酶工程復(fù)習(xí)資料p

第一章緒論酶：是具有生物催化功能的生物大分子， 分為蛋白類酶和核酸類酶兩大類別。酶的生產(chǎn)：是指通過各種方法獲得人們所需的酶的技術(shù)過程，主要包括微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、動(dòng)植物培養(yǎng)產(chǎn)酶和酶的提取與分離純化等。酶的改性：是通過各種方法改進(jìn)酶的催化特性的技術(shù)過程，主要包括酶分子修飾、酶的固定化、酶非水相催化和定向進(jìn)化。酶的應(yīng)用：是通過酶的催化作用獲得人們所需的物質(zhì)或者除去不良物質(zhì)的技術(shù)過程，主要包括酶反應(yīng)器的選擇與設(shè)計(jì)以及酶在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用等酶催化的作用特點(diǎn)：專一性強(qiáng)、催化效率高和作用條件溫和等。酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、 pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。在酶的應(yīng)用過程中，必須控制好各種環(huán)境條件，以充分發(fā)揮酶的催化功能。米氏方程：V=VmS/Km+S,Kn為米氏常數(shù)，是酶催化反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。抑制劑的影響：有可逆抑制劑和不可逆抑制劑之分。不可逆抑制劑與酶分子結(jié)合后， 抑制劑難于除去，酶活性不能恢復(fù)?？赡嬉种苿┡c酶的結(jié)合是可逆的，只要將抑制劑除去，酶酶活力即可恢復(fù)?？赡嫘砸种谱饔每梢苑譃楦?jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制和反競(jìng)爭(zhēng)性抑制三種。競(jìng)爭(zhēng)性抑制：是指抑制劑和底物競(jìng)爭(zhēng)與酶分子結(jié)合而引起的抑制作用。抑制的效果強(qiáng)弱與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的濃度、底物濃度以及抑制劑和底物與酶的親和力大小有關(guān)，隨著底物濃度增加，酶的抑制作用減弱。特點(diǎn)：酶催化反應(yīng)的最大反應(yīng)速率Vm不變，米氏常數(shù)Km增大。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：是指抑制劑與底物分別于酶分子上的不同位點(diǎn)結(jié)合而引起酶活性降低的抑制作用。特點(diǎn)：最大反應(yīng)速度Vm減少，米氏常數(shù)Km不變。反競(jìng)爭(zhēng)性抑制：在底物與酶分子結(jié)合生成中間復(fù)合物后，抑制劑再與中間復(fù)合物結(jié)合而引起的抑制作用稱為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。特點(diǎn)：最大反應(yīng)速度Vm和米氏常數(shù)Km同時(shí)減少。4.酶的活力測(cè)定酶活力：是指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)初速度。在外界條件相同的情況下，反應(yīng)速度越大，意味著酶活力越高。酶活力測(cè)定過程：反應(yīng)體系選擇、反應(yīng)條件確定、反應(yīng)物檢測(cè)、酶活力計(jì)算、偶聯(lián)酶反應(yīng)活力測(cè)定酶活力單位：在特定條件下（溫度可采用 25C或其它選用的溫度，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1卩mol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為 1個(gè)酶活力單位。這個(gè)單位稱為國(guó)際單位。酶的轉(zhuǎn)換數(shù)：是指每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)，即每摩爾酶每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)。酶的生產(chǎn)方法：提出分離法、生物合成法、化學(xué)合成法第二章微生物發(fā)酵產(chǎn)酶酶的發(fā)酵生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計(jì)，通過人工操作，利用微生物的生命活動(dòng)獲得所需的酶的技術(shù)過程，稱為酶的發(fā)酵生產(chǎn)。產(chǎn)酶微生物的特點(diǎn)：①酶的產(chǎn)量高；②產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；③容易培養(yǎng)和管理；④利于酶的分離純化；⑤安全可靠、無毒性。酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式：固體培養(yǎng)發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵和固定化微生物原生質(zhì)體發(fā)酵。酶發(fā)酵動(dòng)力學(xué)：是研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長(zhǎng)效率、產(chǎn)物生成效率、基質(zhì)消耗速率以及環(huán)境因素對(duì)這些速率的影響規(guī)律的學(xué)科。一、 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)在分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)一般要經(jīng)歷延遲期、指數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、靜止期和衰亡期 5個(gè)階段。1950年，法國(guó)莫諾德首先提出了表述微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)，他認(rèn)為，在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比。營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度）和生長(zhǎng)速率之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系：Monod模型TOC\o"1-5"\h\z」=dX1 JmSdtX KsS口比生長(zhǎng)速率（1/h） （specificgrowthrate）pmax:最大比生長(zhǎng)速率（1/h）S:營(yíng)養(yǎng)物濃度（生長(zhǎng)限制基質(zhì)濃度） 克/LKs:莫諾德常數(shù)或飽和常數(shù)或營(yíng)養(yǎng)物利用常數(shù) 克/L,或mol/L二、 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)（一）酶生物合成的模式根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)之間的關(guān)系，可將酶的生物合成分為4種模式，即：同步合成型、中期合成型、延續(xù)合成型、滯后合成型同步合成型：酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步。特點(diǎn)：酶的合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。