檸檬酸發(fā)酵機(jī)制課件

第四章檸檬酸發(fā)酵機(jī)制

檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。

性質(zhì)：分子式C6H8O7，分子量192.12

有兩種形式水合物：100℃時(shí)融解，密度1.542g/cm3(18℃)

無水物：無色晶體或粉末，熔點(diǎn)153℃

有強(qiáng)酸味。溶于水、乙醇和乙醚

第四章檸檬酸發(fā)酵機(jī)制檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)1

用途：1）食品行業(yè)2）醫(yī)藥行業(yè)3）化工行業(yè)4）其它行業(yè)

檸檬酸的生產(chǎn)：1874年首次從檸檬汁中提出檸檬酸并結(jié)晶成固體；1913年首次實(shí)現(xiàn)利用黑曲霉發(fā)酵生成檸檬酸。用途：2一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途徑氧化脫羧羧化一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EM3

1953年，Jagnnathan等證實(shí)了黑曲霉中存在EMP途徑的所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖分解代謝中約80％走EMP途徑；

1958年，MeDomough等發(fā)現(xiàn)黑曲霉還存在HMP途徑的酶，但HMP途徑主要存在于孢子形成階段；1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在三羧酸循環(huán)；1953年，Jagnnathan等證實(shí)了黑4淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮5存在兩個(gè)CO2固定系統(tǒng)（需Mg2＋、K＋）：1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更強(qiáng)）2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸存在兩個(gè)CO2固定系統(tǒng)（需Mg2＋、K＋）：6碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H29ADP9ATP2×C3H4O3丙酮酸脫羧CO2固定C4C2縮合H2O3/2O23H2OC6H8O7檸檬酸碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H7（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)1、正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機(jī)磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關(guān)系，正是由于細(xì)胞內(nèi)濃度升高，使磷酸果糖激酶對細(xì)胞內(nèi)積累的大量檸檬酸不敏感。二、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)二、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)8淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸檸檬酸CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮92.比較底物錳充足、錳缺乏時(shí)分批培養(yǎng)物的最大活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，錳缺乏時(shí)黑曲霉的組成（合成）代謝受損傷，這與檸檬酸的積累有關(guān)。錳缺乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)NH4＋濃度高，Aa濃度高（蛋白合成受阻，導(dǎo)致升高）。因此，錳離子效應(yīng)是通過NH4＋升高而減少檸檬酸對磷酸果糖激酶的抑制來實(shí)現(xiàn)的。2.比較底物錳充足、錳缺乏時(shí)分批培養(yǎng)物的最大活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，錳缺103.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)，在某些真菌得到證實(shí)，但黑曲霉未被證實(shí)。3.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)，在某些真菌得到證實(shí)11（二）TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)

1、TCA環(huán)的起始酶：檸檬酸合成酶是一種調(diào)節(jié)酶。但在黑曲霉中，檸檬酸合成酶沒有調(diào)節(jié)作用，這是黑曲霉TCA環(huán)的第一個(gè)特點(diǎn)。順烏頭酸酶失活，阻斷TCA環(huán)是檸檬酸積累的必要條件，順烏頭酸水合酶需要Fe2＋。順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時(shí)失活，線粒體順烏頭酸酶在催化時(shí)有檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7的平衡，這個(gè)平衡可能就是造成檸檬酸的最初積累而使pH值降低。（二）TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)122.第二個(gè)特點(diǎn)：黑曲霉菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低（TCA環(huán)被阻斷），它被葡萄糖和NH4＋抑止

