最新魚(yú)類線粒體的遺傳分析研究

關(guān)于最新魚(yú)類線粒體的遺傳分析研究第1頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五研究背景線粒體是存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)的一種基本的重要的細(xì)胞器，它含有自己的DNA，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)。它是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化的場(chǎng)所。線粒體基因組不僅是研究DNA結(jié)構(gòu)與復(fù)制轉(zhuǎn)錄的良好模型，也是研究真核細(xì)胞核酸與蛋白質(zhì)合成非常合適的模型系統(tǒng)。第2頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五魚(yú)類線粒體基因組

線粒體DNA是Nass等在1962年發(fā)現(xiàn)的。之后，1992年臺(tái)灣學(xué)者Tzeng等發(fā)表了臺(tái)灣纓口鰍線粒體DNA全序列，這在魚(yú)類是首次。截止到2004年已測(cè)定161種魚(yú)類線粒體DNA全序列，它們的分子量在15.2~19.8Kb之間。（除海七鰓鰻、淡水七鰓鰻和溪鳉外,其余158種魚(yú)mtDNA的結(jié)構(gòu)和基因成分都與其他脊椎動(dòng)物的類似魚(yú)類線粒體DNA基因組結(jié)構(gòu)示意圖

（西田，1998）第3頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五37個(gè)編碼基因22個(gè)tRNAs2個(gè)rRNA基因：(12SrRNA和16SrRNA)控制區(qū)(D—環(huán)區(qū))輕鏈復(fù)制起始區(qū)13個(gè)疏水蛋白基因細(xì)胞色素b(Cytb)2個(gè)ATP酶的亞單(ATPase8和ATPase6)3個(gè)細(xì)胞色素c(Cytc)氧化酶的亞單位(COⅠ、Ⅱ和Ⅲ)7個(gè)NADH還原酶復(fù)合體的亞單位(ND-1、-2、-3、-4、-4L、-5和-6)第4頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五魚(yú)類線粒體DNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提取方法研究進(jìn)展應(yīng)用前景研究?jī)?nèi)容遺傳特點(diǎn)檢測(cè)分析第5頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五一、魚(yú)類mtDNA的遺傳特點(diǎn)

mtDNA通常為母性遺傳,這種傳遞方式是由于成熟的卵母細(xì)胞所含的mtDNA較精子中的mtDNA高幾千倍。該遺傳方式便于進(jìn)行群體分析,只需少量個(gè)體便能反應(yīng)群體遺傳結(jié)構(gòu)。

mtDNA進(jìn)化主要以堿基替換為主,插入和缺失較少;堿基替換主要發(fā)生在基因間隔區(qū)和控制區(qū),且不同部位替換速率不同。

mtDNA進(jìn)化速率較核DNA快5～10倍,其原因主要有:(1)選擇壓力小;(2)受誘變的影響大;(3)代謝增補(bǔ)時(shí)間短;(4)復(fù)制無(wú)校對(duì)修復(fù)第6頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五1、分子較小且存在長(zhǎng)度多態(tài)性:魚(yú)類mtDNA分子大小范圍一般在15-19kp之間，約占總DNA的1％。魚(yú)類mtDNA的分子大小在種間存在差異，但這種長(zhǎng)度差異并非源于基因數(shù)目，主要由于串聯(lián)重復(fù)序列的存在。2、編碼效率高:同核DNA相比，mtDNA上的基因排列極其緊湊，基因間隔常少于10bp,且無(wú)內(nèi)含子，編碼效率較高。此外,部分mtDNA的密碼子不同于基因組DNA，且缺少終止密碼子，僅以U或UA結(jié)尾。3、拷貝數(shù)多:魚(yú)類每個(gè)細(xì)胞中有1000—10000個(gè)線粒體DNA拷貝，容易從組織中分離純化。4、進(jìn)化速度快:魚(yú)類mtDNA的突變率高于核中DNA，為基因組DNA的5一10倍，并且缺乏有效的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，修復(fù)效率低。