當(dāng)去除誘導(dǎo)物、細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對(duì)應(yīng)的mRNA很不穩(wěn)定。2．中期合成型：酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間后才開始，而在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒艋蚍纸獯x物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。3．延續(xù)合成型：酶的合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)一段時(shí)間。特點(diǎn)：可受誘導(dǎo)，一般不受分解代謝物和產(chǎn)物阻遏。所對(duì)應(yīng)的mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。3.滯后合成型：只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點(diǎn)：受分解代謝物的阻遏作用。所對(duì)應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性高。酶生產(chǎn)中最理想的合成模式：延續(xù)合成型：發(fā)酵過程中沒有生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶期的明顯差別。細(xì)胞開始生長(zhǎng)就有酶的產(chǎn)生，直至細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以繼續(xù)生成一段時(shí)間。同步合成型：提高對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度。滯后合成型：盡量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面努力。酶的發(fā)酵工藝條件與控制：1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的基本成分五大要素：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水2、發(fā)酵條件及控制：pH值的控制：培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對(duì)恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時(shí)補(bǔ)加酸、堿。通常培養(yǎng)條件：細(xì)菌與放線菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范圍內(nèi)生長(zhǎng)細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH值與生長(zhǎng)最適pH值往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pH值通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH值。溫度的控制：通常在生物學(xué)范圍內(nèi)每升高 10c，生長(zhǎng)速度就加快一倍，所以溫度直接影響酶反應(yīng)，對(duì)于微生物來說，溫度直接影響其生長(zhǎng)和合成酶。有些細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與細(xì)胞生長(zhǎng)最適溫度有所不同，而且往往低于生長(zhǎng)最適溫度。這是由于在較低的溫度條件下，可以提高酶所對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，增加酶生物合成的延續(xù)時(shí)間，從而提高酶的產(chǎn)量。溶解氧的控制溶解氧：是指溶解在培養(yǎng)基中的氧氣。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，處于不同生長(zhǎng)階段的細(xì)胞，其細(xì)胞濃度和細(xì)胞呼吸強(qiáng)度各不相同，致使耗氧速率有很大的差別。因此必須根據(jù)耗氧量的不同，不斷供給適量的溶解氧。培養(yǎng)液中溶解氧的量，決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。溶氧速率與通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時(shí)間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系。一般說來，通氣量越大、氧氣分壓越高、氣液接觸時(shí)間越長(zhǎng)、氣液接觸面積越大，則溶氧速率越大。培養(yǎng)液的性質(zhì)，主要是黏度、氣泡、以及溫度等對(duì)于溶氧速率有明顯影響?？刂迫芙庋醴椒ǎ赫{(diào)節(jié)通氣量、調(diào)節(jié)氧的分壓、調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間、調(diào)節(jié)氣液接觸面積、改變培養(yǎng)液的性質(zhì)3、提高產(chǎn)酶的措施（1） 添加誘導(dǎo)物對(duì)于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個(gè)適宜的時(shí)機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如，乳糖誘導(dǎo)3-半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸誘導(dǎo)蔗糖酶的生物合成等。誘導(dǎo)物一般可以分為3類：酶的作用底物、酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物、作用底物的類似物（2） 控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)機(jī)理不同，可分為：產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。產(chǎn)物阻遏作用是由酶催化作用的產(chǎn)物或者代謝途徑的末端產(chǎn)物引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏作用是由分解代謝物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物質(zhì)經(jīng)過分解代謝而產(chǎn)生的物質(zhì)）引起的阻遏作用?？刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒簟⑻岣呙府a(chǎn)量的有效措施。