。（是TCA循環(huán)中唯一不可逆的反應(yīng)步驟）3.氧和pH值對檸檬酸發(fā)酵的影響很大。氧是發(fā)酵過程（EMP途徑和丙酮酸脫氫）生成的NADH2重新氧化時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈產(chǎn)生ATP積累，側(cè)呼吸鏈不產(chǎn)生ATP，缺氧導(dǎo)致側(cè)呼吸鏈?zhǔn)Щ?，使ATP積累，檸檬酸積累減少。2.第二個(gè)特點(diǎn)：黑曲霉菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低13磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2抑制α-酮戊二酸脫氫酶系磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異14TCA循環(huán)在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關(guān)鍵（2）丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調(diào)節(jié)的控制或其控制及微弱，而且這兩個(gè)反應(yīng)的平衡保證了草酰乙酸的提供，增加了檸檬酸的合成能力TCA循環(huán)在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰15（3）TCA循環(huán)的阻斷微弱，導(dǎo)致循環(huán)中間代謝物積累。由于各種酶處于平衡狀態(tài)，使檸檬酸積累，當(dāng)檸檬酸濃度超過一定水平時(shí)，就通過抑止異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累。（3）TCA循環(huán)的阻斷微弱，導(dǎo)致循環(huán)中間代謝物積累。由16檸檬酸的積累機(jī)制歸納：①M(fèi)n抑制蛋白合成NH4解除磷酸果糖激酶的代謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)EMP途徑的暢通有一條呼吸活力強(qiáng)的不產(chǎn)生ATP的側(cè)系呼吸鏈②由于丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制。2+﹢缺乏檸檬酸的積累機(jī)制歸納：①M(fèi)n抑制蛋白合成NH4解除磷酸果糖激17

③丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和CO2固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸的能力。

④由于順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立了以下平衡：檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7同時(shí)控制Fe2+含量時(shí)，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。

③丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA和CO2固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，18⑤隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時(shí)，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累及排出細(xì)胞外。⑤隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時(shí)，使順烏頭酸酶和異檸檬19三、乙醛酸循環(huán)和醋酸發(fā)酵檸檬酸丙酮酸脫羧反應(yīng)是不可逆的，草酰乙酸的供給只能由乙醛酸循環(huán)來完成存在異檸檬酸裂解酶，合成檸檬酸的C4二羧酸只能由乙醛酸提供。三、乙醛酸循環(huán)和醋酸發(fā)酵檸檬酸丙酮酸脫羧反應(yīng)是不可逆的，草酰20乙醇乙酸乙酰CoACoA烴類β-氧化草酰乙酸檸檬酸異檸檬酸琥珀酸乙醛酸乙酰CoA蘋果酸富馬酸乙醛酸循環(huán)乙醇乙酸乙酰CoACoA烴類β-氧化草酰乙酸檸檬酸異檸檬21作業(yè)：簡述檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)

作業(yè)：22第四章檸檬酸發(fā)酵機(jī)制

檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)名α-羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產(chǎn)物之一。

性質(zhì)：分子式C6H8O7，分子量192.12

有兩種形式水合物：100℃時(shí)融解，密度1.542g/cm3(18℃)

無水物：無色晶體或粉末，熔點(diǎn)153℃

有強(qiáng)酸味。溶于水、乙醇和乙醚

第四章檸檬酸發(fā)酵機(jī)制檸檬酸又名枸櫞酸，學(xué)23

用途：1）食品行業(yè)2）醫(yī)藥行業(yè)3）化工行業(yè)4）其它行業(yè)

檸檬酸的生產(chǎn)：1874年首次從檸檬汁中提出檸檬酸并結(jié)晶成固體；1913年首次實(shí)現(xiàn)利用黑曲霉發(fā)酵生成檸檬酸。用途：24一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EMP途徑氧化脫羧羧化一、檸檬酸合成途徑葡萄糖丙酮酸檸檬酸乙酰-CoA草酰乙酸EM25

