RNA原位核酸雜交方法

Word-25-RNA原位核酸雜交方法

RNA原位核酸雜交辦法

一、根本原理RNA原位核酸雜交（RNAnucleicacidhybridizationinsitu）又稱RNA原位雜交組織化學(xué)（RNAinsituhybridizationhistochemistry）或RNA原位雜交[6,7,25]（RNAinsituhybridizationRISH）該技術(shù)是指運(yùn)用cRNA或寡核甘酸等探針檢測細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表述的一種原位雜交技術(shù)其根本原理是在細(xì)胞或組織構(gòu)造保持不變的條件下，用標(biāo)記的的RNA核甘酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合（雜交），所形成的雜交體（Hybrids）經(jīng)顯色反響后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子RNA原位雜交技術(shù)經(jīng)不斷改進(jìn)，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA原位雜交技術(shù)尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表述方面已展現(xiàn)了分子生物學(xué)的一重要方向RNA原位雜交不同于DNA原位雜交主要有

（1）使用的探針不同RNA原位雜交中多承受RNA或寡核甘酸探針，因此避免了應(yīng)用雙鏈DNA探針在雜交反響中存在的兩條鏈之間的復(fù)性和第二條鏈的競爭性雜交問題CRNA-RNA之間形成的雜交體要比DNA-DNA、CDNA-RNA雜交體性能穩(wěn)定，在雜交反響后可用RNA酶洗脫，以除去未結(jié)合的探針，因此特異性更強(qiáng)

（2）檢測的目的不同RNA原位雜交檢測和分析的主要為內(nèi)源性基因，包括細(xì)胞內(nèi)固有基因、特殊基因和變異基因以正確反映組織與細(xì)胞之間互相關(guān)系及功能和代謝狀態(tài)、探索疾病發(fā)病機(jī)理、觀察治療的療效和評估疾病的預(yù)后等第二為對外源性基因檢測，以得到病毒和細(xì)菌類型等病原學(xué)診斷而DNA原位雜交主要為外源性基因檢測

（3）有較高的敏捷度在檢出細(xì)胞和組織內(nèi)在低拷貝核昔酸時，RNA原位雜交能得到較好定位，而DNA原位雜交則難以相信但RNA原位雜交也存在某些缺乏之處，為使RNA原位雜交標(biāo)準(zhǔn)化和抑制其缺乏之處必須留意以下幾點(diǎn)

（1）不同探針種類的挑選、制備和標(biāo)記要適合靶核酸和組織的特征；

（2）有效制止組織和細(xì)胞內(nèi)RNA降解；

（3）實(shí)驗(yàn)流程中嚴(yán)防RNA酶污染；

（4）對雜交信號有效的放大和顯色技巧；

（5）陽性結(jié)果判別，不僅需要有陽性和陰性標(biāo)本比照，有條件的更需要觀測Northern雜交和免疫組化對同一組織的冰凍切片和石蠟切片中，基因及其產(chǎn)物兩者表述之間聯(lián)系

（6）在實(shí)驗(yàn)流程的各個技術(shù)環(huán)節(jié)中熟練運(yùn)用技術(shù)把握是保證RNA原位雜交勝利的須要條件近幾年來RNA原位雜交已獲得穩(wěn)步發(fā)展主要表現(xiàn)在非同位素標(biāo)記的探針制備和標(biāo)記技術(shù)的長進(jìn)、雜交信號放大的應(yīng)用、組織預(yù)處理的改進(jìn)、RNA原位雜交和免疫組化雙重檢測技術(shù)和激光共聚焦顯微鏡在多重RNA原位雜交中應(yīng)用等從理論上講，RNA原位雜交已趨成熟和完美，關(guān)鍵是在實(shí)際應(yīng)用中能否被人們所受接并應(yīng)用到各學(xué)科的爭論中，增進(jìn)人們對各類基因識別和表述邏輯的陌生

二、RNA原位雜交中的探針

（一）探針的種類RNA探針是指帶有標(biāo)記的能與組織內(nèi)相對應(yīng)的核甘酸序列互補(bǔ)結(jié)合的一段單鏈CDNA或cRNA分子依據(jù)在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種即特異性cDNA、cR徹低配對的雜交體形成速率降低短寡核甘酸與靶序列形成的雜交體極易解體，雜交后漂洗必須盡快發(fā)展

2.在使用靶序列徹低配對的單一寡核昔酸探針時，雜交條件極易從雜交體的Tm值推得對短于18個核甘酸的寡核甘酸，將雜交體中A殘基數(shù)與T殘基數(shù)和乘以2℃,再將殘基G與C殘基數(shù)的和乘以4℃,兩積相加便得出雜交體的Tm值但對于含有較長寡核甘酸的雜交體，承受此法結(jié)算的Tm值偏高留意事項(xiàng)