為了減少或者解除分解代謝物阻遏作用，應(yīng)當(dāng) 控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度 。采用其他較難利用的碳源，如淀粉等采用補(bǔ)料、分次流加碳源添加一定量的環(huán)腺苷酸（CAMP）對(duì)于受代謝途徑末端產(chǎn)物阻遏的酶，可以通過 控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除 。（3）添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。將適量的非離子型表面活性劑，如吐溫（ Tween）、特里頓（Triton）等添加到培養(yǎng)基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的產(chǎn)量增加。由于離子型表面活性劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用 ，尤其是季胺型表面活性劑是消毒劑，對(duì)細(xì)胞的毒性較大，不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。（4）添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高 1?20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的產(chǎn)量。產(chǎn)酶促進(jìn)劑對(duì)不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循， 要通過試驗(yàn)確定所添加的產(chǎn)酶促進(jìn)劑的種類和濃度 。第四章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化：是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所要求的酶制品的技術(shù)過程,主要包括細(xì)胞破碎、提取、離心分離等等。細(xì)胞破碎：是指通過各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過程。細(xì)胞破碎方法與其原理分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法胞搗碎法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)研磨法勻漿法破碎物理破碎法溫度差破碎法通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞壓力查破碎法超聲波破碎法的外層結(jié)構(gòu)破壞，從而使細(xì)胞破碎化學(xué)破碎法使添加有機(jī)溶劑通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，從而添加表面活性劑細(xì)胞破碎酶促破碎法自溶法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化外加酶制劑法作用，使外層結(jié)構(gòu)受到破壞，從而使細(xì)胞破碎酶的提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程，也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象

鹽溶液提取0.02-0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2?6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8?12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶從細(xì)胞、細(xì)胞碎片或其他含酶原料中提取酶的過程受到 擴(kuò)散作用的影響。提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、 pH值等提取條件。酶的分離方法1.沉淀分離：是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的 溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心分離：是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力， 使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。離心分離：是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力， 使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。離心機(jī)主要分為常速（低速）離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)。常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī)，其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1X104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（1?2.5）X104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到1X104?1X105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中，溫度升高而造成酶的變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置，謂之高速冷凍離心機(jī)。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)（2.5?12）X104r/min,相對(duì)離心力可以高達(dá)5X105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。離心條件的確定：根據(jù)需要選擇的離心力、離心時(shí)間及離沉淀分離的方法沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不冋的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性， 通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不冋，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離

過濾的分類及其特性（根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ）類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2m酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2?2im細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20??0.2im病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜心介質(zhì)的PH值和溫度等條件。心介質(zhì)的PH值和溫度等條件。3過濾與膜分離過濾：是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。膜分離：離借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。四種常用膜分離技術(shù)的基本特征膜技術(shù)截留物尺寸nm（分子量）推動(dòng)力分離機(jī)理微濾MF>20 (>40,000)壓力差，＞100kPa篩分超濾UF1?20(10,000—40,000)壓力差，＞100kPa篩分納濾NF>1(100?1000)壓力差，＜1000kPa優(yōu)先吸附、表面電位反滲透RO(>100)壓力差，＞1000kPa優(yōu)先吸附、溶解擴(kuò)散超濾要細(xì)看（書本P101）4?層析分離層析分離：是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別， 使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中， 其中一個(gè)相為固定的（稱為固定相），另一個(gè)相則流過此固定相（稱為流動(dòng)相）并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。

