丙型肝炎檢測

關于丙型肝炎檢測第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日目前丙型肝炎檢測;

一、HCV抗體檢測二、HCV抗原檢測三、HCV核酸檢測四、HCV基因型檢測五、HCV細胞培養(yǎng)第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日丙型肝炎病毒抗體檢測第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、抗-HCV檢測的目的意義1、抗-HCV檢測可用于診斷、血液篩查、流行病監(jiān)測等。2、以診斷為目的的檢測是為了確定個體HCV感染狀況。3、以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HCV，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。4、以流行病監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HCV感染率及其變化趨勢，包括各類高危人群、重點人群和一般人群。第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、抗-HCV檢測的方法抗-HCV檢測分為篩查試驗（酶聯(lián)免疫吸附試驗、膠體金法快速試驗、化學發(fā)光試驗、免疫熒光試驗）和補充試驗（免疫印跡試驗）。第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日（一）篩查試驗1、抗-HCV酶聯(lián)免疫吸附試驗間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗是抗-HCV檢測常用的篩查方法。其基本原理是以HCV抗原包被固相載體，用辣根過氧化物酶標記的抗人IgG與被檢樣品中的抗-HCV反應，以鄰苯二胺（OPD）或3，3‘，5，5’—四甲基聯(lián)苯胺（TMB）等底物顯色后，利用酶標儀等儀器進行陰陽性結果判斷。其主要反應過程如下：加入經(jīng)樣本稀釋液稀釋的被檢樣品，樣品中的抗-HCV與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物；固相載體上只留下抗-HCV，其他免疫球蛋白及樣品中的雜質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去；加酶標抗抗體與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶；洗滌后，固相載體上的酶量就顯示特異性抗體的量；加底物顯色及終止液，利用酶標儀等儀器分析結果。第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日2、化學發(fā)光試驗

化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是將具有高度敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術?；瘜W發(fā)光免疫分析法以標記方法的不同而分為兩種：（1）化學發(fā)光標記免疫分析法：化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析（CLIA)，是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析法。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物，是有效的發(fā)光標記物，通過起動發(fā)光試劑作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內完成，為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無須催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子的結合不會減少所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日（2）化學發(fā)光酶免疫分析法：從標記免疫分析角度，化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA)應屬酶免疫分析，只是反應的底物是發(fā)光劑，操作步驟與ELISA分析完全相同。以酶標記生物活性物質（如酶標記的抗原或抗體）進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。該方法又分為如下幾類：①HRP（辣根過氧化物酶）標記的CLEIA：常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾。是一類重要的發(fā)光試劑。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧（過氧化陰離子O2-，單線態(tài)氧O2，羥自由基OH-，過氧化氫H2O2)存在下生成激發(fā)態(tài)中間體，當其回到基態(tài)時發(fā)光，其波長為425nm。早期用魯米諾直接標記抗原或抗體，但標記后發(fā)光強度降低而使靈敏度收到影響。近來用過氧化物酶標記抗體，進行免疫反應后利用魯米諾作為發(fā)光底物，在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑（NaOH2H2O2）作用下，魯米諾發(fā)光，發(fā)光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日②增強發(fā)光酶免疫分析（enhancedluminescenceenzymeimmunoassayELEIA）在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強發(fā)光劑以增強發(fā)光信號，并在較長時間內保持穩(wěn)定，便于重復測量，從而提高分析靈敏度和準確性。③ALP（辣根過氧化物酶）標記的CLEIA

所用底物為環(huán)1，22二氧乙烷衍生物，用于化學發(fā)光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩(wěn)定作用的基團—金剛烷基，其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團，在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光。