1.去離子甲酰胺的濃度（deionizedformamidedF）為47%,過高和過低甲酰胺的濃度都會影響雜交結(jié)果，當(dāng)去離子酰胺濃度高于或低于47%,應(yīng)加ddH2O調(diào)節(jié)，并依據(jù)Longetal1992年報導(dǎo)，計算去離子甲酰胺百分比公式為%dF=%GC=寡核甘酸G+C磴基量的百分比，1=寡聚核甘酸探針長度，％mismatch=寡核甘酸不能與靶核甘酸配對磴基的百分比，47=雜交溫度+10℃（在37℃下）

2.雜交液內(nèi)參與變性剪切的鞋魚精子DNA在雜交前參與，與另外雜交液分開儲存

3.雜交液能在一20℃保存幾個月

（六）雜交后處理

1.將切片置37℃2xSSC中漂洗2xl0min

2.在37℃2xSSC漂洗2xl5min、lxSSC漂洗2xl5min、

0.25xSSC漂洗2xl5min均需用振蕩漂洗切片

（七）免疫檢測及顯色

1.BufferAPH

7.5（

0.1mol/LTris,lmol/LNaCI,2mmol/LMgCI2,500|jlTween20）沖洗、漂洗各3x5min

2.用DAKO魔筆沿組織四面劃圈，每張切片滴加Streptavidin-AP（鏈菌素抗生物素-堿性磷酸酶）抗體30|jl（lMg/ml）,置37℃溫盒內(nèi)1小時

3.BufferBPH

9.5（

0.lmol/LTris,lmol/LNaCI,5mmol/LMgCI2）沖洗、漂洗各3x5min

4.BufferCPH

9.5（

0.lmol/LTris,

0.lmol/LNaCI,5mmol/LMgCI2）沖洗、漂洗各3x5mine5,每張切片滴加50-1003顯色液（1mlBufferCPH

9.5內(nèi)含

0.33mgNBT+0?16mgBCIP,lmmol/L左旋咪n坐在黑暗條件下顯色20-40min,顯微鏡下把握效果ddH20中止反響

6.用核固紅復(fù)染l-3min,次日在在37℃恒溫箱內(nèi)枯燥切片15mm后，單張切片迅速經(jīng)二甲苯，中性樹膠封片

（八）陽性信號的評定原位雜交的陽性信號位于漿內(nèi)，經(jīng)NBT/BCIP顯色，陽性信號為藍(lán)色，呈細(xì)顆粒狀信號越強(qiáng)，色彩越深，呈藍(lán)紫色和紫黑色陰性比照片內(nèi)無陽性信號檢出原位雜交的陽性等級按以下辦法計算

1.陽性細(xì)胞數(shù)陽性細(xì)胞W10%、30%70%和70%分離計

1、

2、3和4分

2.陽性著色強(qiáng)度雜交信號強(qiáng)度可分為弱、中、強(qiáng)三級分離計

1、2和3分，上述兩種計分相加，1-3分者為陰性，4-5分者為陽性，6-7分者為強(qiáng)陽性

（九）原位雜交的比照原位雜交流程中陰性比照設(shè)定在ERmRNA、PRmRNA的陽性組織片中,在雜交過程中加雜交液不加探針，在免疫檢測中不加Streptavidin-AP等，其結(jié)果均為陰性留意事項(xiàng)

1.陽性比照對含有豐盛靶mRNA的組織和細(xì)胞和不含有靶細(xì)胞mRNA的組織和細(xì)胞作比照技術(shù)把握包括遵守正確的實(shí)驗(yàn)操作和留意事項(xiàng)和不正確實(shí)驗(yàn)操作之間的比照對組織中mRNA保存、RNA和寡核昔酸探針及各種緩沖液配制毀滅的不應(yīng)該陽性和陰性結(jié)果比較

2.陰性比照對缺靶mRNA的組織和細(xì)胞為陰性比照技術(shù)把握包括靶細(xì)胞在原位雜交過程中用RNA酶消化靶mRNA,靶組織的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)無陽性結(jié)果檢出，雜交用敏感的探針和無關(guān)探針應(yīng)毀滅差異，檢測省略標(biāo)記探針或略去抗地高辛抗體均為陰性結(jié)果

五、用CDNA探針檢測體外哺育細(xì)胞中的RNA原位雜交

（一）細(xì)胞的準(zhǔn)備、固定和細(xì)胞的通透

1.在37c5%CO2大氣壓下，用涂有多聚左旋賴氨酸的顯微載玻片上哺育細(xì)胞

2.用O.Olmol/LPH

7.4PBS漂洗細(xì)胞，用福爾馬林醋酸固定液（用

0.9%NaCI配制，內(nèi)含4%甲醛、5%醋酸）常溫下固定30mino

3.常溫下用

0.01mol/LPH

7.4PBC沖洗已固定細(xì)胞片，然后將細(xì)胞片儲存在4c70%酒精內(nèi)

4.雜交前處理，按70%、90%和100%各級酒精梯度脫水，用二甲苯洗脫細(xì)胞片中殘留脂滴，再由高濃度酒精至低濃度酒精（100%、90%和70%）依次至ddH20,然后用