（1）吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。操作過程：（1）吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。操作過程：吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。洗脫方法包括溶劑洗脫法、置換洗脫法、前緣洗脫法。（2）分配層析分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱為 流動(dòng)相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動(dòng)相的帶動(dòng)流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。分配層析主要有紙上層析、分配薄層層析、分配氣相層析等方法。（3） 離子層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為 陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。操作過程：包括裝柱、上柱、洗脫、收集和交換劑再生等步驟。詳細(xì)看書本（P110）。（4） 凝膠層析凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。原理：凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使 小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。層析方法分離原理吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的 吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不冋而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相， 利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的 專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離

各種雙水相系統(tǒng)聚合物P聚合物Q或鹽聚丙一醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基匍聚糖，匍聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基匍聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉操作過程：包括裝柱、上柱、洗脫等過程。親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物，操作過程：包括裝柱、上柱、洗脫等過程。親和層析親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物，酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，酶與輔助因子，抗原與抗體，酶RNA與互補(bǔ)的RNA分子或片段，RNA與互補(bǔ)的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對(duì)。故此，親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用 ?親和層析種類：根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性，親和層析可以分為：共價(jià)親和層析、疏水層析、金屬離子親和層析、免疫親和層析、染料親和層析 、凝集素親和層析聚焦電泳影響因素：顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外,還受到電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。6、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個(gè)液相。有時(shí)也可采用其它流體。分類：按照兩相的組成不同，萃取可以分為： 有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠束萃取電泳分離電泳：帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的過程稱為電泳。方法：電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為： 紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、自由電泳、等電雙水相萃?。豪萌苜|(zhì)在兩個(gè)互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離。第五章 酶分子修飾酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程稱為酶分子修飾。主要包括金屬離子置換修飾、大分子結(jié)合修飾、側(cè)鏈基團(tuán)修飾、肽鏈有限水解修飾、核苷酸鏈有限水解修飾、氨基酸置換修飾、核苷酸置換修飾和酶分子的物理修飾。酶分子修飾主要研究?jī)?nèi)容：1對(duì)酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)，尤其是酶活性中心中的必需基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)修飾，研究酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系2通過對(duì)酶功能基團(tuán)的修飾和水不溶性大分子的結(jié)合，改造酶性能，增加酶的穩(wěn)定性3通過對(duì)酶分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)，或與水不溶性載體的結(jié)合制成固定化酶，催化特定的反應(yīng)4用化學(xué)方法合成新的有機(jī)催化劑，使其具有酶活性 （模擬酶）5用分子生物學(xué)方法克隆酶或修飾酶基因以產(chǎn)生突變酶，或設(shè)計(jì)新基因合成自然界不存在的新酶 （抗體酶）大分子結(jié)合修飾：采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法稱為大分子結(jié)合修飾。大分子結(jié)合修飾的主要過程：.修飾劑的選擇 大分子結(jié)合修飾采用的修飾劑是水溶性大分子，要根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。?修飾劑的活化 作為修飾劑使用的水溶性大分子含有的基團(tuán)往往不能直接與酶分子的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)而結(jié)合在一起。在使用之前一般需要經(jīng)過活化，活化基團(tuán)才能在一定條件下與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。.