第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日3膠體金法快速試驗（1）免疫滲濾試驗：斑點免疫膠體金快速試驗以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原點狀固定在膜上，加待檢樣品。陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色斑點。反應時間在10分鐘以內。有效試驗的質控點必須顯色。（2）免疫層析試驗：以硝酸纖維膜為載體，HCV抗原線狀固定在膜上，待檢樣品沿著固相載體遷移，陽性結果在膜上抗原部位顯示出有色條帶。有效試驗的質控線必須顯色。第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）抗體補充試驗抗體補充試驗目前常用的為免疫印跡試驗。免疫印跡法試劑一般將HCV不同編碼區(qū)抗原多種成分噴涂在硝酸纖維薄膜條上，并設置了兩種不同濃度的人IgG對照帶和一條hSOD對照帶，用于內部對照和結果判斷。其診斷HCV感染的敏感性高、特異性強，可檢測針對HCV不同編碼區(qū)抗原的抗體，且不需要特殊的儀器設備。第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）抗-HCV檢測策略及結果報告1、疫情監(jiān)測相關的檢測策略及結果報告先用篩查試劑-1進行初篩試驗，結果呈陰性反應，報告“抗-HCV陰性”，不再進行復檢試驗；結果呈陽性反應，進入復檢試驗。所有初篩陽性反應的樣品使用篩查試劑-2進行復檢，結果呈陰性反應，報告“抗-HCV陰性”；結果呈陽性反應，報告“抗-HCV陽性”。第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日2、臨床診斷相關的檢測策略及結果報告⑴篩查試驗用篩查試劑進行初篩，結果成陰性反應，報告“抗-HCV陰性”；結果成陽性反應，不能出具陽性報告，必須進入復檢試驗。對初篩呈陽性反應的樣品用原有試劑雙孔或原有試劑加另一種不同原理（或廠家）試劑進行復檢試驗，如均呈陰性反應，報告“抗-HCV陰性”；如均呈陽性反應或一陰一陽反應，進行補充試驗。臨床診斷篩查檢測流程見圖4第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日(2)補充試驗⑴臨床診斷補充試驗方法-1

復檢試驗陽性反應樣品，進行免疫印跡試驗。結果陰性者，報告“抗-HCV陰性”；結果陽性者，報告“抗-HCV陽性”；結果不確定者，報告“抗-HCV不確定”，并進行隨訪。臨床診斷補充試驗檢測方法一流程見圖5。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日⑵臨床診斷補充試驗方法-2此方法僅限于檢測方法/試劑給出了特定閾值（與抗體補充試驗比較，其陽性的預測值≥95%）時使用。高S/CO比值：當S/CO比值≥特定的閾值時；低S/CO比值：其S/CO比值<特定的閾值。初篩和復檢第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日

初篩和復檢均為陽性，且有樣品OD值與臨界值（Cutoff）的比值（S/CO）≥試劑說明書中給出的特定閾值，可報告“抗-HCV陽性”，無需再做免疫印跡試驗；否則，還應進一步作免疫印跡試驗。免疫印跡試驗結果陽性者，報告“抗-HCV陽性”；結果不確定者，報告“抗-HCV不確定”并進行隨訪。第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日3、血液篩查相關的檢測策略及結果報告

獻血/漿員體檢合格后抽血檢驗。用抗體篩查試劑進行初篩，結果呈陽性反應，報告“抗-HCV陽性待查”，獻血/漿員暫停獻血，如果需要進一步診斷獻血/漿員感染狀況，執(zhí)行臨床診斷策略；結果呈陰性反應，報告“抗-HCV初篩陰性”，獻血/漿員獻血，進入復檢試驗。對初篩呈陰性反應的樣品用另一種抗體篩查試劑進行復檢試驗。如呈陰性反應，報告“抗-HCV陰性”，血液供應臨床；如呈陽性反應，則報告“抗-HCV陽性待查”，血液報廢，如果需要進一步診斷獻血/漿員感染狀況，執(zhí)行臨床診斷策略。

第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日4.檢測結果的解釋第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

丙型肝炎病毒抗原檢測㈠HCV抗原檢測的目的意義1、HCV血清陽轉前的早期急性丙型肝炎輔助診斷，尤其有助于HCV感染窗口期患者、抗-HCV檢測結果不確定患者或HCV陽性母親所生嬰兒是否罹患丙型肝炎的輔助診斷。2、免疫受損或先天性免疫缺陷群體如HIV感染者、長期透析的腎病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者等HCV感染的篩查。3、抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析。4、HCV感染者治療前后病毒血癥追蹤分析。第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）HCV抗原檢測的方法

目前抗原檢測ELISA試劑采用雙抗體夾心法定性或定量檢測樣品中游離的HCV核心抗原（包括抗原抗體復合物和游離核心抗原）?；驹恚阂曰蚬こ毯诵目乖庖咝∈蠛笏@得的純化抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為固相包被物，用與固相包被物有不同抗原決定簇的抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為辣根過氧化物酶標記物，與樣品中總的或游離的HCV核心抗原反應，OPD顯色后進行定性或定量測定。第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

大部分HCV抗原檢測試劑檢測的是樣品中游離核心抗原以及和抗-HCV結合的核心抗原，因此在進行檢測之前需要加入尿素、鹽酸及去垢劑等，以解離樣品中的核心抗原-核心抗體免疫復合物。其它操作程序與一般的ELISA或發(fā)光技術操作基本相同，即：第一步加入待測樣品，孵育后，洗去未結合的成分，加入酶標記或發(fā)光物質的抗核心抗原的二抗，孵育后顯色，再加入終止液終止顯色，用酶標儀比色計算s/co值，來進行陰性和陽性反應的判斷。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