0.01mol/LPH

7.4PBS孵育細(xì)胞片

5.枯燥細(xì)胞片后，在37℃濕盒內(nèi)用

0.1%胃蛋白酶（用O.1NHCI配制）通透細(xì)胞片20min留意事項(xiàng)為有效防止外源性RNA酶的污染，顯微載玻片、蓋玻片和哺育皿分離參考有關(guān)要求作浸泡、清洗、枯燥和用鋁箔紙包裹后烘烤滅RNA酶處理

（二）原位雜交

1.選用適合DNA標(biāo)記的地高辛等標(biāo)記物，并參考地高辛標(biāo)記手冊

2.準(zhǔn)備雜交液（60%去離子甲酰胺、300mmol/LNaCI、30mmol/L檸檬酸鈉、10mmol/LEDTA、25mmol/LNaH2PO4（PH

7.4）＞5%葡聚酸和250ng/pl剪切的鮮魚.精子DNAo

3.在雜交前將標(biāo)記的cDNA探針在80℃中短暫復(fù)性，然后參與雜交液，其濃度為5ng/mlo

4.滴加lOpI雜交混合液（雜交液加探針）于細(xì)胞片，置37℃濕盒內(nèi)雜交16小時

（三）雜交后洗脫

1.雜交后在常溫下，用60%甲酰胺，300mmol/LNaCI和30mmol/L檸檬鈉，沖洗漂洗細(xì)胞片

2.用37℃上述溶液振蕩漂洗細(xì)胞片3xlmino

3.用

0.01mol/LPH

7.4PBS漂洗細(xì)胞片lx5min四免疫熒光檢測

1.滴力口封閉緩沖液100mmol/LTris-HCIPH

7.

5、150mmol/LNaCK2%BSA置37℃濕盒內(nèi)30min,以封閉非特異性結(jié)合部位

2.瀝干細(xì)胞片，滴加抗地高辛抗體1:

200、1:500用封閉緩沖液配制在37℃內(nèi)45min3,用BufferAPH

7.5100mmol/LTris-HCk150mmol/LNaCI、

0.05%Tween20沖洗漂洗各5min

4.由低濃度至高濃度70%,90%,100%各級酒精梯度脫水各5mino

5.空氣中枯燥細(xì)胞片

6.滴加甘油顯色混合液留意事項(xiàng)甘油顯色混合液的配制:9份甘油比1份lmol/LTris-HCIPH

7.5,2%

1.4-diaza-bicyclo-[

2.

2.2]-octaneDABCO和DNA復(fù)染劑或碘化丙咤PropidiumiodidePI500ng/ml或DAPI75ng/ml

7.在熒光顯微鏡下觀察NA探針和人工合成寡核甘酸探針

1.單鏈cDNA探針因?yàn)閏DNA中不存在內(nèi)含子及另外高度重復(fù)序列，又抑制了雙鏈cDNA探針在雜交反響中兩條鏈之間復(fù)性的缺點(diǎn)，從而提升了雜交反響的敏感性但因?yàn)閱捂渃DNA探針的制備比較困難，在RNA原位雜交中已很少見有應(yīng)用

2.CRNA探針是以cDNA為模板，利用體外轉(zhuǎn)錄而得到的因?yàn)樗且环N單鏈探針，因此也避免了應(yīng)用雙鏈cDNA探針做雜交反響時存在的兩條之間的復(fù)性問題CRNA與RNA之間形成的雜交體要比CDNA-RNA雜交體穩(wěn)定CRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響因此雜交反響后可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針因?yàn)镃RNA探針具有以上這些優(yōu)點(diǎn)，CRNA探針的雜交飽和水平又比雙鏈DNA探針高出8倍，因此在原位雜交中應(yīng)用廣泛CRNA探針的缺點(diǎn)是探針的制備過程比較容易，需要較好的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，它對RNA酶敏感，易受破壞，操作中要防范RNA酶污染

3.寡核甘酸探針人工合成的寡核首探針是以核甘酸為原料，利用DNA合成儀合成，避開了真核細(xì)胞中存在的高度重復(fù)序列帶來的不利影響因?yàn)榇蠖鄶?shù)寡核甘酸序列較短，不需要純化，組織穿透性極好按照目的基因的特異性序列設(shè)計的探針，特異性較強(qiáng)合成的寡核甘酸探針的缺點(diǎn)是探針長度必須相宜，探針太長可造成內(nèi)部錯誤配對雜交，探針太短可形成非特異性結(jié)合它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標(biāo)記物少，敏感性較低依標(biāo)記物不同，探針又可分為同位素標(biāo)記探針和非同位素標(biāo)記探針兩大類前者主要包括3H、35C、32P和1251等，不同的同位素探針其穿透力，定位和半衰期各不一樣，無一種同位素探針具有穿透力強(qiáng)、定位好和半衰期長所有優(yōu)點(diǎn)因?yàn)榘胨ニ苟?，性能不穩(wěn)定，污染環(huán)境和危害安康等原因，在RNA原位雜交中應(yīng)用同位素標(biāo)記探針已日趨減少，而非同位素標(biāo)記探針在近年來獲得迅速發(fā)展，其標(biāo)記物主要有生物素、地高辛、酶和熒光標(biāo)記等其中地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核甘酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還抑制了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn)，其應(yīng)用越來越廣泛