修飾將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液以一定的比例混合，在一定的溫度、 PH等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。?分離通過分離方法進(jìn)行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾劑。大分子結(jié)合修飾的作用： 提高酶的催化效率、增加酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶的抗原性等。側(cè)鏈基團(tuán)修飾：采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的修飾方法稱為側(cè)鏈基團(tuán)修飾。側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)及組成 RNA的核苷酸殘基的功能團(tuán)。主要有氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基等等。側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性。各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2,4丹磺酰氯、亞硝酸-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2—環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來酰亞胺一硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺物理修飾：通過各種方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特性的方法稱為酶分子的物理修飾。修飾特點(diǎn)：在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變。酶分子修飾的應(yīng)用：1、在酶學(xué)研究的方面的應(yīng)用： 酶的活性中心研究、酶的空間結(jié)構(gòu)研究、酶的作用機(jī)制研究。2、 在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用：降低或者消除酶抗原性、增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性3、 在工業(yè)方面的應(yīng)用：提高工業(yè)用酶的催化效率、增強(qiáng)工業(yè)用酶的穩(wěn)定性、改變酶的動(dòng)力學(xué)特性。4、 在抗體酶研究開發(fā)方面的應(yīng)用5、 在核酸類酶人工改造方面的應(yīng)用6、 在有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用第六章 酶、細(xì)胞、原生質(zhì)體固定化固定化酶：是指固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：提高酶的催化效率、增加穩(wěn)定性、多次使用、可以裝塔連續(xù)反應(yīng)、純化簡(jiǎn)單、提高產(chǎn)物質(zhì)量、應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)：首次投入成本高、擴(kuò)散限制，大分子底物較困難酶的固定化：采用各種方法，將酶固定在水不溶性的載體上，制備成固定化酶的過程稱為酶的固定化。方法：將酶和含酶菌體或菌體碎片固定化的方法主要包括吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法和熱處理法等。（1） 吸附法：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，從而使酶固定化的方法叫做物理吸附法，簡(jiǎn)稱吸附法。（2） 包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。根據(jù)載體材料和方法的不同，可以分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩大類。（3） 結(jié)合法：選擇適宜的載體，使之通過共價(jià)鍵或離子鍵與酶結(jié)合在一起的固定化方法稱為結(jié)合法。根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，可分為離子鍵結(jié)合法和共價(jià)鍵結(jié)合法。離子鍵結(jié)合法：通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體：DEAE-纖維素，DEAE-葡聚糖凝膠使用注意：pH、離子強(qiáng)度、溫度2?共價(jià)鍵結(jié)合法：通過共價(jià)鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法?？梢孕纬晒矁r(jià)鍵的基團(tuán)： 游離氨基、游離羧基、巰基、咪唑基、酚基、羥基、甲硫基、吲哚基、二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機(jī)載體要使載體與酶形成共價(jià)鍵，首先必須使載體活化，即借助于某種方法，在載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)，此活潑基團(tuán)再與酶分子上的某一基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。載體活化的方法：A.重氮法、B.疊氮法、C.烷基化反應(yīng)法、D.硅烷化法、E.溴化氰法（4） 交聯(lián)法：借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。（5） 熱處理法：是將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體的方法。各類固定化方法的特點(diǎn)比較項(xiàng)目吸附法結(jié)合法交聯(lián)法包埋法物理吸附共價(jià)鍵結(jié)合離子鍵結(jié)合制備難易易難易較難較難固定化程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收率較高低高中等高載體再生可能不可能可能不可能不可能費(fèi) 用低高低中等低底物專一性不變可變不變可變不變適用性晦源多較廣廣泛較廣小分子底物、藥用酶固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用?葡萄糖異構(gòu)酶一一世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法等進(jìn)行固定化。葡萄糖異構(gòu)酶葡萄糖 果糖 果葡糖漿?聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產(chǎn)氨短桿菌菌體，制得固定化延胡索酸酶。工業(yè)化生產(chǎn)L-蘋果酸?利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產(chǎn)低乳糖奶固定化酵母細(xì)胞等微生物可用于生產(chǎn)各種酒類第七章酶非水相催化酶在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用稱為 酶的非水相催化。酶非水相催化的幾種類型：有機(jī)介質(zhì)中的酶催化一一有機(jī)溶劑有機(jī)介質(zhì)中的酶催化是指酶在含有一定量水的有機(jī)溶劑中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物、產(chǎn)物兩者或其中之一為疏水性物質(zhì)的酶催化作用。