二、魚(yú)類mtDNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)第7頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五5、解碼體系簡(jiǎn)單:魚(yú)類mtDNA的解碼由一個(gè)很小的tRNA體系完成，而不像在核基因組擺動(dòng)假說(shuō)中所要求的需要在32個(gè)tRNA反密碼子上的擺動(dòng)。6、遺傳的相對(duì)獨(dú)立性:mtDNA能以自身為模板進(jìn)行復(fù)制，能轉(zhuǎn)錄生成信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tDNA)和核糖體RNA(rRNA),也能編碼合成一些維持自身結(jié)構(gòu)和功能所必需的蛋白質(zhì)，具有很大的獨(dú)立性。同時(shí)，線粒體的遺傳行為受到核基因的調(diào)控，這種調(diào)控主要是通過(guò)向線粒體輸入核DNA編碼蛋白質(zhì)和一些小的RNA，特別是tRNA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。7、同質(zhì)性與異質(zhì)性:一般情況下，在一種生物機(jī)體內(nèi)僅存在一種類型的mtDNA分子，但現(xiàn)在大量發(fā)現(xiàn)一些個(gè)體存在多種類型mtDNA分子，這種特性被稱mtDNA分子的異質(zhì)性。8、多態(tài)性:mtDNA中存在多態(tài)現(xiàn)象多態(tài)性集中在D環(huán)，其他區(qū)域則高度保守一。9、母系遺傳:mtDNA一般不發(fā)生重組，隨細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行。但鰻魚(yú)線粒體為雙親遺傳第8頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五三、魚(yú)類mtDNA的提取方法（1）直接從魚(yú)類組織提取線粒體DNA

從肌肉、肝臟等組織中提取線粒體DNA。其中堿變性法是常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)方法，主要溶液是STE液：10mmolNaC1，15mmolTris-HC1(pH8.0)，45mmolEDTA(pH8.0)，0.25mol蔗糖。把提取的線粒體DNA放入一20℃保存?zhèn)溆?。該方法獲得的是魚(yú)類的整個(gè)mtDNA分子。

一般肝細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、腎臟細(xì)胞中的線粒體數(shù)目較多，直接提取mtDNA獲得純度很高的mtDNA用于研究要選取這些組織，必須殺死魚(yú)才能得到，研究存在數(shù)量多的魚(yú)類可以采用該法。（2）先提取基因組DNA再用相應(yīng)引物PCR擴(kuò)增所需mtDNA某一區(qū)域序列片段。第9頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五四、魚(yú)類mtDNA的檢測(cè)分析目前用于魚(yú)類mtDNA多態(tài)性的檢測(cè)方法主要有以下幾種：（1）、內(nèi)切酶圖譜法：一般用雙酶消化構(gòu)建魚(yú)類mtDNA限制酶圖譜。內(nèi)切酶圖譜法是一種較早的研究方法,此法雖在檢測(cè)點(diǎn)突變上較為直觀,但費(fèi)時(shí)且須做雙酶切,其譜帶亦較復(fù)雜,若個(gè)體出現(xiàn)多態(tài)就更難解釋。（2）、標(biāo)準(zhǔn)RFLP：其研究步驟為：mtDNA樣品一RE消化一電泳一結(jié)果檢測(cè)。該法適合于分析樣品中靶序列含量相對(duì)較高的樣品，如mtDNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，還可進(jìn)行位點(diǎn)比較和片段長(zhǎng)度比較。（3）、PCR—RFLP法：從細(xì)胞總DNA中，用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增mtDNA某一序列，RE消化，溴化乙錠染色，電泳檢測(cè)。這一技術(shù)不僅可直接酶切小于500—2000bp的短小片段，還避免了純化mtDNA的繁瑣工作。第10頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五（4）、探針?lè)ǎ河址Q雜交法。將基因組DNA酶切，用mtDNA探針進(jìn)行South雜交來(lái)識(shí)別DNA上的mtDNA譜帶，通過(guò)自顯影檢測(cè)印跡。（5）、PCR-SSCP:是PCR技術(shù)和SSCP技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性后進(jìn)行單鏈DNA凝膠電泳時(shí)每一條單鏈處于一定的位置,靶DNA中若發(fā)生堿基缺失插入或單個(gè)堿基置換時(shí)就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位從而揭示該片段有基因變異的存在。（6）、測(cè)序法：直接測(cè)定mtDNA的全序列或特定片段的序列。這種方法可獲得大量直接可靠的數(shù)據(jù)。（目前，一般測(cè)序公司采用測(cè)序的原理是雙脫氧鏈終止法）