（二）探針的標(biāo)記在RNA原位雜交中，不僅要挑選適當(dāng)?shù)奶结槪疫€要使探針獲得有效的標(biāo)記探針標(biāo)記法有酶反響法和化學(xué)反響法

1.酶反響法用于RNA探針的酶反響法主要為末端標(biāo)記法與體外轉(zhuǎn)錄法末端標(biāo)記法是將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的5端或3”端的一種標(biāo)記法，末端標(biāo)記適用于合成寡核甘酸探針的標(biāo)記，用末端標(biāo)記制備的探針普通攜帶的標(biāo)記分子較少

2.體外轉(zhuǎn)錄法體外轉(zhuǎn)錄法是一種制備與克隆片段序列一樣的單鏈RNA探針的辦法舉行體外轉(zhuǎn)錄時，先將靶核甘酸序列克隆到含噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子的載體中，然后在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板，以含有標(biāo)記的三磷酸甘為原料，對啟動子下游的序列發(fā)展轉(zhuǎn)錄，而啟動子本身并不被轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄常用噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子，如沙門氏菌噬菌體和大腸桿菌噬菌體T

3、T7o當(dāng)兩個不同的噬菌體轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)合在載體多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶在插入序列的下游將質(zhì)粒線性化SP6噬菌體的RNA聚合酶對SP6啟動子序列具有高度的親和性，從而啟動下游的轉(zhuǎn)錄，在4種三磷酸核糖核甘和相應(yīng)的噬菌體RNA聚合酶存在的條件下，即轉(zhuǎn)錄成RNAo如反響物中含有標(biāo)記的三磷酸核糖核甘，所有的RNA就被標(biāo)記依標(biāo)記物為同位素和非同位素，近年來非同位素標(biāo)記探針已有了極大的近步常用非同位素標(biāo)記技術(shù)有生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶和熒光素非同位素標(biāo)記法又可分為直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法是將標(biāo)記物直接結(jié)合到探針上，當(dāng)探針與組織內(nèi)相應(yīng)靶核甘酸結(jié)合后，即可顯色觀察這類標(biāo)記探針必須符合標(biāo)記物在雜交過程中不喪失，又不影響雜交反響為條件大量已發(fā)表的文獻(xiàn)說明，因?yàn)闄z出雜交信號受到多種因素制抑，只能限于靶RNA豐盛的細(xì)胞或組織中，RNA雜交對低拷貝的基因檢測不理想近年來間接標(biāo)記法獲得較快發(fā)展，先將標(biāo)記物結(jié)合在探針上，利用特異性抗體識別，由特異性抗體結(jié)合多種酶，對檢測的雜交信號作有放大，這一類標(biāo)記法已展現(xiàn)極好的發(fā)展前景

（三）探針的純化某些標(biāo)記探針必須經(jīng)純化前方可使用這是因?yàn)樵谔结槝?biāo)記過程中，反響液中仍存在一些未被結(jié)合到探針中去的剩余dNTP等小分子為將摻入并結(jié)合到cDNA、cRNA和標(biāo)記寡核甘酸與游離的標(biāo)記寡核甘酸分開，常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法發(fā)展純化乙醇沉淀法的原理是DNA可被乙醇沉淀，而未摻入DNA的dNTP則保存在上清液中，由此反復(fù)乙醇沉淀能將兩者分開核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的酚/氯仿抽提法的原理是交替使用酚、氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑，以增強(qiáng)去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的效果因?yàn)榉与m能有效地變性蛋白質(zhì)，但它不能徹低抑制RNA酶的活性，而且酚能溶解10-15%的水，從而溶解一局部ploy（A）RNAo為抑制這兩方面的局限，混合使用酚與氯仿，對于RNA提取，顯得越發(fā)重要，氯仿還能加速有機(jī)相與液相分層，去除植物色素和蔗糖

（四）雜交前準(zhǔn)備

1.載玻片和蓋玻片的處理為有效防止外源性RNA酶的污染，雜交用的載玻片和蓋玻片可按以下步驟處理將載玻片和蓋玻片分離浸泡在5%潔消精〔蘇洲吳縣化工二廠）中12小時，用35℃-40℃溫水中沖洗30min,再用雙蒸水漂洗3次，每次5min,室溫下枯燥切片后，在180℃烤箱內(nèi)烘烤4—6小時，蓋玻片可按近期內(nèi)所需量，用鋁箔紙包裹后烘烤后存放為防止組織或細(xì)胞標(biāo)本在雜交過程中漂起或脫落，載玻片應(yīng)涂以粘附劑，大的冰凍或石蠟切片建議用明膠粘附劑，活檢或較小的標(biāo)本建議用多聚左旋賴氨酸或硅烷粘附劑