酶在有機(jī)介質(zhì)中由于能夠基本保持其完整的結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功能。?氣相介質(zhì)中的酶催化一一氣相介質(zhì)酶在氣相介質(zhì)中進(jìn)行的催化反應(yīng)。適用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)的酶催化反應(yīng)。 由于氣體介質(zhì)的密度低，擴(kuò)散容易，因此酶在氣相中的催化作用與在水溶液中的催化作用有明顯的不同特點(diǎn)。?超臨界介質(zhì)中的酶催化一一超臨界流體酶在超臨界流體中進(jìn)行的催化反應(yīng)。超臨界流體是指溫度和壓力超過某物質(zhì)超臨界點(diǎn)的流體。4.離子液介質(zhì)中的酶催化酶在離子液中進(jìn)行的催化作用。 離子液是由有機(jī)陽離子與有機(jī)（無機(jī)）陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類，揮發(fā)性低、穩(wěn)定性好。酶在離子液中的催化作用具有良好的穩(wěn)定性和區(qū)域選擇性、立體選擇性、鍵選擇性等顯著特點(diǎn)。有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系：1?單相共溶體系一一與水互溶的有機(jī)溶劑極性較大的有機(jī)溶劑與水形成均勻的單相溶液體系。酶、底物和產(chǎn)物都能溶解在這種體系中。不存在傳質(zhì)障礙。極性大的溶劑對(duì)一般酶的催化活性影響大，能在該體系反應(yīng)的酶較少。兩相/多相體系——與水不溶性，非極性有機(jī)溶劑由含有溶解酶的水相和一個(gè)非極性的有機(jī)溶劑 （高脂溶性）相所組成的兩相體系。游離酶、親水性底物或產(chǎn)物溶解于水相，疏水性底物或產(chǎn)物溶解于有機(jī)相。催化反應(yīng)在兩相界面進(jìn)行，一般適用于底物或產(chǎn)物兩者或其中一種是屬于疏水化合物的催化反應(yīng)。3?微水介質(zhì)體系——非極性有機(jī)溶劑用非極性有機(jī)溶劑取代所有的大量水，使固體酶懸浮在有機(jī)相中。但仍然含有必需的結(jié)合水以保持酶的催化活性（含水量一般小于2%）。酶的狀態(tài)可以是結(jié)晶態(tài)、凍干狀態(tài)、沉淀狀態(tài)，或者吸附在固體載體表面上。有機(jī)介質(zhì)酶催化中廣泛應(yīng)用的一種反應(yīng)體系。（正）膠束體系是在大量水溶液中含有少量與水不溶的有機(jī)溶劑，加入表面活性劑后形成的水包油的微小液滴。表面活性劑的極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，有機(jī)溶劑抱在液滴內(nèi)部。反應(yīng)時(shí)，酶在膠束外面的水溶液中，疏水性的底物或產(chǎn)物在膠束內(nèi)部。反應(yīng)在膠束的兩相界面中進(jìn)行。反膠束體系含有表面活性劑與少量水的有機(jī)溶劑系統(tǒng)。反向微團(tuán)：疏水尾部向外，與非極性有機(jī)溶劑接觸，急性頭部向內(nèi)，形成一個(gè)極性核。反應(yīng)時(shí)，酶分子在反膠束內(nèi)部的水溶液中，疏水性底物或產(chǎn)物在反膠束外部，催化反應(yīng)在兩相的界面中進(jìn)行。有機(jī)介質(zhì)酶催化的優(yōu)點(diǎn)：1．有利于疏水性底物的反應(yīng)：有機(jī)溶劑增加了疏水性底物的溶解度，增加了疏水性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率；2．可改變反應(yīng)平衡的移動(dòng)方向：在有機(jī)介質(zhì)中，可發(fā)生水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，如氨基酸合成肽3．能催化在水中不能進(jìn)行的反應(yīng)：轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；酚氧化在氯仿中比水中效率高；4．防止水引起的副反應(yīng)發(fā)生；5．酶穩(wěn)定性增強(qiáng)，較少微生物污染；6．易于實(shí)現(xiàn)固定化以及產(chǎn)物和酶的回收酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性：酶在有機(jī)介質(zhì)中起催化作用時(shí)，由于有機(jī)溶劑的極性與水有很大差別，對(duì)酶的表面結(jié)構(gòu)、活性中心的結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生一定的影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不同的催化特性。底物特異性：有機(jī)介質(zhì)中，酶分子活性中心的結(jié)合部位與底物之間的結(jié)合狀態(tài)發(fā)生某些變化，致使酶的底物特異性會(huì)發(fā)生改變。立體選擇性：有機(jī)溶劑中酶的立體選擇性降低。原因：在水和有機(jī)溶劑中，底物的兩種對(duì)映體將水從酶分子疏水性結(jié)合位點(diǎn)上置換出來的能力有所不同。在疏水性差的溶劑中，疏水性的基團(tuán)進(jìn)入酶的疏水袋中比暴露在溶劑中熱力學(xué)平衡更為有利，因此酶分子中的親核基團(tuán)易于進(jìn)攻位置合適的底物分子的羥基，從而得到某個(gè)構(gòu)型的產(chǎn)物。而在疏水性強(qiáng)的溶劑中，疏水性基團(tuán)更傾向于暴露在溶劑中，而非進(jìn)入酶的疏水袋，從而失去酶對(duì)底物的選擇性。區(qū)域選擇性：在酶促反應(yīng)中，底物某一位置上的基團(tuán)被選擇性地轉(zhuǎn)化而另一位置上的相同基團(tuán)沒有被轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象鍵選擇性：與酶的來源和有機(jī)介質(zhì)的種類有關(guān)。與氫鍵參數(shù)有關(guān)，易于形成氫鍵的基團(tuán)，不易進(jìn)行反應(yīng)。反之易于反應(yīng)熱穩(wěn)定性：酶在缺水的環(huán)境中，使得酶分子中肽鍵水解、二硫鍵破壞、氨基酸異構(gòu)化等無法進(jìn)行，酶構(gòu)象的剛性增加，穩(wěn)定性提高?；钚裕河袡C(jī)溶劑直接作用于酶有些酶的活性會(huì)隨著某些有機(jī)溶劑濃度升高而增大，在某一濃度達(dá)到最大值；低水有機(jī)溶劑體系中，大部分酶活性得以保持，但也有某些酶活性亦發(fā)生變化。pH：pH對(duì)水相中進(jìn)行的酶促反應(yīng)有較大影響，但在有機(jī)相反應(yīng)體系中，很難直接測(cè)定。有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制：酶在有機(jī)介質(zhì)中可以催化多種反應(yīng)，主要包括：合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)移反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)、異構(gòu)反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、裂合反應(yīng)等。主要應(yīng)控制的條件有水含量：酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對(duì)酶的空間構(gòu)象、酶的催化活性、酶的穩(wěn)定性、酶的催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。