第11頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五五、魚(yú)類mtDNA研究進(jìn)展（一）、魚(yú)類全序列mtDNA研究

曹螢等使用6種酶對(duì)尼羅非鯽和奧利亞非鯽的mtDNA進(jìn)行RFLP分析,測(cè)得兩種魚(yú)mtDNA都約為16.83kb,并認(rèn)為PvuⅡ可作為鑒別兩種魚(yú)類的限制性內(nèi)切酶（二）、魚(yú)類mtDNA編碼區(qū)各片段的研究1、細(xì)胞色素b(Cyt-b)基因片段

田燚等對(duì)六個(gè)鯽魚(yú)品系進(jìn)行了線粒體Cytb基因PCR-RFLP分析利用5種限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)胞色素b基因進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示供檢測(cè)到4種組合單倍型，野鯽和黑龍睛的遺傳距離為0，高背鯽與彭澤鯽的為0，野鯽與紅鯽為0.00039。得到的結(jié)果為鯽魚(yú)群體內(nèi)的多態(tài)性比較貧乏。

第12頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五2、ATPase8、ATPase6

劉良國(guó)等運(yùn)用PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序等技術(shù)對(duì)五種鯽魚(yú)品系的線粒體DNAATPase8、ATPase6的基因序列的堿基組成、變異情況和分子系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了比較分析發(fā)現(xiàn)紅鯽和普通鯽關(guān)系較近，洞庭青鯽和彭澤鯽關(guān)系較近，而他們與日本白鯽關(guān)系較遠(yuǎn)，因此推測(cè)紅鯽、洞庭青鯽和彭澤鯽均起源于普通鯽。3、NADH降解酶基因(1)姚紀(jì)花等對(duì)我國(guó)6個(gè)地區(qū)銀鯽的mtDNA2ND5/6片段進(jìn)行了RFLP分析,共獲得11種圖譜和7種限制性類型,根據(jù)各群體間的遺傳距離構(gòu)建了UPGMA聚類關(guān)系圖,探討了銀鯽6個(gè)種群間的遺傳關(guān)系。第13頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五（2）莊怡等人采用PCR-RFLP方法分析鯽魚(yú)不同品系mtDNAND3/ND4L

/ND4基因片段，對(duì)鯽魚(yú)6個(gè)不同品系的基因片段進(jìn)行測(cè)序。首次提出異育銀鯽和浙江地區(qū)野鯽（河鯽魚(yú)）在mtDNAND3/ND4L/ND4基因上的分子鑒定法。4、細(xì)胞色素c基因片段

大量研究表明，物種內(nèi)的COI基因的序列分歧很少有大于2%的,大部分的種內(nèi)分歧小于1%。程磊等人利用魚(yú)類的DNA條形碼研究了線粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基I(COI)基因5'端651bp的片段在這些種和亞種（共計(jì)128尾標(biāo)本）中的變異。得到的結(jié)論為：金魚(yú)起源于中國(guó)南方的鯽而不是銀鯽，以及發(fā)現(xiàn)某些單倍型是二倍體與三倍體共享的，所以倍性也不宜作為種的劃分標(biāo)準(zhǔn),簡(jiǎn)單的將三倍體視為獨(dú)立的種或者亞種并不恰當(dāng)。第14頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五（三）、魚(yú)類mtDNA非編碼區(qū)各片段基因研究進(jìn)展