2.明膠涂片制備取10克明膠（Merck）溶于1000毫升40℃-50℃雙蒸水中，待明膠徹低溶解后參與4毫升25%硫酸銘鉀溶液（chromiumpotassiumsulfateCPS）,使CPS的終濃度為

0.1%O將烘烤后的載玻片浸泡在明膠溶液中l(wèi)Omin,在室溫下枯燥玻片再將載玻片浸泡在含有1%多聚甲醛，PH

7.4的PBS溶液中l(wèi)Omin；在室溫下枯燥玻片后再將載玻片浸泡在含有1%多聚甲醛，PH

7.4的PBS中10min,在室溫下枯燥玻片60℃烤箱內(nèi)過夜備用

3.多聚左旋賴氨酸涂片的制備取2-4mg多聚左旋賴氨酸（Sigma）,分子量在300000以上，溶于1ml消毒去離子水中經(jīng)旋渦器反復(fù)攪拌，吸取20—303滴加到玻片一側(cè)，再取另一張載玻片復(fù)合，將賴氨酸溶液勻稱涂抹在裱組織切片處，并將涂有粘附劑的一面用鉆筆標(biāo)出，室溫下枯燥切片后，在6烤箱內(nèi)過夜備用

4.硅烷涂片的制備取5毫升氨基丙基三乙氧基硅烷3-aminopropyltriethoxysilaneAPESSigma溶于250ml丙酮內(nèi)將烘烤后的載玻片浸泡硅烷溶液中60min,用雙蒸水漂洗2次，每次10min枯燥玻片后，60℃烤箱內(nèi)過夜備用留意事項(xiàng)載玻片的粘附劑及涂片制備，以組織切片或細(xì)胞不脫落，不干擾雜交信號，低背景，經(jīng)濟(jì)及制備方便為原則，在制備過程中，需戴一次性手套及口罩，防止手指皮膚上的RNA酶的污染多聚左旋賴氨酸溶液的溶度可按實(shí)際應(yīng)用效果調(diào)節(jié)，并應(yīng)留意有效期限，制備載玻片應(yīng)盡快使用，防止賴氨酸解聚而失效

5.穎標(biāo)本的儲存和冰凍切片制備為RNA原位雜交作穎標(biāo)本儲存和冰凍切片過程中，應(yīng)嚴(yán)防RNA酶的污染，制備過程中所使用的容器、刀具等均經(jīng)高壓消毒或清潔后用

0.1%焦碳酸二乙酯DiethylpyrocarbonateDEPC水清洗為防止RNA迅速降解，標(biāo)本離體后，先切成

1.5x

1.2cm大小，其厚度不超過

0.2cm,應(yīng)迅速投入4%多聚甲醛溶液內(nèi)，置4℃冰箱內(nèi)2-4小時再將組織移入30%蔗糖PBS溶液內(nèi)，4℃冰箱內(nèi)過夜次日可將標(biāo)本儲存于-80C或-140C超低溫冰箱內(nèi)保存如作冰凍切片，先將組織在-20C恒冷切片機(jī)內(nèi)停歇，待溫度升高后，然后在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切成7pm薄片40℃烤箱內(nèi)枯燥切片2小時后儲存在-80℃或-140C超低溫冰箱內(nèi)備用

6.標(biāo)本的固定和石蠟切片的制備石蠟切片作RNA原位雜交的，也應(yīng)嚴(yán)防RNA酶的污染、容器、刀具等去除RNA酶的過程同冰凍切片為防止RNA迅速降解，離體后標(biāo)本應(yīng)馬上有效固定為保存良好組織構(gòu)造，有利探針的穿透力，應(yīng)選用相宜的固定劑常用的化學(xué)固定劑可分為，沉淀固定劑和交聯(lián)固定劑兩類前者有乙醇，甲醇和丙酮等，后者有多聚甲醛，甲醛和戊二醛等經(jīng)沉淀固定劑固定的組織通透性較好，利于探針穿入，但過長時光固定，可引起RNA降解其缺乏之處是組織形態(tài)構(gòu)造的保持不如交聯(lián)固定劑交聯(lián)固定劑能較好保存組織中RNA和組織形態(tài)構(gòu)造，但固定時光過長，也可發(fā)生胞漿和胞核內(nèi)大分子化合物形成交聯(lián)，影響探針的穿透力，妨礙雜交體的形成4%多聚甲醛固定液取4g多聚甲醛和