酶的種類和濃度：酶種類：依據(jù)反應(yīng)的類型，如：脂肪酶、蛋白酶、氧化酶等酶形式的選擇：冷凍干燥的酶粉、固定化酶、結(jié)晶酶、酶與大分子物質(zhì)的復(fù)合物等使用載體對(duì)酶固定化，所選擇載體對(duì)酶的微水環(huán)境影響盡可能小。如果酶基本存在于載體表面，則疏水性載體對(duì)酶的固定化有利。隨著載體親水性增強(qiáng)，酶的催化活力呈下降趨勢(shì)（親水基團(tuán)爭(zhēng)奪必需水，導(dǎo)致構(gòu)想改變）。提高載體疏水基團(tuán)含量，可提高固定化酶對(duì)疏水性底物的親和力，提高反應(yīng)活性。底物的種類和濃度：依據(jù)酶在所使用有機(jī)介質(zhì)中的專一性選擇適宜的底物底物濃度-酶促反應(yīng)速度有機(jī)溶劑的種類：溫度：在微水有機(jī)介質(zhì)中，酶促反應(yīng)的最適溫度高于水溶液中的最適溫度溫度升高，立體選擇性下降pH：有機(jī)相中最適pH通常與水溶液中相同或接近酶分子從緩沖液中轉(zhuǎn)到有機(jī)介質(zhì)后，酶分子保留原有的pH印記通過調(diào)節(jié)緩沖液pH，對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶催化的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度：有機(jī)介質(zhì)中，酶的催化活性與酶在緩沖液中的離子強(qiáng)度和pH有密切關(guān)系鹽，增加離子強(qiáng)度，可幫助酶維持構(gòu)象。可通過調(diào)節(jié)緩沖液中離子強(qiáng)度的方法對(duì)有機(jī)介質(zhì)中酶催化的離子強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。酶非水相催化的應(yīng)用:酶催化反應(yīng)應(yīng)用脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機(jī)酸合成酯類轉(zhuǎn)酯各種酯類生產(chǎn)聚合二酯的選擇性聚合酰基化甘醇的?；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羥基化膽固醇氧化酶氧化膽固醇測(cè)定醇脫氫酶酯化有機(jī)硅醇的酯化手性藥物的拆分：手性化合物：化學(xué)組成相同，立體結(jié)構(gòu)互為對(duì)映體的兩種異構(gòu)體化合物。一種顯著療效，一種弱或無效；一種顯著療效，一種毒副作用；兩者藥效相反；或具有不同的藥效；或具有互補(bǔ)性手性藥物的合成與生產(chǎn)中，除通過不對(duì)稱合成的方法得到光學(xué)純的手性化合物外，一般得到的由等量的對(duì)應(yīng)異構(gòu)體分子組成的外消旋體。非生物法拆分：利用機(jī)械分離法、色譜分離法、動(dòng)力學(xué)拆分等生物法：2個(gè)對(duì)映體競(jìng)爭(zhēng)的酶同一活性中性位置，兩者反應(yīng)速度不同，產(chǎn)生選擇性而分開第八章酶的定向化一、 酶分子定向進(jìn)化：簡(jiǎn)稱酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變+自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。二、 酶定向進(jìn)化過程：1.從細(xì)胞內(nèi)提取或者通過PCR等方法獲得目標(biāo)分子的基因 2.在體外采用易錯(cuò)PCRDNA重組、基因家族重排等技術(shù)進(jìn)行人工突變，以獲得豐富多樣的突變基因。3.構(gòu)建突變基因文庫(kù)4.高通量篩選定向選擇。酶基因隨機(jī)突變[ 反復(fù)進(jìn)行構(gòu)建突變基因文庫(kù)1篩選負(fù)突變基因-k正突變基因進(jìn)化酶三、酶定向進(jìn)化的原理及特點(diǎn) ：特點(diǎn)：適應(yīng)面廣：酶定向進(jìn)化不需要事先了解酶的結(jié)構(gòu)、催化作用機(jī)制等，可以廣泛應(yīng)用于各種 P酶（蛋白質(zhì)類酶）和酶（核酸類酶）的改性。目的性強(qiáng)：酶定向進(jìn)化是根據(jù)應(yīng)用過程中酶呈現(xiàn)出的催化效率低，穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，經(jīng)過基因體外隨機(jī)突變，人工定向選擇從而獲取所需的進(jìn)化酶，進(jìn)化方向明確，具有很強(qiáng)的目的性。效果顯著：通過酶的定向進(jìn)化，可以在很短的時(shí)間內(nèi)完成自然進(jìn)化漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程，效果顯著。四、 酶基因的隨機(jī)突變產(chǎn)生策略：易錯(cuò)PCR是指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)引入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變過程：1.雙鏈DNA變性2.引物與單鏈DNA退火結(jié)合3.引物延伸具體做法：1?降低一種dNTP的量（降低5%-10%2.加入dITP來代替被減少的dNTP3.緩沖液中另加0.5mmol/LMn2+,提高M(jìn)g+濃度。R特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、隨機(jī)突變豐富，但正突變概率低，突變基因文庫(kù)較大，文庫(kù)篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進(jìn)化?；蛑嘏偶夹g(shù)：又稱DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫(kù)中分離得到的同源DNA用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。過程：1.目的基因片段的準(zhǔn)備2.DNase1（脫氧核糖核酸酶I）酶切3.不加引物的PCR4.加引物的PCR兩條以上正突變基因DNA隨機(jī)片段*酶切酶切突變基因無引物PCR（反復(fù)進(jìn)行）基因重組構(gòu)建突變基因文庫(kù)負(fù)突變基因篩選正突變基因進(jìn)化酶特點(diǎn)：在正突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行，具有正突變概率高、進(jìn)化速度較快的特點(diǎn)，但是在進(jìn)行無引物 PCR獲得全長(zhǎng)突變基因之前，必須將DNaseI去除干凈以免切割突變基因。重排技術(shù)改良：交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)：在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。反復(fù)進(jìn)行，當(dāng) PCR片段大小接近全長(zhǎng)基因時(shí)，分離全長(zhǎng)基因并用基因外引物擴(kuò)增全長(zhǎng)基因特點(diǎn)：可以省去DNA重排技術(shù)中DNaseI切割這個(gè)步驟，具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。隨機(jī)引物體外重組技術(shù)： 以單鏈DNA為模板，配合一套隨機(jī)序列引物，PCR生產(chǎn)大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短 DNA片段，然后除去模板，這些短 DNA片段互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過堿基序列的重新排布而獲取全長(zhǎng)突變基因。