fù)調(diào)控的 cI 基因，當(dāng)外源 DNA 片段插入 cI 基因中的 BcII 或 HindIII 位點(diǎn)，造成 cI 基因失活，位于 cI 基因下游的 tet 基因（受 cI 基因控制）因解除阻遏而被表達(dá)，轉(zhuǎn)化后的重組體細(xì)胞，在含有四環(huán)素的平板中可形成菌落； - 半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法 蘭-白斑篩選：某些載體，如M13，PUC系列，PGEM質(zhì)粒系列

26、等，都帶有l(wèi)ac Z基因的一段序列，編碼半乳糖苷酶的肽；而宿主細(xì)胞為L(zhǎng)ac Z M15的突變株時(shí)， 肽可與M15進(jìn)行互補(bǔ)，產(chǎn)生具有活性的半乳糖苷酶。若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有異丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和呈色物質(zhì)5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(Xgal)培養(yǎng)基的平板上時(shí)，可形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源DNA插入到這一區(qū)段，則會(huì)破壞互補(bǔ)作用。這時(shí)若將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布在含有IPTG和Xgal培養(yǎng)基的平板上，則形成無(wú)色菌落。2. 重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定菌落（或噬菌斑）原位雜交（ in situ hybridization ） 內(nèi)切酶圖譜鑒定 PCR 鑒定 菌落（或噬菌斑）原位雜交將轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)

27、在瓊脂平板上，當(dāng)形成菌落或噬菌斑后，再將硝酸纖維濾膜貼在平板上，使菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上。翻轉(zhuǎn)此濾膜并置于另一不含菌的平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的濾膜上可長(zhǎng)出菌落或噬菌斑。取出濾膜，用裂解液處理使菌體裂解，釋放出 DNA 。再用堿處理，使 DNA 變性，經(jīng)烘烤將變性 DNA 固定于濾膜上。然后用放射性同位素標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行分子雜交，并經(jīng)放射自顯影，黑點(diǎn)代表雜交上的菌落，即可篩選到陽(yáng)性克隆。內(nèi)切酶圖譜鑒定 將初步篩選的陽(yáng)性克隆小量培養(yǎng)后，提取重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體 DNA ，用 12 種內(nèi)切酶酶切，然后進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)插入 DNA 片段大小。 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒 PCR 鑒定 通過(guò)與插入片段

28、兩側(cè)互補(bǔ)的引物，以重組質(zhì)粒 DNA 作為模板進(jìn)行 PCR 分析，可快速測(cè)出插入 DNA 片段大小及鑒定其序列特異性。 DNA 序列測(cè)定 最后為了確證目的基因序列的正確性，必須對(duì)重組體的 DNA 進(jìn)行序列測(cè)定 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 表達(dá)產(chǎn)物免疫活性測(cè)定 表達(dá)產(chǎn)物生物活性檢查 表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測(cè)定 表達(dá)產(chǎn)物免疫活性測(cè)定Western blot with anti-Sak antisera (rabbit)表達(dá)產(chǎn)物生物活性檢查表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測(cè)定一般分析N-末端（15個(gè)殘基序列）和C-末端（一般5個(gè)）氨基酸鑒別蛋白質(zhì)的性質(zhì)和同質(zhì)性；9.5 表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的主要目的是使外源基因能在細(xì)菌

29、、酵母或動(dòng)、植物細(xì)胞中得到高效表達(dá)，以便獲得大量有益的基因表達(dá)產(chǎn)物或改變微生物或動(dòng)、植物的遺傳性狀。 所謂表達(dá)載體（ expression vector ）是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。 用原核細(xì)胞表達(dá)真核生物基因時(shí)，應(yīng)注意的問(wèn)題 基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的，因此要用切除內(nèi)含子的 cDNA ； 基因必須置于原核細(xì)胞啟動(dòng)子、終止子和 SD 序列的控制之下，才能被宿主的轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)有效識(shí)別； 產(chǎn)生的 mRNA 必須相對(duì)穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)折疊。此外還要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。 一 主要調(diào)控元件 啟動(dòng)子核糖體的結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)（

30、1 ）、啟動(dòng)子 （ promoter ） 啟動(dòng)子是指 RNA 聚合酶結(jié)合于 DNA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。原核基因啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)（ transcription initiation ）上游（左側(cè)），它由兩段彼此分開(kāi)且又高度保守的核心序列組成。一個(gè)稱為 -10 區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約 10bp 處； RNA 聚合酶于該處解開(kāi) DNA 雙鏈，并決定轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)；另一個(gè)稱為 -35 區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約 35bp 處，是 RNA 聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)。 原核表達(dá)系統(tǒng)中常用啟動(dòng)子 lac 啟動(dòng)子，是乳糖操縱子的啟動(dòng)子，受 lac I 編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)控制； trp 啟動(dòng)子