0.25g甘氨酸分離溶于100ml

0.01mol/LPH

7.0PBS溶液，組織在常溫下浸泡于4%多聚甲醛中4小時，每1小時將組織在真空下吸干10min,再注入的固定液，共4次然后用

0.01mol/LPH

7.0的PBS漂洗2次，每次30mino福爾馬林醋酸固定液福爾馬林醋酸固定液由50%酒精、10%福爾馬林和5%醋酸組成在常溫下將組織浸泡4小時，每1小時在真空下吸干10分鐘，再注入的固定液，共4次，然后用50%酒精漂洗2次，每次30mino五雜交前探針的挑選

1.RNA探針RNA探針的長度以50-150堿基為佳，探針易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時光短長500個堿基的探針雜交時光約需20個小時左右，如超過500個堿基的RNA探針則在雜交前用有限堿基水解法把握其長度1孵育時光t=Lf-Lo/KxLoxLf1_=核酸探針原長度kb,Lf=核酸探針?biāo)夂笏栝L度kb,K是常數(shù)率=

0.llkb/min2在室溫中參與以下試劑終止水解3moi/L醋酸鈉，6,63終濃度

0.lmol/L,醋酸

1.33終濃度為0?5%3參與以下試劑沉淀探針7moi/L醋酸鏤1003，100%乙醇7503，RNA10mg/ml2|jl,置-20℃2小時后恢復(fù)到室溫，在1400rpm離心30min4留神將乙醇倒出，待試管內(nèi)枯燥后再用無菌ddH20稀釋到lOng/3濃度5終于探針長度可于10%聚丙稀酰胺凝膠在60℃的尿素中電泳檢測2,探針的長度原位雜交反響中探針濃度應(yīng)超過靶序列的濃度，探針濃度必須賜予該實(shí)驗(yàn)最大信噪比，因?yàn)楸尘爸雀叩团c探針濃度有關(guān)最正確探針濃度是最低探針濃度到達(dá)靶核酸的最大飽和結(jié)合度為目的探針濃度按其種類而略有不同，發(fā)射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為

0.5ng/pl,而非發(fā)射性標(biāo)記cRNA探針的濃度l.Ong/plo雜交液的量要適當(dāng)，每張切片以30-503為宜保持雜交液不流失的關(guān)鍵是，載玻片的清潔處理必須徹底，應(yīng)用雜交罩等也很須要

3.雜交的溫度和時光設(shè)置和調(diào)節(jié)雜交溫度是RNA原位雜交的重要環(huán)節(jié)雜交溫度應(yīng)低于解鏈或融解溫度meltingtemperatureTm20-30℃o多數(shù)RNA原位雜交Tm為95℃,因?yàn)檫@一溫度對保存組織形態(tài)完整和組織切片的粘附將產(chǎn)生不利影響，為此在雜交液中常以增強(qiáng)甲酰胺濃度來降低Tm值，因?yàn)槊吭鰪?qiáng)1%甲酰胺濃度可降低

0.72℃其它雜交體中GC的百分比，雜交體長度以及雜交液中Na+的濃度也與Tm呈正相關(guān)雜交反響的時光可隨探針濃度的增強(qiáng)而縮短，雜交時光過短會造成雜交不徹低，雜交時光過長會增強(qiáng)非特異性著色普通RNA原位雜交承受雜交孵育過夜，在黑暗環(huán)境下發(fā)展，能夠避免光芒對甲酰胺的電離作用

三、cRNA探針檢測組織切片中的RNA原位雜交一組織的前處理

1.冰凍切片的制備1離體后組織應(yīng)切成

1.5x1,2cm,厚度為

0.2cm02馬上投入4%多聚甲醛溶液中PBS配制，4℃下固定2-4小時3倒去固定液后，參與30%蔗糖溶液PBS配制，4℃下過夜，次日將組織塊儲存在-80C或-140C超低溫冰箱內(nèi)4或?qū)⒔M織塊置于-20C恒冷切片機(jī)內(nèi)切成lOtJm薄片，粘附于涂有粘附劑的載玻片上置室溫下，置40℃恒溫箱內(nèi)過夜，或置40℃恒溫箱內(nèi)至少2小時，后將切片放入切片盒在-80℃超低溫冰箱內(nèi)存放備用

2.組織的固定和石蠟切片的制備1離體后組織切成不大于l.5x

1.2cm,厚

0.2cmo2馬上投入4%多聚甲醛溶液內(nèi)PBS配制，或

2.5%戊二醛，在室溫下固定3-4小時3用PBS沖洗，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透亮和浸蠟包埋切片4切成5pm薄片粘附于涂有粘附劑的載玻片上，在40℃恒溫箱內(nèi)過夜枯燥切片，用的二甲苯脫蠟2x1Omin和100%、95%、70%、各級酒精lx5min,ddH20漂洗2x5min留意事項(xiàng)1切除的穎標(biāo)本應(yīng)馬上作組織固定或低溫儲存，以免mRNA降解2標(biāo)本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片，這一制備法既能避免mRNA降解，又能保持良好的組織形態(tài)3對外檢病例中，承受10%福爾馬林固定標(biāo)本的，為利于mRNA檢測，固定時光不要超過36小時，以免引起RNA與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)4在冰凍切片和石蠟切片制作過程中，所使用的容器、器械都要經(jīng)高壓消毒，或清潔后用