將HCV抗原的標準物質稀釋成不同濃度的系列標準，還可進行HCV抗原的定量檢測。以橫坐標為HCV抗原的濃度（pg/ml），縱坐標為OD值，繪制出標準曲線。測出待測樣品的OD值以后，在標準曲線上查出抗原的濃度。如果待測樣品的OD值超出標準曲線上最高抗原濃度的OD值，則需用陰性血清將樣品稀釋以后再行檢測。第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三)檢測策略及結果報告

初次檢測抗原陰性樣品，報告為“HCV抗原陰性”；初次檢測抗原陽性反應樣品，需要雙孔復檢。如果雙孔復檢結果均為陰性，報告為“HCV抗原陰性”；如果雙孔檢測結果至少有一孔結果為陽性反應，則報告為“HCV抗原陽性”。第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

丙型肝炎病毒核酸檢測

（一）HCV核酸檢測的目的意義1、HCVRNA定性檢測可用于血液篩查領域，可使用單份樣品或多樣品集合的方法，對獻血員血液及單采血漿站的原料血漿進行核酸檢測，降低輸血殘余險度。2、HCVRNA定性檢測可用于對HCV抗體陰性的高危人群樣品進行集合核酸檢測，及時發(fā)現(xiàn)窗口期感染。3、HCVRNA定量檢測的意義主要體現(xiàn)在作為抗病毒治療療效的判斷指標，指導抗病毒治療及療效判定。第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（四）檢測結果的解釋1、陰性結果的解釋由于目前抗原檢測試劑的靈敏度較低，最靈敏的檢測試劑只能達到相當于500IU/ml水平的HCVRNA，因此陰性的結果并不能排除HCV現(xiàn)癥感染的可能。2、陽性結果的解釋現(xiàn)階段，HCV抗原陽性僅作為HCV感染的輔助診斷依據(jù)，不能據(jù)此確診。特別是對處于“灰區(qū)”的陽性結果，需要結合臨床表現(xiàn)及HCVRNA、抗-HCV等檢測結果來解釋。監(jiān)測病程進展或抗病毒治療效果應進行HCV抗原的定量檢測。第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（二）HCV核酸檢測的方法1、RT-PCR檢測技術傳統(tǒng)PCR定性檢測HCVRNA需要三個步驟：①對待測樣品進行處理：通過裂解、純化，提取樣品中的HCVRNA作為PCR擴增的模板；②采用逆轉錄PCR（RT-PCR）技術對提取到的HCVRNA進行擴增；③檢測PCR擴增產(chǎn)物，檢測方法包括凝膠電泳和PCR-酶聯(lián)免反應（PCR-ELISA）等。第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日2、TMA檢測技術TMA是一種利用MMLV逆轉錄酶和T7RNA聚合酶2種酶的共同作用，在等溫條件下來擴增RNA的反應系統(tǒng)。TMA使用的引物含有T7RNA聚合酶結合位點，使得反轉錄合成的cDNA可以作為T7RNA聚合酶的模板，在T7RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷貝。擴增出來的RNA重新進入TMA循環(huán)，成為下一輪復制的模板。TMA優(yōu)點在于特異性強、靈敏度高，反應條件簡單、擴增只需一個溫度，無需專門的熱循環(huán)儀器，且因整個反應在一個試管中進行，擴增產(chǎn)物RNA易于降解，從而大大減少了污染的可能。基于TMA技術的VERSANTHCVRNA定性檢測可檢測到極低水平的HCVRNA，甚至可低至5IU/ml。第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日3、實時熒光定量PCR技術

熒光定量PCR基于熒光共振能量轉移（Fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）的原理，當某個熒光基團的發(fā)射譜與另一熒光基團的吸收光譜發(fā)生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的熒光基團傳遞到長波長（低能量）的熒光基團，這個過程稱為FRET?；贔RET原理，出現(xiàn)了不同種類的熒光PCR，主要體現(xiàn)在探針設計的不同，如TaqMan探針、分子信標和熒光雜交探針。以目前我國應用最廣泛的TaqMan熒光標記探針的定量PCR為例，是在探針（probe）的兩端偶聯(lián)一個短波長的熒光基團（報告基團）和一個長波長的熒光淬滅基團，這兩個基團位置靠近，熒光基團不發(fā)熒光；Taq酶在發(fā)揮5'→3'方向聚合酶活性的同時，還具有5'→3'方向的外切酶活性，可使探針降解，熒光淬滅基團從而解離、遠離熒光基團，熒光基團發(fā)出熒光，熒光的強度與PCR產(chǎn)物的量相關，通過計算可得出具體的量值。第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