特點(diǎn)：DNA小片段是通過隨機(jī)引物引導(dǎo)的 PCR反應(yīng)而產(chǎn)生的，可以用較少的DNA模板獲得較多的DNA小片段，同時(shí)省去DNA重排技術(shù)中DNaseI切割這個(gè)步驟，具有簡(jiǎn)便、快速的特點(diǎn)。基因家族重排：又稱基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用DNaseI切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。過程：（同DNA重排技術(shù)）兩者主要不同點(diǎn)在于基因家族重排是從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行 DNA序列重排，DNA重排技術(shù)是采用易錯(cuò)PCR等技術(shù)所獲取的兩個(gè)以上的這個(gè)突變基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列重排。特點(diǎn)：排除了不必要的突變，大大加快了基因體外進(jìn)化的速度。基因間同源性較高，形成雜合體的頻率較低。五、酶突變基因的定向選擇的基本過程：篩選目的基因通過DNA重組技術(shù)將隨機(jī)突變獲得的各種突變基因與適宜的載體進(jìn)行重組，獲得重組載體。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化等方法將重組載體轉(zhuǎn)入適宜的細(xì)胞或進(jìn)行體外包裝成為有感染活性的重組 入噬菌體，形成突變基因文庫(kù)采用各種高通量篩選技術(shù)，在人工控制的特定環(huán)境中對(duì)突變基因進(jìn)行篩選，得到目的基因。六、 構(gòu)建基因文庫(kù)的過程過程主要包括：載體的選擇、基因重組、形成基因文庫(kù)等載體的選擇：根據(jù)目的基因的特性、載體的特點(diǎn)與重組 DNA的篩選方法等選擇適宜的載體，常用載體有：質(zhì)粒載體、噬菌體 DNA載體、黏粒載體、嗜菌粒載體等。基因重組：在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體DNA連接在一起形成重組DNA根據(jù)目的基因片段的末端性質(zhì)和載體DNA外源DNA分子上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的性質(zhì)， 可選用黏性末端連接、平頭末端連接和修飾末端連接。 （黏性末端連接比平頭末端連接效率高，修飾末端連接方式用于載體DNA和外源DNA末端不匹配時(shí)。）組裝突變基因文庫(kù)將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體。七、 理想基因文庫(kù)的質(zhì)量要求：文庫(kù)的包容性：文庫(kù)中包含的DNA分子是否能完整的反映出源基因的全部可能的變化和改變，包括正突變、負(fù)突變和中性突變，以便進(jìn)行全面的篩選。這就要求構(gòu)建的文庫(kù)必須有足夠大的容量，通常具有 106或更大的容量。文庫(kù)的完整性：文庫(kù)中包含的DNA片段必須盡可能完整的反映基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，以便通過篩選得到的突變基因能夠通過表達(dá)獲取完整的具有催化功能的進(jìn)化酶。八、常用的高通量篩選方法及各自的特點(diǎn):篩選方法篩選依據(jù)特點(diǎn)平板篩選法依據(jù)細(xì)胞在平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況、顏色變化、透明圈情況等進(jìn)行篩選通量大、效率咼、簡(jiǎn)便、快速、直觀、容易控制和調(diào)整環(huán)境條件熒光篩選法依據(jù)是否產(chǎn)生熒光、熒光的強(qiáng)度情況等進(jìn)行篩選誦量大、效率咼、直觀、明確、容易判斷、需要克隆報(bào)告基因噬菌體表面展示法依據(jù)噬菌體外膜結(jié)構(gòu)蛋白與外源蛋白形成的融合蛋白在噬菌體表面的展示情況進(jìn)行師選通量大、效率高、有效基因通過展示進(jìn)行富集、需要構(gòu)建外源基因與噬菌體外膜蛋白基因的融合基因酵母細(xì)胞表面展示法依據(jù)凝集素蛋白與外源蛋白形成的融合蛋白在酵母細(xì)胞表面的展示情況進(jìn)行篩選通量大、效率高、有效基因通過細(xì)胞表面展示進(jìn)行富集、需要構(gòu)建靶蛋白基因與外源蛋白基因的融合基因九、酶定向進(jìn)化的應(yīng)用：定向進(jìn)化技術(shù)在酶的改性方面，主要應(yīng)用于提高酶的催化效率、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性、改變酶的底物特異性等方面。第九章酶反應(yīng)器一，酶反應(yīng)器：用于酶或固定化酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備稱為酶反應(yīng)器。酶反應(yīng)器是用于完成酶促反應(yīng)的核心裝置。它為酶催化反應(yīng)提供 合適的場(chǎng)所和最佳的反應(yīng)條件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。它處于酶催化應(yīng)過程的中心地位，是連接原料和產(chǎn)物的橋梁。二、酶反應(yīng)器的類型：按結(jié)構(gòu)區(qū)分：攪拌罐式反應(yīng)器、 鼓泡式反應(yīng)器、填充床式反應(yīng)器 、流化床式反應(yīng)器、膜反應(yīng)器按操作方式區(qū)分分批式反應(yīng) 2.連續(xù)式反應(yīng)3.流加分批式反應(yīng)混合形式連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器分批攪拌罐反應(yīng)器反應(yīng)器類型適合的操作方式適用的酶特點(diǎn)攪拌罐式反應(yīng)器分批式，流加分批式連續(xù)式，游離酶固定化酶反應(yīng)比較完全，反應(yīng)條件容易調(diào)節(jié)控制。填充床式反應(yīng)器連續(xù)式固定化酶密度大，可以提高酶催化反應(yīng)的速度。在工業(yè)生產(chǎn)中普遍使用。流化床反應(yīng)器分批式流加分批式連續(xù)式固定化酶流化床反應(yīng)器具有混合均勻，傳質(zhì)和傳熱效果好，溫度和pH值的調(diào)節(jié)控制比較容易，不易堵塞，對(duì)粘度較大反應(yīng)液也可進(jìn)行催化反應(yīng)。鼓泡式反應(yīng)器分批式流加分批式連續(xù)式游離酶固定化酶鼓泡式反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作容易，剪切力小，混合效果好，傳質(zhì)、傳熱效率咼，適合于有氣體參與的反應(yīng)。膜反應(yīng)器連續(xù)式游離酶固定化酶清洗比較困難噴射式反應(yīng)器連續(xù)式游離酶通入高壓噴射蒸汽，實(shí)現(xiàn)酶與底物的混合，進(jìn)行高溫短時(shí)催化反應(yīng)，適用于某些耐高溫酶的反應(yīng)酶反應(yīng)器的選擇依據(jù)： 罐反應(yīng)器STR攪拌罐式反應(yīng)器 BCR:鼓泡式反應(yīng)器PCR:填充BSTR分批攪拌罐反應(yīng)器床式反應(yīng)器 1.酶的應(yīng)用形式（游離酶固定化酶）及例子FBR流化床式反應(yīng)器MR:膜反應(yīng)器CSTR:連續(xù)攪拌 游離酶：回收困難，除了BSTR