缺氧誘導(dǎo)因子1α在實(shí)驗(yàn)性大鼠腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用

缺氧誘導(dǎo)因子1α在實(shí)驗(yàn)性大鼠腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用

[11-03-2315:46:00]

編輯：studa20

作者：羅燕萍,李晶,芮金兵,何建強(qiáng),王曉明【摘要】

目的：觀察單側(cè)輸尿管梗阻(ulilateralureteralobstruction，UUO)大鼠模型腎組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)的表達(dá)，探討HIF1α表達(dá)水平與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系。方法：40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組，假手術(shù)組，UUO組(每組20只)。制備UUO大鼠模型，術(shù)后第7天、第14天處死大鼠，腎組織行HE和Masson染色，免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTPCR)檢測(cè)HIF1α，Ⅰ型膠原(collagenⅠ,ColⅠ)及α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αsmoothmuscleactin,αSMA)在腎組織中的表達(dá)。結(jié)果：假手術(shù)組與UUO組各時(shí)間點(diǎn)腎小管間質(zhì)纖維化評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后HIF1αmRNA水平隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而遞增。UUO組HIF1α蛋白表達(dá)量隨著腎間質(zhì)損害加重而增加，HIF1α蛋白主要分布在腎小管，其中以近曲小管表達(dá)最明顯。HIF1α表達(dá)水平與腎小管間質(zhì)纖維化評(píng)分，αSMA和ColⅠ的表達(dá)水平均存在正相關(guān)(R值分別為0.71，0.68，0.82，P均<0.05)。結(jié)論：HIF1α在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)可能參與了腎間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程?！娟P(guān)鍵詞】