31、，是色氨酸操縱子啟動(dòng)子，受 trpR 編碼的阻遏蛋白調(diào)控； tac 啟動(dòng)子，由 lac 啟動(dòng)子的 -10 區(qū)和 trp 啟動(dòng)子 -35 區(qū)融合而成，匯合了 lac 和 trp 兩者優(yōu)點(diǎn)，是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子，同樣受 LacI 阻遏蛋白調(diào)控 。 P(L 、 R) 啟動(dòng)子，是噬菌體左、右向啟動(dòng)子，其溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調(diào)控； T 7 噬菌體啟動(dòng)子，比大腸桿菌啟動(dòng)子強(qiáng)得多且十分專一，只被 T 7 RNA 聚合酶所識(shí)別。 核糖體結(jié)合位點(diǎn)原核微生物的 mRNA 結(jié)合核糖體的序列最初是由夏英（ Shine ）和達(dá)爾加諾（ Dalgarmo ）發(fā)現(xiàn)的，因此稱為 SD 序列;在大腸桿菌中，核糖體結(jié)合點(diǎn)包括起

32、始密碼子 (AUG) 及位于起始密碼子上游 11bp 處，長(zhǎng)度為 bp 的序列;這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與核糖體小亞基上 16S rRNA 3 端一段富含嘧啶的保守序列互補(bǔ)，從而帶動(dòng)核糖體與 mRNA 的結(jié)合。 轉(zhuǎn)錄終止子轉(zhuǎn)錄終止子指一段位于基因或操縱子的 末端，具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定 DNA 序列。高效表達(dá)載體應(yīng)該含有終止子，因?yàn)楹铣傻?mRNA 過(guò)長(zhǎng)，不僅消耗細(xì)胞內(nèi)的底物和能量，且易使 mRNA 形成妨礙翻譯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 密碼子的偏愛(ài)性 由于密碼子的簡(jiǎn)并性，一個(gè)氨基酸可有多個(gè)密碼子。在原核生物細(xì)胞中，對(duì)于 tRNA 豐富的密碼子稱為偏愛(ài)密碼子（ biased codons ），而對(duì)應(yīng)于

33、 tRNA 稀少的密碼子稱為稀有密碼子（ rare codons ） 二 表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)的作用 通常表達(dá)載體不應(yīng)使外源基因始終處于轉(zhuǎn)錄和翻譯之中。這是由于某些有價(jià)值的外源蛋白可能對(duì)宿主細(xì)胞是有毒的，外源蛋白的過(guò)量表達(dá)必將影響細(xì)胞生長(zhǎng)； 宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)應(yīng)該分成兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段使含有外源基因的宿主細(xì)胞迅速生長(zhǎng)直至獲得足夠量的細(xì)胞。第二階段是啟動(dòng)開(kāi)關(guān)，使所有細(xì)胞外源基因同時(shí)高效表達(dá)，產(chǎn)生大量有價(jià)值的表達(dá)產(chǎn)物。外源基因表達(dá)常采用化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)與溫度誘導(dǎo)兩種不同方法?；瘜W(xué)物質(zhì)誘導(dǎo) 當(dāng)用lac啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，lac啟動(dòng)子受CAP蛋白和cAMP的正調(diào)控。受阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控；當(dāng)宿

34、主細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，lac I基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合，阻礙外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，此時(shí)細(xì)胞大量生長(zhǎng)和繁殖。加入誘導(dǎo)物IPTG后，由于誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使其不能與操縱基因結(jié)合。于是，外源基因被誘導(dǎo)而高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)?，F(xiàn)在基因工程所用lac啟動(dòng)子常用其經(jīng)紫外誘變改造的啟動(dòng)子lac UV5。該啟動(dòng)子失去CAP和cAMP的正調(diào)控，只要有乳糖或IPTG存在時(shí)就能夠啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。溫度誘導(dǎo)當(dāng)用PL、R啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，PL、R啟動(dòng)子受噬菌體cI基因的負(fù)調(diào)控，cI基因產(chǎn)生的阻遏蛋白結(jié)合在操縱基因上，阻止轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。目前利用cI的溫度敏感突變基因（cI 857 ts）調(diào)節(jié)這種阻遏。當(dāng)在28-30培養(yǎng)時(shí)

