微生物限度檢測(cè)方法驗(yàn)證操作規(guī)程2015年版

微生物限度檢測(cè)方法驗(yàn)證操作規(guī)程1目的確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物限度檢測(cè)。2依據(jù)《中國(guó)藥典》2015版。3范圍所有需進(jìn)行微生物限度檢測(cè)的產(chǎn)品。4責(zé)任驗(yàn)證小組負(fù)責(zé)檢驗(yàn)方法驗(yàn)證/確認(rèn)方案的起草、驗(yàn)證/確認(rèn)方案的實(shí)施。驗(yàn)證委員會(huì)負(fù)責(zé)驗(yàn)證/確認(rèn)方案的審批，驗(yàn)證/確認(rèn)結(jié)論的審核。5程序由驗(yàn)證小組提出驗(yàn)證申請(qǐng)，驗(yàn)證方案編制完成后，填寫《確認(rèn)和驗(yàn)證方案審批表》，經(jīng)驗(yàn)證小組會(huì)簽，報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)審核，由生產(chǎn)負(fù)責(zé)人和質(zhì)量負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)后，驗(yàn)證方案編制人對(duì)驗(yàn)證小組其余人員進(jìn)行培訓(xùn)后，方可按驗(yàn)證方案試驗(yàn)。試驗(yàn)完成后及時(shí)編制驗(yàn)證報(bào)告，并填寫《驗(yàn)證報(bào)告審批表》，經(jīng)驗(yàn)證小組會(huì)簽，報(bào)驗(yàn)證委員會(huì)審核，由生產(chǎn)負(fù)責(zé)人和質(zhì)量負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)后，驗(yàn)證報(bào)告結(jié)論才可實(shí)施。6內(nèi)容概述通過(guò)驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定及控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方案進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行產(chǎn)品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證驗(yàn)證用菌株銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽抱桿菌[CMCC（B）63501]黑曲霉[CMCC（F）98003]白色念珠菌[CMCC（F）98001]驗(yàn)證用菌液制備接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽抱桿菌至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，于30?35℃培養(yǎng)18?24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物各1ml,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液，備用。接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于20?25℃培養(yǎng)2?3天。取上述培養(yǎng)物1ml,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液，備用。接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于20?25℃培養(yǎng)5?7天，加入含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，將抱子洗脫。然后，用適宜方法吸出抱子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液或pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的抱子懸液，備用。6.2.3供試液的制備水溶性供試試品取供試品，用PH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1：10供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1：10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液pH值至6?8。必要時(shí)，用一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。油脂類供試品取供試品，加入無(wú)菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯80或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過(guò)40℃(特殊情況下，最多不超過(guò)45℃),小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋液使成1：10供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進(jìn)一步10倍系列稀釋。腸溶制劑供試品取供試品108，加入pH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液，置45℃水浴中，振搖，使溶解，制成1：10的供試液。必要時(shí)，用一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。試驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于100cfu。供試品對(duì)照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)?？咕钚缘娜コ驕缁罟┰囈航臃N后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌落數(shù)值的50%,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表1）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無(wú)毒性。中和劑或滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)。表1 常見(jiàn)干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊一醛、汞制劑亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸聚山梨酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA、喹喏酮類抗生素鎂或鈣離子磺胺類對(duì)氨基苯甲酸P-內(nèi)酰胺類抗生素P-內(nèi)酰胺酶采用薄膜過(guò)濾法。上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒(méi)有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有較強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒(méi)有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行供試品檢查。供試品中微生物的回收計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法或MPN法。平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿，從算術(shù)平均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液1ml,置直徑90mm的無(wú)菌平皿可，注入15?20ml溫度不超過(guò)45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)培養(yǎng)加。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法取15?20ml溫度不超過(guò)45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.^1。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45Rm,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。供試品及其溶劑應(yīng)不影響濾膜材質(zhì)對(duì)微生物的截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過(guò)濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率，應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，總沖洗量不得超過(guò)1000m1，以避免薄膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過(guò)濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。MPN法MPN法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過(guò)濾法和平皿法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒(méi)有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用霉菌計(jì)數(shù)。若使用MPN法，按下列步驟進(jìn)行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個(gè)連續(xù)稀級(jí)，每一稀釋級(jí)取3份1ml分別接種至3管裝有9?10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30?35℃培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長(zhǎng)情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)1?2天，觀察是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)從表2查被測(cè)供試品每1g或1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表2微生物最可能數(shù)檢索表生長(zhǎng)管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000〈309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320

(或ml)、0.001g(或ml)和0.0001g(或ml)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增加10倍，其余類推。6.2.7結(jié)果判斷計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過(guò)濾法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值在0.5?2范圍內(nèi);采用MPN法時(shí)，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。6.3控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌[CMCC(B)44102]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]沙門菌[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]白色念珠菌[CMCC(F)98001]菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30℃?35℃培養(yǎng)18?24小時(shí)；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20℃?25℃培養(yǎng)2?3天，上述培養(yǎng)物用pH7.0無(wú)菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2℃?8℃,可在24小時(shí)內(nèi)使用。供試液的制備（同6.2.3）驗(yàn)證方法試驗(yàn)組試驗(yàn)菌根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí)，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。常規(guī)法取規(guī)定量的供試液和不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中，按《微生物限度檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》中控制菌的檢查法進(jìn)行檢查。培養(yǎng)基稀釋法供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由于容器體積限制，一般不超過(guò)1000ml。薄膜過(guò)濾法采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。每張濾膜每次沖洗量為100ml,總沖洗量不得超過(guò)1000m1,以避免濾膜上的微生物受損傷。中和法在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對(duì)微生物亦無(wú)毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。陽(yáng)性對(duì)照組取不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中，按《微生物限度檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》中控制菌的檢查法進(jìn)行檢查。陰性對(duì)照組取相應(yīng)的稀釋液替代供試液，按《微生物限度檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》中控制菌的檢查法進(jìn)行檢查。結(jié)果判斷在試驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照