魚(yú)類mtDNA非編碼區(qū)包含兩段,一段是控制區(qū)(controlregion),另一段是L-鏈復(fù)制起始區(qū)。1、mtDNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)研究：控制區(qū)又稱D-環(huán)區(qū),位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間,是整個(gè)mtDNA序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域,但其中也包含有保守片段。因此常常作為線粒體mtDNA遺傳分析基因片段，例如：朱雪蓮等人借助mtDNA控制區(qū)序列分析金魚(yú)與不同地域鯽的親緣關(guān)系。劉琳等人應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)行兩性生殖的天津子牙河42尾二倍體野生鯽魚(yú)群體mtDNA的D-loop區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：個(gè)體間不存在長(zhǎng)度變異現(xiàn)象第15頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五控制區(qū)包括H鏈復(fù)制起始區(qū)：OH終止結(jié)合序列區(qū)：TAS保守序列區(qū)：CSBL-鏈啟動(dòng)子：LSPH-鏈啟動(dòng)子：HSP第16頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五（1）、H鏈復(fù)制起始區(qū)：OH包含與DNA復(fù)制終止相關(guān)的序列TAS,拷貝數(shù)在l～8個(gè)之間,mtDNA長(zhǎng)度變異的主要原因。目前郭新紅[1]等人識(shí)別了不同倍性鯉科魚(yú)中的ETAS

為TACATAT--------ATGTATTATCACCAT-----TATATTAACCA-郭新紅等人在研究不同倍性鯉科魚(yú)類mtDNA控制區(qū)的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)紅鯽、鯉魚(yú)、異源四倍體鯽鯉含有4個(gè)TACAT核心序列,日本白鯽中含有3個(gè)TACAT核心序列,三倍體湘云鯉含有1個(gè)TACAT核心序列,而已有報(bào)道的斑馬魚(yú)中含有6個(gè)TACAT核心序列。第17頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五（2）、中央保守區(qū)郭新紅等人識(shí)別了不同倍性鯉科魚(yú)類mtDNA控制區(qū)的中央保守區(qū)的CSB-F(關(guān)鍵為:ATGTAG----GAG

ACCACC),CSB-E(關(guān)鍵序列為:ATG-AT-GAATCA-GGACA-),CSB-D(關(guān)鍵序列為:TTAT-CTGG-ATCTG-T-AA)第18頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五（3）、保守序列區(qū)郭新紅等人識(shí)別了不同倍性鯉科魚(yú)類的CSB1(一般形式為:ATT-AATTAATG-T-GCAGGACA-TA),CSB2(一般形式為:CAAA-CCC

CCCTACCCCC),CSB3(一般形式為:TGTCAAACCCGAAA

CCA)第19頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五2、L-鏈復(fù)制起始區(qū)L-鏈復(fù)制起始區(qū)(OL)長(zhǎng)約30～50bp,位于L-鏈tRNAAsp和tRNACys基因間。富含G-C對(duì),而環(huán)的堿基組成、長(zhǎng)度變異比較大。5′-GCCGG-3′是OL中RNA引物與DNA合成的轉(zhuǎn)換區(qū),位于H-鏈OL莖區(qū)5′端,其序列組成和位置從人、海豹、果蠅到鯉魚(yú)、泥鰍、虹鱒都是十分保守的。第20頁(yè)，共23頁(yè)，2022年，5月20日，3點(diǎn)16分，星期五六、魚(yú)類mtDNA應(yīng)用前景1、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析例如：周建峰等運(yùn)用PCR-RFLP方法分析了鯉魚(yú)3個(gè)亞種線粒體DNA的ND5/6區(qū)段來(lái)了解它們之間的遺傳關(guān)系,找到了區(qū)分鯉魚(yú)3個(gè)亞種的線粒體DNA分子遺傳標(biāo)記2、類群識(shí)別例如：多態(tài)性豐富的mtDNA可作為類群識(shí)別的標(biāo)志。Barlett等【5】利用Cytb基因的307bp序列，成功地區(qū)別了加拿大東海岸的4種有重要商業(yè)價(jià)值的金槍魚(yú)，為保護(hù)處于瀕危狀態(tài)的藍(lán)鰭金槍魚(yú)提供了技術(shù)支持。Murakami等分析了169尾鯽魚(yú)的