35、，該突變體產(chǎn)生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R轉(zhuǎn)錄，細(xì)菌大量生長(zhǎng)。在獲得足夠量菌體后，使溫度上升至42，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，啟動(dòng)外源基因的高效轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而合成大量有價(jià)值的外源蛋白。三 非融合蛋白的表達(dá) 為了在原核細(xì)胞中表達(dá)非融合蛋白，可將帶有起始密碼子 ATG 的真核基因插入到合適的原核啟動(dòng)子和 SD 序列下游。經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，就可在原核細(xì)胞中，表達(dá)出非融合蛋白。 外源蛋白的分泌表達(dá) 分泌型表達(dá)載體除具有一般表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)外，還需要具有編碼信號(hào)肽的序列。通常信號(hào)肽與外源蛋白的 N 端連接，由于信號(hào)肽含有帶正電荷的氨基酸和疏水氨酸，故能攜帶表達(dá)蛋白越膜分泌到周質(zhì)或胞外，然后質(zhì)膜

36、上的信號(hào)肽酶將信號(hào)肽切除。 包涵體 （ inclusion body ） 當(dāng)外源蛋白在大腸桿菌高水平表達(dá)時(shí)，常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集而形成包涵體。利用大腸桿菌生產(chǎn)的非融合蛋白多數(shù)情況下以包涵體形式存在。 形成包涵體有利于外源蛋白的高水平表達(dá)和防止蛋白酶對(duì)其的降解，也可避免外源蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的毒害。此外也有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離。但包涵體形式的表達(dá)蛋白不具生物學(xué)活性，需要體外復(fù)性。四 融合蛋白的表達(dá)所謂融合蛋白是指蛋白質(zhì)的 N 端由宿主基因（通常只是 N 端的部分序列）編碼， C 端由外源基因編碼的蛋白質(zhì)，換言之，融合蛋白是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的雜合蛋白。 表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點(diǎn) 融合蛋白較

37、易獲得高效表達(dá)。融合蛋白的 N 端總是選擇天然的高表達(dá)的宿主蛋白質(zhì)，其 mRNA 具有較強(qiáng)的翻譯能力；融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)比較穩(wěn)定。外源蛋白特別是相對(duì)分子量較小的蛋白，通常在宿主細(xì)胞內(nèi)極易被胞內(nèi)蛋白酶所清除。但是如果構(gòu)成融合蛋白，就可使外源蛋白不受宿主細(xì)胞降解；易于純化。9.6 DNA的合成、體外擴(kuò)增1 、 DNA 的合成 自 DNA 合成儀問(wèn)世后，化學(xué)合成已可完全自動(dòng)化，在半個(gè)小時(shí)內(nèi)可合成 3035 個(gè)堿基的寡核苷酸。目前化學(xué)合成寡核苷酸片段的長(zhǎng)度約為 150200 個(gè)核苷酸左右。PCR 擴(kuò)增技術(shù)的原理和應(yīng)用 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ polymerase chain reaction, PCR ），是

38、一種在體外快速擴(kuò)增特定 DNA 序列的新技術(shù)。如果 DNA 片段兩端的序列是已知的，則先要合成一對(duì)寡聚核苷酸引物，它們各自與所需擴(kuò)增的靶 DNA 片段的末端互補(bǔ)。 PCR 由 3 個(gè)基本反應(yīng)組成。 變性: 加熱，模板 DNA 經(jīng)熱變性，成為兩條單鏈； 退火: 使溫度下降，寡核苷酸引物即與模板 DNA 中所要擴(kuò)增序列兩端的堿基配對(duì)； 延伸: 在適宜條件下引物 3 端向前延伸，合成與模板堿基序列完全互補(bǔ)的 DNA 鏈。DNA 片段以 2 的指數(shù)增長(zhǎng)，重復(fù) 2530 次循環(huán)，擴(kuò)增的 DNA 片段拷貝數(shù)可增至 10 6 -10 7 倍。 PCR 擴(kuò)增技術(shù)原理 PCR 技術(shù)的實(shí)際用途 可用于 DNA 的

39、擴(kuò)增和克隆，制備單鏈或雙鏈 DNA 探針；也可用于定位誘變和 DNA 測(cè)序。 在臨床醫(yī)學(xué)上可用于檢測(cè)病原體，診斷遺傳病，以及對(duì)癌基因的分析確定。 用于法醫(yī),以鑒別個(gè)體和判定親緣關(guān)系。 基因誘變寡核苷酸介導(dǎo)的突變 盒式誘變 PCR介導(dǎo)的突變 9.7 基因工程的應(yīng)用基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因治療在微生物研究中應(yīng)用基因工程藥物胰島素人生長(zhǎng)激素干擾素白細(xì)胞介素2粒細(xì)胞集落刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子紅細(xì)胞生成素 EPO組織纖溶酶原激活劑生長(zhǎng)激素促生長(zhǎng)素抗血友病因子脫氧核糖核酸酶葡糖腦苷脂酶鼠單克隆抗體基因工程藥品 胰島素胰島素是治療糖尿病的特效藥。一般臨床上使用的胰島素主要從豬、牛等家