熒光定量PCR檢測HCVRNA的操作程序包括：RNA提取、PCR擴增、熒光檢測及結果分析。目前一般的熒光定量PCR儀都帶有相應的分析軟件，輔助設定閾值及Ct值，也允許操作者在合理的范圍內自行調整。一個良好的PCR反應反映到標準曲線上，就是標準曲線的相關性良好，（r2通常＞0.99），斜率（反映擴增的效率）在指定的范圍內。但采用外標法定量的試劑盒標準品擴增良好也不一定意味著樣品一定擴增良好，因為還涉及RNA提取質量的問題，因此特別要注意考察陽性質控和陰性質控的結果，陰性結果必須沒有擴增曲線，而陽性質控必須擴增曲線良好，結果落入指定的區(qū)間內。第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日4、b-DNA技術

分支DNA（bDNA）技術基于其獨特的信號放大系統(tǒng)，即bDNA信號放大系統(tǒng)，這是一個人工合成的bDNA，bDNA的分枝可結合多個酶標記物，從而將病毒的信號放大，以便進行檢測。利用序列特異的寡聚核苷酸探針雜交捕捉HCVRNA，HCVRNA隨后與支鏈DNA(bDNA）二級探針雜交，bDNA再與酶聯(lián)三級探針結合，隨后加入酶底物，產(chǎn)生的化學發(fā)光信號強度與靶DNA的量成正比。第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

操作程序包括：首先激昂血漿樣品離心，濃縮其中的病毒顆粒，HCVRNA釋放后加入微孔板中，板孔中包被有可與病毒載體特異結合的一系列靶探針，另一系列靶探針的一端可標記在游離的病毒核酸鏈上，另一端可與bDNA結合，加入酶標記物對結合的bDNA進行標記，經(jīng)過清洗后加入底物進行反應，測定反應強度。本方法定量系統(tǒng)中沒有內標記物，每次實驗設定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日（三）檢測策略及結果報告1、HCV核酸定性檢測用于血液篩查策略及結果報告對血液抗-HCV初篩呈陰性反應的樣品可用集合NAT（PoolingNAT）進行復檢試驗。如呈陽性反應，做單人份NAT檢測，陽性結果報告“陽性待查”，血液報廢，如果需要進一步診斷獻血/漿員感染狀況，執(zhí)行臨床診斷策略；如呈陰性反應，報告“HCV復檢陰性”，血液供應臨床。第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日2HCV核酸定性檢測用于臨床診斷策略及結果報告

抗-HCV復檢試驗陽性反應樣品，進行定性NAT試驗。結果陽性者，報告“HCV陽性”；定性NAT結果陰性的樣品，須做免疫印跡試驗確證。檢測流程見圖8。第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日3HCV核酸定量檢測用于臨床治療策略及結果報告

現(xiàn)階段對HCVRNA定量檢測的單位尚未完全統(tǒng)一，有的報告拷貝/ml，有的報告國際單位IU/ml，不同的試劑所用的標準不一樣，造成IU和拷貝之間的轉換系數(shù)不同。國產(chǎn)HCVRNA定量檢測試劑盒的檢測范圍一般在103~108拷貝/ml。

HCVRNA定量檢測報告單應該具備如下內容：檢測方法（如熒光定量PCR）、檢測試劑名稱、單位及檢測范圍。第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日

臨床樣品的結果報告可能有幾種情況：①結果在檢測范圍內，則按檢測的結果直接發(fā)報告，如每毫升3.2×105拷貝/ml（有的臨床實驗室表示為3.20E+05拷貝/ml）；②結果高于檢測上限，則應用HCV陰性的混合血漿（清）將樣本進行10~1000稀釋后再重新檢測，直到結果落入檢測范圍內；③樣本未出現(xiàn)擴增曲線，則應重新進行檢測，若在檢測限內，按照實際數(shù)發(fā)報告，若仍低于檢測下限，則報告為“低于檢測下限”。目前很多實驗室對這部分樣品不進行復檢就直接發(fā)出報告，會造成相當部分陽性樣品的漏檢。第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日