缺氧誘導(dǎo)因子1α;腎間質(zhì)纖維化;單側(cè)輸尿管梗阻[Abstract]Objective:Toinvestigatetheroleofhypoxiainduciblefactor1alpha(HIF1α)inrenaltubulointerstitiallesionsinducedbyunilateralureteralobstruction(UUO).Methods：Randomly,40femaleSDratsweredividedintoshamoperationgroupandUUOgroup,with20ineach.Theleftureterswereexposed,andintheUUOgrouptheywerealsoligated.Onday7and14,someofthekidneyswereharvestedtostudyinthemtheexpressionsofrenaltubularinterstitialfibrosis,theexpressionsofmRNAsofHIF1α,αsmoothmuscleactin(αSMA)andcollagenⅠ(ColⅠ)withRTPCRandtheexpressionsoftheseproteinsimmunohistochemically.Results：Comparedwithshamgroup,thescoresofrenalinterstitialfibrosisinUUOratswerehighersignificantly.HIF1αmRNAsincreasedwithtimeafteroperationinthekidneysintheUUOrats.AndtheproteinexpressionofHIF1αincreasedinthekidneysobtainedonthe14thdayafteroperation.ImmunohistochemicallyHIF1αmainlyexpressedinrenaltubularepithelialcells,especiallyinproximaltubularcells.TherenaltubulointerstitialexpressionofHIF1αwaspositivelyassociatedwiththescoresofrenalinterstitialfibrosisandtheexpressionofαSMAandColⅠ.Conclusion：HIF1αmayplayanimportantroleinmediatingtherenaltubulointerstitialfibrosis.[Keywords]hypoxiainduciblefactor1alpha;renalinterstitialfibrosis;unilateralureteralobstruction腎間質(zhì)纖維化(renalinterstitialfibrosis,RIF)是慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎衰的共同途徑。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelialtomyofibroblasttransition,EMT)在RIF的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1]。慢性缺氧是導(dǎo)致RIF主要因素之一，而缺氧對(duì)腎臟損害的作用主要是通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1α)介導(dǎo)的[2]。HIF1α能夠調(diào)節(jié)多種與RIF有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，增加EMT。所以，HIF1α可能是促進(jìn)RIF的關(guān)鍵因子[3,4]。已知HIF1α在IgA腎病、大部腎切除、慢性馬兜鈴酸腎病動(dòng)物模型腎組織中異常表達(dá)，但在腎間質(zhì)纖維化模型單側(cè)輸尿管梗阻(ulilateralureteralobstruction,UUO)大鼠模型腎組織中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立大鼠UUO模型，觀察HIF1α在腎組織中的表達(dá)，探討HIF1α與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系。1材料與方法1.1藥品與試劑小鼠抗大鼠HIF1α單克隆抗體，購(gòu)自Novus公司(美國(guó))，山羊抗大鼠Ⅰ型膠原(ColⅠ)多克隆抗體及小鼠抗大鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白(αsmoothmuscleactin,αSMA)單克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司(美國(guó))，大鼠HIF1α，αSMA，ColⅠ，GAPDH引物由上海生工合成。1.2動(dòng)物分組選擇清潔級(jí)SD雌性大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量190～210g(江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，按隨機(jī)數(shù)字法分為2組，假手術(shù)組，UUO組，每組20只。①UUO組：制作大鼠UUO模型,大鼠予氯胺酮50mg/kg腹腔注射麻醉,仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上,剪毛后常規(guī)消毒,行左側(cè)腹切口,分離左側(cè)輸尿管,絲線結(jié)扎2道,上一道結(jié)扎點(diǎn)位于左腎下極水平,然后結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管，逐層縫合肌肉、皮膚層。②假手術(shù)組:假手術(shù)組開(kāi)腹后不結(jié)扎輸尿管，關(guān)閉腹腔，作為對(duì)照組。1.3標(biāo)本采集各組大鼠分別于術(shù)后7d，14d處死(n=10),取左側(cè)腎組織，一半常規(guī)石蠟包埋切片，一半立即存放于80℃冰箱。1.4檢測(cè)方法1.4.1腎臟常規(guī)病理檢查大鼠腎組織經(jīng)4%低聚甲醛固定過(guò)夜，浸蠟，石蠟包埋，制成厚度3μm切片，經(jīng)HE和Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質(zhì)病變。1.4.2腎臟免疫組織化學(xué)檢查使用二步法(Envision顯色系統(tǒng))。脫蠟和水化組織切片?？乖瓱嵝迯?fù)，蒸餾水漂洗，置于三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(TBS)中。3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育10min。蒸餾水漂洗，置于TBS中10min。加入第一抗體(稀釋度HIF1α1∶500,αSMA1∶500,ColⅠ1∶500)4℃孵育過(guò)夜。TBS漂洗10min。色源底物溶液DAB孵育，光鏡控制顯色。蒸餾水漂洗，復(fù)染及封固。PBS代替一抗為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照。1.4.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RTPCR)檢查利用TRIzol一步法提取腎組織總RNA，取2μgRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2μlcDNA作模板用HIF1α，αSMA，ColⅠ和GAPDH引物行PCR擴(kuò)增(終體積20μl)。在德國(guó)RocheLightcyclerPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃10s，20℃1s1個(gè)循環(huán),PCR反應(yīng):95℃10s，20℃1s，60℃20s，20℃1s，40個(gè)循環(huán),溶解曲線分析：95℃10s，20℃1s，65℃15s，20℃1s，95℃10s，0.1℃1s。引物序列和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)是通過(guò)參照基因GAPDH作標(biāo)準(zhǔn)化處理得到的ΔCT值(ΔCT=各組基因CT-各組參照基因GAPDHCT)，然后再選取代表1倍目的基因表達(dá)量的樣本為對(duì)照因子，處理組樣本基因相對(duì)于對(duì)照組樣本基因的量通過(guò)公式2-(ΔΔCT)計(jì)算得到。ΔΔCT=(實(shí)驗(yàn)組ΔCT-對(duì)照組ΔCT)。表1PCR引物序列1.5圖像分析1.5.1Masson染色腎間質(zhì)纖維化的半定量分析200倍光鏡下，隨機(jī)選取20個(gè)連續(xù)不重復(fù)的視野，根據(jù)藍(lán)色著色的腎間質(zhì)纖維化區(qū)域面積占同視野小管間質(zhì)總面積的百分比，取各組平均值，積分定義如下：0分(無(wú)病變);1分(<10%);2分(～25%);3分(～50%);4分(～75%);5分(>75%)。1.5.2免疫組織化學(xué)染色評(píng)分腎間質(zhì)HIF1α，αSMA表達(dá)按以下方法評(píng)估：0分(腎間質(zhì)無(wú)表達(dá));1分(輕度表達(dá)，即表達(dá)不超過(guò)視野30%);2分(中度表達(dá)，即上述面積為31%～60%);3分(重度表達(dá)，上述面積超過(guò)61%);4分(極重度表達(dá)，大面積腎小管萎縮，被大面積表達(dá)HIF1α，αSMA組織代替)，計(jì)算20個(gè)腎皮質(zhì)高倍視野(×400)分值，取其均值。ColⅠ表達(dá)的半定量法：根據(jù)光鏡下染色在腎間質(zhì)的分布：0分(無(wú)染色);1分(局部染色);2分(輕至中度彌漫染色);3分(重度彌漫染色)，計(jì)算20個(gè)腎皮質(zhì)高倍視野(×400)分值，取其均值。以上評(píng)分均由3人盲法同時(shí)進(jìn)行，取平均值。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，各項(xiàng)指標(biāo)間相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)計(jì)算以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。2結(jié)果2.1各組大鼠腎臟病理變化Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)腎臟病理未見(jiàn)明顯異常。UUO組各時(shí)間點(diǎn)腎小球結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯病理改變,UUO術(shù)后7d組腎小管明顯擴(kuò)張，并見(jiàn)萎縮腎小管,間質(zhì)寬度明顯增加。UUO術(shù)后14d組萎縮腎小管數(shù)量明顯增加，間質(zhì)纖維化更加明顯(見(jiàn)圖1，2)。2.2腎組織HIF1α，αSMA，ColⅠ蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞僅有少量HIF1α表達(dá)。與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，UUO組術(shù)后7d腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)HIF1α表達(dá)顯著增加，術(shù)后14d腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)HIF1α表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，與UUO術(shù)后7d組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，HIF1α蛋白表達(dá)以近曲小管上皮細(xì)胞最為明顯。假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)αSMA表達(dá)，UUO組術(shù)后7d部分腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)區(qū)域少許細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)