0.1%DEPC水清洗，再經(jīng)ddH20沖洗，避免外源性RNA酶污染二RNA探針的標(biāo)記RNA探針的制備需將CDNA探針克隆到帶有RNA多聚酶啟動子的質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)錄制成RNA探針用EDTA緩沖液和DEPC處理的ddH20將會影響RNA多聚酶中的質(zhì)粒RNA探針的長度應(yīng)500bp,500bp的探針不易與mRNA形成雜交體對探針標(biāo)記、預(yù)雜交、雜交和后雜交流程中使用的容器、ddH20均需經(jīng)

0.1%DEPC處理，為避免RNA酶污染，操作人員必須戴手套和口罩操作RNA探針的純化

①在雜交探針中參與5310%乙酸aceticacid,llpl3mol/L醋酸納PH

6.0,lpllOmg/mltRNA,

1.2pllmol/LMgCI2,300|jl冷酒精

②在-20℃孵育4-16小時

③在4℃下15min,使RNA發(fā)生沉淀

④真空下枯燥RNA沉淀物

⑤用DEPC處理的ddH20含標(biāo)記的RNA探針10—50|jg/mlRNA探針的水解按以下辦法減少探針長度為近200bp,在Microcentrifuge管內(nèi)參與50plRNA探針標(biāo)記液，參力口30|jl200mmol/LNa2CO3和203200mmol/LNaHCo3將雜交探針置于60℃條件下，按以下辦法計算水解時光，t=fLO-Lf/K.LO.LfL0=RNA探針原長度kb,Lf=RNA探針?biāo)夂笏栝L度，K=常數(shù)率K=O.llkb/min,t=水解時光三預(yù)雜交1切片用DEPC處理的PBSPH

7.4140mmol/LNaCI,

2.7mmolKCI,10mmol/LNa2HPO4,

1.8mmol/LKH2PO4孵育2x5min,再用DEPC處理的含lOOmmol/L昔氨酸GlycinePBS孵育切片2x5min02用DEPC處理的含

0.3%TritonX-100PBS孵育15min3用DEPC處理的PBS漂洗2x5min4冰凍切片用TE緩沖液1OOmmol/LTris-HCl,50mmol/LEDTAPH

8.0不含RNA酶的lpg/ml蛋白酶K,在37℃下通透切片30mino石蠟切片用TE緩沖液配制的不含RNA酶的5-20|jg/ml蛋白酶K,在37℃下通透切片30mino5在4℃下用DEPC處理的4%多聚甲醛PBS溶液作后固定5min6再用DEPC處理的PBS沖洗切片2x5mino7切片作酸酎處理，處理液含

0.25醋酸酎、

0.lmol/L三乙醇胺TriethanolamineTEAPH

8.0,振蕩漂洗2x5min8在37℃孵育切片后，雜交緩沖液沖洗〔含50%去離子甲酰胺的4xSSC,至少10min留意事項(xiàng)1切片的通透化是RNA原位雜交關(guān)鍵步驟，特殊對回憶性資料尤為重要，因固定液種類和固定時光的不同，需作最正確通透化條件探索，包括蛋白酶K濃度，孵育時光20-30min之間調(diào)節(jié)，甚至承受

0.2mol/LHCL配制的

0.1%胃蛋白酶2因?yàn)榇姿狒鼧O不穩(wěn)定，宜將醋酸酎在使用前加到TEA緩沖液中3lxSSC=150mmol/LNaCI,15mmol/LsodiumcitratepH

7.2o四原位雜交1雜交液40%去離子甲酰胺、10%葡聚糖、lxDenhardt,zs、

0.02%FicolK

0.02%聚乙烯毗咯烷酮polyvinylpyrrolidone、10mg/ml去RNA酶的牛血清、4xSSC10mmol/LDTT、lmg/ml變性的剪切鮮魚精子DNA的準(zhǔn)備2瀝干后用雜交緩沖液漂洗，并沿組織周邊擦干，每張切片滴加30|jl探針雜交液內(nèi)含5-10ng非同位素標(biāo)記cRNA探針3用24x30mm雜交罩hydrophobicplasticcoverslip復(fù)蓋雜交組織4置42℃濕盒內(nèi)過夜留意事項(xiàng)雜交液應(yīng)配制，并在-2CTC下儲存，配制雜交液能使用幾個月五雜交后處理1揭去雜交罩將切片浸泡于2xSSC中5-lOmino2在37℃用2xSSC2xl5min、lxSSC2xl5min振蕩漂洗3為消除未雜交單股cRNA探針，在37℃含RNA酶A的NTE緩沖液500mmol/LNaCI,10mmol/LTris,lmmol/LEDTA,PH8?0中漂洗30mino4置37c用O.lxSSC振蕩漂洗2x30mino留意事項(xiàng)在同一容器中不能同時放入含不同探針切片2假設(shè)雜交的背景較高，非特異性信號較多，可承受52℃含5%甲酰胺的2xSSC洗脫六雜交后顯色1用BufferAPH