丙型肝炎病毒基因型檢測一、HCV基因型

1993年Simmonds等提出的分型方法得到了大多數(shù)學者的認同。Simmonds等分析不同毒株編碼非結構蛋白5（NS5）區(qū)域核苷酸序列的同源性，按照發(fā)現(xiàn)的先后將HCV主要分為1～6個型，每個型有若干亞型，以a，b，c等表示。這樣，HCV被分為6個型和70多個亞型。Simmonds分型方法對臨床慢性丙型肝炎的抗病毒治療具有重要指導意義，美國肝病學會、歐洲肝病學會、亞太肝病學會和中國制定的系列丙型肝炎防治指南都采用了該法進行分型。在我國，最主要的基因型為1b（66%），其次為2a（14%），還有其他較少見的型別，如西南地區(qū)的3型和廣東等地區(qū)的6型等。第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、HCV基因型檢測方法與試劑

傳統(tǒng)的HCV血清學分型與分子生物學分型相比，只有62.1%的符合率?，F(xiàn)階段檢測HCV基因型的分子生物學方法有限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、測序法及反向線性探針雜交法（reversehybridizationlineprobeassay，LiPA）等，目前商品化試劑盒所用的方法主要是后兩種。如Bayer的TrugeneHCV分型試劑盒和Inno-LiPAHCV基因分型2.0試劑盒。第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日

分型試劑的檢測靶位點主要集中于保守的5’端非編碼區(qū)，TrugeneHCV分型試劑直接對HCVRNA序列測定來分型，LiPA則是基于反向雜交原理——PCR擴增目的基因（擴增的DNA被生物素標記），與硝酸纖維膜上線形區(qū)帶上的寡核苷酸探針雜交，再加入標記有堿性磷酸酯酶的親和素，與雜交產(chǎn)物上標記的生物素結合，加入顯色底物NBT/BCIP孵育后，顯現(xiàn)紫色或棕色的條帶，不同的條帶組合對應不同的基因型。第四十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日

相比第一代產(chǎn)品，二代LiPAHCV增加了核心區(qū)序列，可準確地區(qū)分1a和1b型，并可避免東南亞地區(qū)和我國南部地區(qū)較常見的6c-6l型被誤分為l型，但仍約有8%的2a型易被lipa誤判為1a型，而這兩種型別的HCV感染的治療和預后均存在較大差異。需要注意，不論是Trugene還是Lipa，均要經(jīng)過PCR擴增，對HCV混合感染進行分型時，不可避免會因不同型別RNA擴增效率不一造成的劣勢擴增毒株的漏檢。第四十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、直接測序法HCV分型操作程序

隨著核酸測序技術的發(fā)展，直接測序分型成為目前具有推廣潛力的HCV基因型檢測方法。該方法需要對HCVRNA進行巢式PCR（nestedPCR）擴增，套式PCR是PCR衍生技術中最常用的方法，它使用兩對引物，進行兩次PCR反應，能夠極大地增加PCR擴增反應的敏感性和特異性。套式PCR第二次反應的引物（內引物）位于第一次PCR擴增區(qū)域內。外引物進行第一次PCR擴增后，將第一次PCR擴增產(chǎn)物轉移至第二次PCR反應管內，使用一對內引物進行第二次PCR擴增反應，最后用凝膠電泳鑒定擴增產(chǎn)物之后對擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收目的片段，然后測序。

第四十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日1、引物設計原則

除遵循PCR引物設計的一般原則以外，HCV分型主要考慮的是選擇哪一段基因序列進行分型才能獲得更高的分辨效率。臨床上用于HCV基因分型的方法有多種，最常用的是根據(jù)（5‵NCR）序列差異而進行的基因分型方法，如INNO-LiPA、5‵NCR序列的直接測序、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）-PCR等，但一基于5‵NCR的基因分型方法對不同亞型的分型準確率有較大的差異，對1b、1a、2a、2b、2c、3a亞型的分型準確率分別為76%、91%、20%、50%和96%，幾乎不能對4a和4c亞型進行區(qū)分，總準確率僅有76%，這與5‵NCR序列過于保守有關。因為同一基因型、不同亞型HCV5‵NCR序列的差異度僅為1.0%～3.3%，而NS5B基因序列的差異度為16.5%～20.1%，NS5B基因更適用于HCV的基因分型。第四十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日列舉常用的PCR引物：外側引物：5′-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA-3′(上游引物）

5'-GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3'（下游引物）擴增的片段長度為401bp內側引物：5'-CTCAACCGTCACTGAGAGAGACAT-3'（上游引物）

5'-G