1953年，Jagnnathan等證實(shí)了黑曲霉中存在EMP途徑的所有酶；

1954年，Shu提出葡萄糖分解代謝中約80％走EMP途徑；

1958年，MeDomough等發(fā)現(xiàn)黑曲霉還存在HMP途徑的酶，但HMP途徑主要存在于孢子形成階段；1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉中存在三羧酸循環(huán)；1953年，Jagnnathan等證實(shí)了黑26淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮27存在兩個(gè)CO2固定系統(tǒng)（需Mg2＋、K＋）：1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更強(qiáng)）2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸存在兩個(gè)CO2固定系統(tǒng)（需Mg2＋、K＋）：28碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H29ADP9ATP2×C3H4O3丙酮酸脫羧CO2固定C4C2縮合H2O3/2O23H2OC6H8O7檸檬酸碳平衡和能量平衡C6H12O6EMP途徑2ADP2ATP2H29（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)1、正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機(jī)磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關(guān)系，正是由于細(xì)胞內(nèi)濃度升高，使磷酸果糖激酶對細(xì)胞內(nèi)積累的大量檸檬酸不敏感。二、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)（一）、糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)二、檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)30淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸檸檬酸CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP淀粉葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸烯醇丙酮312.比較底物錳充足、錳缺乏時(shí)分批培養(yǎng)物的最大活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，錳缺乏時(shí)黑曲霉的組成（合成）代謝受損傷，這與檸檬酸的積累有關(guān)。錳缺乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)NH4＋濃度高，Aa濃度高（蛋白合成受阻，導(dǎo)致升高）。因此，錳離子效應(yīng)是通過NH4＋升高而減少檸檬酸對磷酸果糖激酶的抑制來實(shí)現(xiàn)的。2.比較底物錳充足、錳缺乏時(shí)分批培養(yǎng)物的最大活力時(shí)發(fā)現(xiàn)，錳缺323.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)，在某些真菌得到證實(shí)，但黑曲霉未被證實(shí)。3.丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)，在某些真菌得到證實(shí)33（二）TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)

1、TCA環(huán)的起始酶：檸檬酸合成酶是一種調(diào)節(jié)酶。但在黑曲霉中，檸檬酸合成酶沒有調(diào)節(jié)作用，這是黑曲霉TCA環(huán)的第一個(gè)特點(diǎn)。順烏頭酸酶失活，阻斷TCA環(huán)是檸檬酸積累的必要條件，順烏頭酸水合酶需要Fe2＋。順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時(shí)失活，線粒體順烏頭酸酶在催化時(shí)有檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90：3：7的平衡，這個(gè)平衡可能就是造成檸檬酸的最初積累而使pH值降低。（二）TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)342.第二個(gè)特點(diǎn)：黑曲霉菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低（TCA環(huán)被阻斷），它被葡萄糖和NH4＋抑止

。（是TCA循環(huán)中唯一不可逆的反應(yīng)步驟）3.氧和pH值對檸檬酸發(fā)酵的影響很大。氧是發(fā)酵過程（EMP途徑和丙酮酸脫氫）生成的NADH2重新氧化時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈產(chǎn)生ATP積累，側(cè)呼吸鏈不產(chǎn)生ATP，缺氧導(dǎo)致側(cè)呼吸鏈?zhǔn)Щ?，使ATP積累，檸檬酸積累減少。2.第二個(gè)特點(diǎn)：黑曲霉菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低35磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸琥珀酸富馬酸CO2Fe2+CO2CO2抑制α-酮戊二酸脫氫酶系磷酸烯醇丙糖酸丙酮酸乙酰CoA蘋果酸草酰乙酸檸檬酸順烏頭酸異36TCA循環(huán)在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關(guān)鍵（2）丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調(diào)節(jié)的控制或其控制及微弱，而且這兩個(gè)反應(yīng)的平衡保證了草酰乙酸的提供，增加了檸檬酸的合成能力TCA循環(huán)在檸檬酸積累中所起作用可歸納為：（1）大量生成草酰37（3）TCA循環(huán)的阻斷微弱，導(dǎo)致循環(huán)中間代謝物積累。由于各種酶處于平衡狀態(tài)，使檸檬酸積累，當(dāng)檸檬酸濃度超過一定水平時(shí)，就通過抑止異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累。（3）TCA循環(huán)的阻斷微弱，導(dǎo)致循環(huán)中間代謝物積累。由38檸檬酸的積累機(jī)制歸納：①M(fèi)n抑制蛋白合成NH