7.5100mmol/LTris-Hcl,150mmol/LNaCI振蕩漂洗切片2x10min2每張切片滴加封閉液403含

0.1%TritonX-100和2%正常羊血清的BufferAPH

7.53抖去封閉液，每張切片加羊抗地高辛抗體AKP結(jié)合物303BufferA內(nèi)含

0.1%TritonX-100,1%正常羊血清，羊抗地高辛抗體AKP結(jié)合物在溫盒內(nèi)2小時4用BufferA振蕩漂洗切片2xl0mino5用BufferBPH

9.5100mmol/LTns-Hclz100mmol/LNaCI,50mmol/LMgCI2孵育切片10min6顯色液配制用10mlBufferBPH

9.5,內(nèi)含45pl硝基四氮噗藍(lán)NitrobluetetrazoliumNBT75mg/mlNBT,70%二甲基甲酰胺，35pl5一漠一4一氯一3一口引咪基一磷酸鹽5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphateBCIP或X-Phosphate50mgX-Phosphate/ml,100%二甲基甲酰胺7每張切片200|jl顯色液，在黑暗條件下顯色2-24小時8顯色滿足后用BufferCPH

8.110mmol/LTris-Hcl,lmmol/LEDTA沖洗漂洗切片9ddH2O中止反響10用

0.02%亮綠或

0.1%核固紅復(fù)染細(xì)胞核11用自來水洗2xl0min12用即用型GvaMount水溶性封片劑封片留意事項(xiàng)1顯色液的配制10mlBufferBPH

9.5溶液中含有453NBT70%二甲基甲酰胺中含有75mg/lmlNBT〕，353BCIP或X-磷酸鹽100%二甲基甲酰胺中含有50mg/mlX-磷酸鹽，lmmol/L左旋咪噗levamisole

2.4mg/10ml左旋咪噗Sigma2抗地高辛抗體一AKP的最正確濃度探索可承受同一雜交切片，用1:

100、1:500和1:1000抗體濃度比較之3假設(shè)顯色液中用lmmol/L左旋咪睫的濃度，照舊覺察內(nèi)源性磷酸脂的活性較高〔背景色，左旋咪睡的濃度能夠增強(qiáng)到5mmol/Lo4NBT/BCIP顯色液后雜交切片，不能用二甲苯透亮和溶二甲苯的封片劑5滴加雜交液和顯色液應(yīng)防止流失，除標(biāo)記切片放平坦之外，很重要的原因之一與載玻片的清潔度有關(guān)用DAKO魔筆沿組織四面劃圈，在雜交反響中既可省略雜交罩、又可在顯色反響中防止反響液外溢

四、用寡核甘酸探針檢測組織切片中的RNA原位雜交用寡核甘酸探針檢測組織切片中相關(guān)的mRNA靶核甘酸是較為常見的RNA原位雜交這是因?yàn)楣押烁仕崽结槻粌H具有能按靶核甘酸序列設(shè)計與特定的靶基因結(jié)合，而且以核甘酸為原料利用DNA合成儀合成寡核甘酸探針辦法簡便，探針普通較短組織穿透性好，無須進(jìn)一步純化等優(yōu)點(diǎn)外，而且易于在組織切片內(nèi)檢測靶mRNA的一種理想的原位雜交探針運(yùn)用生物素及地高辛標(biāo)記的寡核甘酸探針，對17例穎乳腺癌組織分離作了RNA原位雜交和Northern雜交冰凍切片中RNA原位雜交，ERmRNA陽性率

64.6%11/17,PRmRNA為

58.9%10/17,而Northern雜交中ERmRNA陽性率為76?5%13/

17、PRmRNA陽性率為

64.7%11/17O上述兩種雜交中ERmRNA陽性、陰性符合率分離為

58.7%和

17.7%,PRmRNA為

47.1%和

23.5%在此根底上還對278例乳腺癌分離作了RNA原位雜交和免疫組化比照檢測石蠟切片中RNA原位雜交，ERmRNA、PRmRNA的陽性率分離為

67.3%和

61.9%,高于同一組織切片中免疫組化的ER

52.9%和PR的

41.8%,ERmRNA、PRmRNA的陰性率為

32.7%和

38.1%,又低于同一組織切片中免疫組化的ER

47.1%和

58.2%ERmRNA與ER的陽性及陰性符合率分離為

48.6%和

28.1%,ERmRNA陽性而ER陰性的占

18.7%,ERmRNA陰性而ER陽性的僅占

4.3%PRmRNA與PR的陽性及陰性符合率分離為

39.6%、

35.9%,PRmRNA陽性的而PR陰性的占

22.3%,PRmRNA陰