40、畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰島素。用該方法生產(chǎn)的胰島素產(chǎn)量低，價(jià)格昂貴，遠(yuǎn)不能滿足社會(huì)需要。1979年，科學(xué)家將動(dòng)物體內(nèi)的胰島素基因與大腸桿菌DNA分子重組，并在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。1982年，美國(guó)一家基因公司用基因工程方法生產(chǎn)的胰島素投入市場(chǎng)，售價(jià)降低了30%50%。 干擾素是病毒侵入細(xì)胞后產(chǎn)生的一種糖蛋白。干擾素幾乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一種抗病毒的特效藥。此外干擾素對(duì)治療某些癌癥和白血病也有一定療效。傳統(tǒng)的干擾素生產(chǎn)方法是從人血液中的白細(xì)胞內(nèi)提取，每300 L血液只能提取出1 mg干擾素。19801982年，科學(xué)家用基因工程方法在大腸桿菌及酵母菌細(xì)胞內(nèi)獲得了干

41、擾素，是傳統(tǒng)的生產(chǎn)量的12萬(wàn)倍。1987年上述干擾素大量投放市場(chǎng)。 基因工程藥品 干擾素基因工程藥品 生長(zhǎng)激素 治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長(zhǎng)激素。而生長(zhǎng)激素的獲得很困難。以前，要獲得生長(zhǎng)激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長(zhǎng)激素。 現(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長(zhǎng)激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長(zhǎng)激素。人們從 450 L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長(zhǎng)激素，相當(dāng)于6萬(wàn)具尸體的全部產(chǎn)量。 基因工程藥物的生產(chǎn)過(guò)程1、目的基因的提?。悍蛛x或合成外源基因。2、體外重組：外源基因與載體體外連接，構(gòu)建重組DNA分子；3、轉(zhuǎn)化：重組DNA分子導(dǎo)入細(xì)胞。4、篩選與鑒定；5、基因表達(dá)：控制

42、適當(dāng)條件，外源DNA表達(dá)。6、表達(dá)產(chǎn)物的純化下面以胰島素為例介紹基因工程藥物的生產(chǎn)過(guò)程A鏈和B鏈分別表達(dá)法基因工程菌的構(gòu)建戰(zhàn)略：化學(xué)合成A鏈序列表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線人胰島素原表達(dá)法A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。基因治療1990年9月14日，美國(guó)馬里蘭州的Bethesda醫(yī)院里，年僅4歲的女孩阿尚蒂(Asshanthi DeSilva)接受了人類歷史上第一次基因治療臨床試驗(yàn)，為其主持治療的是美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的CWBlease

43、教授、KWCulver教授和(French Anderson)教授等。 阿尚蒂忠有一種嚴(yán)重的復(fù)合型免疫功能缺乏癥（SCID），這是一類致命性遺傳性疾病。該疾病如果不加治療，患者在l2年必死無(wú)疑。所幸的是世界上這種疾病非常罕見(jiàn)，在美國(guó)每年只有40名患兒出生。 阿尚蒂就是由于先天性缺乏腺苷脫氨酶(ADA)而導(dǎo)致SCID的,由于ADA酶的缺陷，人體細(xì)胞內(nèi)脫氧腺苷大量積累，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞的中毒死亡；沒(méi)有了T淋巴細(xì)胞，人體免疫系統(tǒng)就基本上被破壞了，這種情況類似于艾滋病患者晚期，很容易感染死亡。阿尚蒂只有生活在無(wú)菌的隔離病房，依賴沒(méi)完設(shè)了的PEGADA酶的體外注射，通過(guò)這種外源ADA酶補(bǔ)充體內(nèi)的不足ADA酶進(jìn)入細(xì)胞談何容易？低效的治療，頻繁的輸注、昂貴的價(jià)格、潛在的病毒危害、免疫反應(yīng)讓阿尚蒂的生命看不到明天的希望。正是由于這種疾病的特殊性，該病成為基因治療早期探索和開(kāi)展臨床試驗(yàn)的理想病種。1990年美國(guó)政府終于批準(zhǔn)了世界上第一例基因治療臨床試驗(yàn)對(duì)阿尚蒂實(shí)施ADA基因治療。醫(yī)生和科學(xué)家們從阿尚蒂身上抽血，從中分離出少量的T淋巴細(xì)胞（患者體內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量很少），在體外進(jìn)行生長(zhǎng)和擴(kuò)增，通過(guò)一種改造的反轉(zhuǎn)錄病毒將正常的ADA基因轉(zhuǎn)移進(jìn)去;雖然，這種方法并沒(méi)有修復(fù)她缺陷的